單采自體紅細(xì)胞前后患者WBC參數(shù)和T/B/NK淋巴細(xì)胞水平的觀察①

汪 沁 陶雨琦 賀 玲 余嵐靜子 唐宗生 （皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科，蕪湖241000）

近年來(lái)，隨著血液保存技術(shù)、血液成分分離技術(shù)和輸血醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，以及臨床需求的不斷增加，自體輸血技術(shù)得到了廣泛的擴(kuò)展和創(chuàng)新［1］。單采自體紅細(xì)胞是一種術(shù)前采集患者紅細(xì)胞，待手術(shù)期間或術(shù)后需要時(shí)再回輸給患者本人的新型自體輸血技術(shù)，屬于貯存式自體輸血。該技術(shù)與傳統(tǒng)的自體全血貯存相比，除了可以避免異體血輸注帶來(lái)的諸多風(fēng)險(xiǎn)，還具有采集容量小，對(duì)機(jī)體生理影響小，不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)［2］。目前，單采自體紅細(xì)胞技術(shù)對(duì)患者血液學(xué)參數(shù)（如Hb、RBC、Hct）的影響已被廣泛研究［3-4］，但尚不清楚單采自體紅細(xì)胞引起RBC、Hb和Hct降低的同時(shí)，是否也會(huì)引起機(jī)體免疫細(xì)胞的變化，而可能影響一些短期風(fēng)險(xiǎn)，如：術(shù)后易發(fā)感染、創(chuàng)面難以愈合或其他并發(fā)癥。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)患者單采自體紅細(xì)胞前后WBC計(jì)數(shù)、分類比值和T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群水平的變化，從免疫學(xué)角度對(duì)單采自體紅細(xì)胞采集效果和運(yùn)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選擇 2020 年 6 月至 2020 年 7 月弋磯山醫(yī)院術(shù)前單采自體紅細(xì)胞的擇期手術(shù)患者26 例，均為一次采集自體紅細(xì)胞200~300 ml。研究對(duì)象均簽署血液成分單采知情同意書，其中男15 例，女 11 例，年齡 37~77 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合術(shù)前自體儲(chǔ)血適應(yīng)證且肝腎功能、凝血功能正常，除手術(shù)部位的病變外，身體一般情況良好，Hb≥110 g/L，Hct≥33%，體重>45 kg。排除標(biāo)準(zhǔn)：Hb<100 g/L 或Hct<28%或骨髓造血功能抑制；嚴(yán)重心血管疾病或嚴(yán)重心功能不全；服用抗生素后發(fā)熱未得到有效控制、敗血癥或膿毒血癥的患者；血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)腫瘤；自身免疫性疾病及免疫功能低下患者；1 年內(nèi)接受化療和放療。

1.1.2 儀器與試劑 WBC 計(jì)數(shù)、分類比值采用邁瑞CAL 8000血細(xì)胞分析儀（中國(guó)）進(jìn)行測(cè)定；單采患者自體紅細(xì)胞使用Fresenius Kabi COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)（德國(guó)）；淋巴細(xì)胞亞群采用Beckman Coulter FC500 MPL 流式細(xì)胞儀（美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)；T 細(xì)胞亞群標(biāo)記抗體（CD45-FITC/CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD）、B 細(xì)胞標(biāo)記抗體（CD3-FITC/CD19-PE）、NK細(xì)胞標(biāo)記抗體（CD3-FITC/CD16+56-PE）和紅細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自中國(guó)Absin生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 抽取擇期手術(shù)患者單采自體紅細(xì)胞前后用EDTA-K2 抗凝的全血標(biāo)本各2 ml，進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。流式檢測(cè)：分別將T 細(xì)胞亞群、B 細(xì)胞及NK細(xì)胞標(biāo)記抗體各2 μl 加入做好標(biāo)記的流式管管底，取10 μl 已充分混勻的EDTA 抗凝全血加入試管底部，渦旋混勻，避光靜置孵育20 min；加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，渦旋輕輕振蕩5 s，避光靜置孵育20 min 后，1 500/rmin 離心 5 min，去上清，加 500 μl PBS 洗滌，1 500/rmin 離心 5 min，去上清，最后加500 μl PBS，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Flowjo（10.0）流式軟件用作分析流式細(xì)胞儀采集的數(shù)據(jù)；本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，計(jì)量資料以表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)單采前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)單采前后比較采用Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)，指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前單采自體紅細(xì)胞患者的一般特征 本研究共納入26例術(shù)前行單采自體紅細(xì)胞的患者，其中男 15 例（57.7%），女 11 例（42.3%），平均年齡（57.4±10.0）歲，平均身高（164.8±6.0）cm，平均體重（58.6±7.5）kg，平均BMI（21.8±2.1），平均收縮壓（130±21）mmHg，平均舒張壓（76±11）mmHg，平均心率（77±12）次/min，平均呼吸頻率（18±4）次/min，平均總血容量（3 967.8±520.8）ml，平均紅細(xì)胞采集量（223.0±43.0）ml，平均采集時(shí)間（11.2±2.3）min。

