海南地區(qū)漢、黎民族父源性HLA-G 基因14 bp 缺失多態(tài)性及與重度PE 的關(guān)系

黃麗莉 夏可輝 唐 榮 鄭林媚 （?？谑袐D幼保健院產(chǎn)科，?？?70203）

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有疾病，全球發(fā)病率為5%~7%，每年導(dǎo)致全世界7 萬(wàn)多例孕產(chǎn)婦和50萬(wàn)例胎兒死亡［1］。重度PE作為PE嚴(yán)重階段，伴有至少1種嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅孕婦和胎兒健康，是產(chǎn)科ICU中38%孕產(chǎn)婦死亡原因，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明［2］。目前免疫調(diào)節(jié)和遺傳易感性機(jī)制在國(guó)內(nèi)外備受關(guān)注，認(rèn)為PE是一種母胎間免疫失衡疾病，攜帶父源性基因的胎兒視為同種半異體移植物被母體排斥，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生［3］。

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）基因是人類基因組中最具多態(tài)性的位點(diǎn)，在各類人群和民族中均有廣泛研究。人類MHC 又稱為人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte anti‐gen，HLA），其編碼分子表達(dá)于白細(xì)胞，主要功能是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及選擇適當(dāng)T細(xì)胞庫(kù)。過(guò)去幾十年人群研究已確定HLA 與多種人類疾病相關(guān)，在攜帶特定HLA 等位基因（包括炎癥、自身免疫性疾病和惡性腫瘤）個(gè)體中更為常見(jiàn)。因此，HLA基因和蛋白研究已成為人類學(xué)、移植和疾病相關(guān)性研究重要工具，HLA-疾病關(guān)聯(lián)的潛在機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。

HLA-G 作為非經(jīng)典HLAⅠb 類分子，由絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞特異性表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，抑制蛻膜NK細(xì)胞功能，維持母胎間免疫平衡［4］。已有報(bào)道提示 HLA-G 基因多態(tài)性與 PE 發(fā)病相關(guān)［5］。最近研究表明，HLA-G 基因外顯子8 3'-UTR 14 bp 缺失/插入多態(tài)性影響HLA-G 轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致HLA-G 蛋白表達(dá)異常或下降，增加PE 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［6］。母體和胎兒遺傳因素均影響PE 發(fā)病率，且一半胎兒基因來(lái)自父親，因此父源性基因在PE 發(fā)病中起重要作用［7］。張展等［8］研究顯示，父源性HLA基因14 bp缺失多態(tài)性可能與早發(fā)型重度PE 發(fā)病相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外不同民族PE 間父兒HLA-G 14 bp 多態(tài)性比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)檢測(cè)海南地區(qū)漢、黎族重度PE患者父、兒HLA-G 基因14 bp 多態(tài)性，并聯(lián)合父、兒基因型配伍分析，探討在海南地區(qū)HLA-G 基因14 bp 插入/缺失多態(tài)性是否為漢、黎族的PE 易患基因，進(jìn)一步從免疫遺傳學(xué)角度探討漢、黎民族PE發(fā)病的遺傳學(xué)特征，以及是否存在種族差異。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選擇2017年1月至2019年10月我院和海南省人民醫(yī)院分娩的產(chǎn)婦，選取正常妊娠者漢族父、兒100 對(duì)，黎族父、兒80 對(duì)為對(duì)照組。同期確診為重度PE 的患者漢族父、兒84 對(duì)，黎族父、兒74對(duì)為病例組。重度PE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》［9］。分別無(wú)菌抽取父親外周血和臍靜脈血各2 ml置于EDTA抗凝管，-20℃凍存待檢。所有研究對(duì)象（漢、黎族患者）要求三代居住海南地區(qū)，無(wú)異族通婚史、無(wú)血緣關(guān)系及PE 家族史。4 組均為自然受孕、單胎妊娠、剖宮產(chǎn)分娩、初產(chǎn)婦，并排除其他產(chǎn)科并發(fā)癥及內(nèi)外科并發(fā)癥，所有患者均隨訪至產(chǎn)后12周。所有參與者知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA 提取試劑盒、100 bp DNA Ladder（北京天根公司）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取及濃度和純度測(cè)定 取冰凍全血室溫解凍，采用DNA 提取試劑盒提取樣本DNA，紫外分光光度法測(cè)定DNA 濃度和純度。DNA濃度調(diào)整至100 ng/μl，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HLA-G 基因擴(kuò)增和電泳 采用PCR 對(duì)HLA-G 基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物參照文獻(xiàn)［10］，引物序列 ：F：5'-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3'；R：5'-GGAAGGAATGCAGTTCAGCTGA-3'，由 上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 總反應(yīng)體積為 25 μl：12.5 μl Taq PCR Master Mix（2×），2 μl HLA-G 引 物（5 μmo/lL）、1 μl DNA、9.5 μl dH2O。PCR 擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，64℃ 1 min，72℃ 2 min，共 35 個(gè)循環(huán)，72℃ 終末延伸10 min。取5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V，45 min），溴化乙錠染色20 min，Gel logic 2000圖像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 HLA-G 14 bp 缺失插入多態(tài)性分型 PCR產(chǎn)物包括14 bp 插入/缺失雜合子（+14 bp/-14 bp）、14 bp 缺失純合子（-14 bp/-14 bp）、14 bp 插入純合子（+14 bp/+14 bp），采用 100 bp DNA Ladder 作為DNA Marker。選取缺失純合子和插入純合子PCR原液，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測(cè)序，采用GenBank Blast比較測(cè)序結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用卡方檢驗(yàn)測(cè)定各組HLA-G 基因型頻率及基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，4 組（漢族正常妊娠組、漢族重度PE 組、黎族正常妊娠組、黎族重度PE 組）父親和新生兒HLA-G 等位基因和基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性。采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組HLA-G 等位基因和基因型頻率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢、黎族父代和子代第8 外顯子14 bp 多態(tài)性等位基因頻率、基因型頻率比較 漢族父代正常對(duì)照組與黎族父代正常對(duì)照組、漢族子代正常對(duì)照組與黎族子代正常對(duì)照組HLA-G 14 bp 等位基因和基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1、2）。