2.2 擇期手術(shù)患者單采自體紅細(xì)胞前與后WBC計(jì)數(shù)及分類比較 如圖1A~C 所示，單采前與后中性粒細(xì)胞百分率、淋巴細(xì)胞的百分率和NLR 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與單采前相比，單采自體紅細(xì)胞后患者的WBC、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量均下降（P<0.01），24 例 WBC 下降后的值在正常范圍內(nèi)，2例低于正常值下限，分別見圖1D~F。

圖1 單采自體紅細(xì)胞前后患者的WBC計(jì)數(shù)和分類比較Fig.1 Comparison of WBC count and classification of patients before and after apheresis autologous RBCs

2.3 WBC 倍數(shù)改變與BMI、血容量以及單采前WBC 的相關(guān)性分析 WBC 的倍數(shù)改變和BMI、血容量、單采前WBC 無(wú)相關(guān)性（r=-0.113 0，P=0.582 6；r=0.118 7，P=0.603 3；r=0.006 5，P=0.974 7），分別見圖2A~C。

圖2 WBC 倍數(shù)改變與BMI、血容量以及單采前WBC 的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between change of WBC multiple and BMI，blood volume and WBC before apheresis autologous RBCs

2.4 擇期手術(shù)患者單采自體紅細(xì)胞前與后T/B/NK 淋巴細(xì)胞水平比較 圖3A~C 分別為經(jīng)免疫熒光標(biāo)記的T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群的流式圖。本研究對(duì)26 例擇期手術(shù)患者單采自體紅細(xì)胞前與后體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群百分率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示與單采前相比，單采自體紅細(xì)胞后總T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞以及NK 細(xì)胞的百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），CD4+/CD8+差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)免疫熒光標(biāo)記的T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群Fig.3 Detection of immunofluorescence labeled T/B/NK lymphocyte subsets by flow cytometry

圖4 單采自體紅細(xì)胞前后T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群水平的比較Fig.4 Comparison of T/B/NK lymphocyte subsets in peripheral blood before and after apheresis autolo?gous RBCs

3 討論

貯存式自體輸血有關(guān)紅細(xì)胞的采集有兩種基本形式：采集全血和運(yùn)用血細(xì)胞分離機(jī)術(shù)前單采自體紅細(xì)胞［5］。我院輸血科于2020年5月開展了運(yùn)用血細(xì)胞分離機(jī)單采自體紅細(xì)胞的新技術(shù)。該技術(shù)可以應(yīng)用于稀有血型手術(shù)患者，解決了稀有血型用血困難這一難題［6］。該技術(shù)還可以應(yīng)用于90%擇期大手術(shù)，陳冠伊等［7-9］將該技術(shù)應(yīng)用于特發(fā)性脊柱側(cè)彎矯正術(shù)、髖臼周圍截骨術(shù)、神經(jīng)纖維瘤手術(shù)等缺少有效止血方法的特大手術(shù)中，實(shí)現(xiàn)了自體輸血，不輸異體血，大幅度減少對(duì)異體血液的依賴。