表1 父代漢、黎族正常妊娠組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.1 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers of Han and Li in control group（%）

2.2 父代HLA-G 基因第8 外顯子14 bp 多態(tài)性等位基因頻率、基因型頻率比較 漢族父代重度PE組等位基因+14 bp 頻率為52.4%（88/168），-14 bp為47.6%（80/168），正常妊娠組分別為49%（98/200）、51%（102/200），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.418，P=0.518）；兩組間基因型頻率差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表3）。黎族重度PE 組和正常妊娠組父親HLA-G 14 bp 缺失等位基因分布雖無(wú)顯著差異，但有差異性趨勢(shì)（P=0.060），兩組父親基因型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表4）。

表3 漢族父代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.3 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers Han in control group and severe PE group（%）

表4 黎族父代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.4 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers Li in control group and severe PE group（%）

2.3 子代HLA-G 基因第8 外顯子14 bp 多態(tài)性等位基因與基因型頻率比較 漢族子代重度PE 組等位基因+14 bp 頻率為51.2%（86/168），-14 bp 為48.8%（82/168），正常妊娠組分別為46%（92/200）、54%（108/200），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.985，P=0.321）；兩組間基因型頻率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表5）。黎族重度PE 組新生兒HLA-G-14 bp 頻率為37.8%，明顯低于正常妊娠組的 55%（χ2=9.096，P=0.003），且重度 PE 組新生兒-14 bp/-14 bp 基因型頻率為18.9%，顯著低于正常妊娠組的43.8%（χ2=10.926，P=0.001，表6）。

表2 子代漢、黎族正常妊娠組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.2 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fetuses of Han and Li in control group（%）

表5 漢族子代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.5 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14bp of fetuses of Han in control group and severe PE group（%）

表6 黎族子代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.6 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fetuses of Li in control group and severe PE group（%）

2.4 漢族和黎族父、子HLA-G第8外顯子14 bp多態(tài)性基因型配伍頻率比較 漢族重度PE組父、子均為缺失純合子（-14 bp/-14 bp）的基因型配伍頻率，與正常妊娠組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表7）。黎族重度PE組父、子均為缺失純合子（-14 bp/-14 bp）的基因型配伍，頻率為21.1%（4/19），顯著低于正常妊娠組的65.5%（19/29），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。漢族和黎族其他基因型配伍頻率在正常妊娠組和重度PE組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表8）。

表7 漢族正常妊娠組和重度PE 組父、兒HLA-G 基因型配伍頻率［例（%）］Tab.7 HLA-G genotypes frequencies of HLA-G of fa?thers and fetuses of Han in control group and se?vere PE group［n（%）］

表8 黎族正常妊娠組和重度PE 組父、兒HLA-G 基因型配伍頻率［例（%）］Tab.8 HLA-G genotypes frequencies of HLA-G of fa?thers and fetuses of Li in control group and severe PE［n（%）］

3 討論

妊娠是一種成功的同種半異體移植過(guò)程，胎兒雖攜帶一半與母體基因無(wú)關(guān)的父源性基因，卻不被母體排斥，母胎免疫耐受是天然同種異體免疫耐受現(xiàn)象［11］。HLA-G 屬于介導(dǎo)母胎間免疫抑制的非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子，參與抑制子宮和外周血NK 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞毒活性，CD4+T 細(xì)胞的同種異體增生反應(yīng)抑制樹突狀細(xì)胞成熟和激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。除免疫抑制活性外，HLA-G 還參與絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞浸入母體子宮蛻膜過(guò)程，確保胎盤正常發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，PE 患者HLA-G 表達(dá)異常下降，推測(cè)HLA-G 與其發(fā)病相關(guān)［12］。進(jìn)一步研究表明，含有14 bp DNA 序列的HLA-G 等位基因與胎盤HLA-G mRNA 低表達(dá)有關(guān)，且這一多態(tài)性與PE 發(fā)生有關(guān)［13］。研究尚未證實(shí)母親 HLA-G 14 bp 多態(tài)性與PE 相關(guān)，因此，分析 HLA-G 基因 14 bp 多態(tài)性與 PE是否相關(guān)，僅從母親角度出發(fā)可能存在一定局限性。一組瑞典孕婦分析表明，13%病例中，父親遺傳因素增加PE的患病風(fēng)險(xiǎn)，可能與母親遺傳因素相互作用有關(guān)［14］。李紅等［15］認(rèn)為不同母/兒 HLA-G 14 bp 多態(tài)性基因型配伍影響母體對(duì)同種異體胎兒的接受程度，且胎兒HLA-G-14 bp 與早發(fā)型重度PE風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，初次妊娠、工具避孕或人工授精后妊娠者發(fā)生PE 的風(fēng)險(xiǎn)增加［16］。OLAYEMI 等［17］觀察到孕前性生活時(shí)間短也增加PE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，反之延長(zhǎng)母體對(duì)精子的暴露時(shí)間和頻率可明顯降低PE發(fā)病率，以上現(xiàn)象原因可能為母體未能適應(yīng)胎兒所攜帶的父方抗原所致，推測(cè)父本遺傳物質(zhì)在子癇前期發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，父親HLA+14 bp/-14 bp 可增加PE 風(fēng)險(xiǎn)。沈彥婷等［18］通過(guò)對(duì)母親、父親及胎兒 HLA-G14 bp 多態(tài)性與PE 的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)父（+14 bp/+14 bp）/兒（+14 bp/+14 bp）是子癇前期的危險(xiǎn)因素。國(guó)外學(xué)者HYLENIUS等［19］研究發(fā)現(xiàn)，重度PE初產(chǎn)婦的胎兒優(yōu)先遺傳父親HLA-G+14 bp 等位基因，與PE 易感性相關(guān)。但也有研究比較正常妊娠組和PE 組新生兒HLA-G 14 bp 多態(tài)性等位基因和基因型頻率，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［20］。分析結(jié)果不一致的原因可能是各項(xiàng)研究存在種族差異，對(duì)照組和病例組入選標(biāo)準(zhǔn)參差不齊以及PE 嚴(yán)重程度不一，導(dǎo)致HLA-G 14 bp多態(tài)性研究難以比較。

本研究通過(guò)測(cè)定海南地區(qū)漢、黎族人群父、子HLA-G14 bp 基因型、等位基因，并對(duì)父、子HLA-G 14 bp 基因型進(jìn)行配伍分析，進(jìn)一步闡述其與重度PE的相關(guān)性，以及是否存在種族差異，結(jié)果顯示，漢族正常妊娠組及黎族正常妊娠組父代和子代HLA-G 14 bp的等位基因與基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HLA-G 14 bp 多態(tài)性在正常情況下不存在種族差異。進(jìn)一步研究不同種族間HLA-G 14 bp 多態(tài)性在疾病狀態(tài)下是否存在差異，研究表明，漢族組父、子代HLA-G 14 bp 插入/缺失的等位基因及基因型分布在重度PE 組和正常妊娠組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），聯(lián)合父/兒基因型配伍后未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示漢族中該位點(diǎn)對(duì)PE發(fā)病意義較小。黎族重度 PE 組父親 HLA-G 14 bp 頻率和-14 bp/-14 bp 基因型頻率分別為40.5%、25.7%，與正常對(duì)照組（51.2%、32.3%）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均有低于對(duì)照組的趨勢(shì)（P=0.060，P=0.157）。而黎族重度PE組新生兒HLA-G-14 bp 頻率和-14 bp/-14 bp 基因型頻率顯著低于黎族正常對(duì)照組。聯(lián)合父/兒基因型配伍發(fā)現(xiàn)，重度 PE 組父（-14 bp/-14 bp）/兒（-14 bp/-14 bp）基因型配伍頻率顯著低于正常對(duì)照組（P=0.003），提示父兒均為缺失純合子可降低母親患重度PE風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，HLA-G 14 bp 多態(tài)性的類型、發(fā)生頻率及父兒基因型配伍頻率等在不同地域人群中呈種群差異性分布。漢族HLA-G基因14 bp 缺失多態(tài)性與重度PE 無(wú)相關(guān)性。黎族父兒均為缺失純合子可降低母親患重度PE的風(fēng)險(xiǎn)，推測(cè)黎族父（-14 bp/-14 bp）/兒（-14 bp/-14 bp）基因型可能與重度PE易感性相關(guān)。