目前，關(guān)于單采自體紅細(xì)胞技術(shù)對(duì)患者血液學(xué)參數(shù)（如Hb、RBC、Hct）的影響已經(jīng)得到廣泛研究，但此項(xiàng)技術(shù)對(duì)白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞亞群的影響的研究相對(duì)較少。眾所周知，血液除負(fù)責(zé)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸外，血液中還有為機(jī)體提供保護(hù)、抵抗病原微生物和保持身體健康的免疫細(xì)胞。WBC 是免疫防御系統(tǒng)細(xì)胞，在炎癥過(guò)程中起著重要作用［10］。在免疫系統(tǒng)的活動(dòng)中，由不同類別或亞群的淋巴細(xì)胞，即T、B 和NK 細(xì)胞發(fā)揮重要的免疫防御作用。T、B 和NK 細(xì)胞及其亞群常以其細(xì)胞表面標(biāo)記物加以區(qū)分，即：CD3+T細(xì)胞（總體T細(xì)胞）、CD3+CD4+T細(xì)胞（輔助T 細(xì)胞）、CD3+CD8+T 細(xì)胞（細(xì)胞毒性T 細(xì)胞）、CD3-CD16+/CD56+淋巴細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞）和CD3-CD19+淋巴細(xì)胞（B 細(xì)胞）。亞群之間的平衡具有重要的研究意義，其平衡失調(diào)將導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂［11］。

本研究立足于臨床實(shí)際，從免疫學(xué)角度對(duì)單采自體紅細(xì)胞臨床運(yùn)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)26例擇期手術(shù)患者單采自體紅細(xì)胞前與后的WBC計(jì)數(shù)、分類進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單采自體紅細(xì)胞后WBC數(shù)量降低（P<0.01）。由此推測(cè)在紅細(xì)胞單采的過(guò)程中，因?yàn)榘准?xì)胞層離紅細(xì)胞層很近，會(huì)有少量白細(xì)胞被帶出，混入紅細(xì)胞，而引發(fā)機(jī)體白細(xì)胞數(shù)量的降低，雖然白細(xì)胞數(shù)量有所降低，但是有24例都在正常值范圍內(nèi)（圖1），有2 例低于正常下限。目前《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》［12］中貯存式自體輸血對(duì)WBC數(shù)值沒有具體要求，但本研究結(jié)果提示有必要對(duì)單采自體紅細(xì)胞前WBC計(jì)數(shù)設(shè)定一個(gè)參考范圍，以確保單采后白細(xì)胞計(jì)數(shù)在正常范圍（4×109~10×109L-1）內(nèi)，從而防止患者的圍手術(shù)期感染。然而，有研究發(fā)現(xiàn)：正常健康人單采外周血單個(gè)核細(xì)胞完成后瞬時(shí)的WBC計(jì)數(shù)下降（P<0.05），但是1 h 后回升明顯，與采前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明健康人機(jī)體WBC代償能力較強(qiáng)，WBC 的數(shù)量可以在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)［13］。但本研究對(duì)象為擇期手術(shù)患者，WBC 的數(shù)量是否可以在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)尚不清楚，后續(xù)還需進(jìn)一步觀察。

NLR是一個(gè)簡(jiǎn)單的參數(shù)，與外周血WBC的改變有關(guān)，反映中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之間的平衡，可以很容易地評(píng)估一個(gè)受試者的炎癥狀態(tài)［14］。本研究結(jié)果顯示單采前與后中性粒細(xì)胞百分率、淋巴細(xì)胞百分率和NLR 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示單采自體紅細(xì)胞后沒有打破中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的免疫平衡狀態(tài)。

本研究對(duì)WBC 倍數(shù)改變與BMI、血容量以及采前WBC 進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)WBC 倍數(shù)改變與BMI、血容量以及采前WBC 無(wú)相關(guān)性，結(jié)果說(shuō)明身高體重的綜合指數(shù)，血容量以及采前的WBC數(shù)值與WBC 變動(dòng)幅度沒有實(shí)質(zhì)關(guān)系。由此提示，對(duì)于身材瘦小的患者以及采前WBC數(shù)值較低的患者來(lái)說(shuō)，單采自體紅細(xì)胞不會(huì)引起其WBC的明顯缺失。

此外，本研究應(yīng)用流式檢測(cè)了26例擇期手術(shù)患者單采自體紅細(xì)胞前和后血液中T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群水平的變化，結(jié)果顯示單采前與后總T 細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，B細(xì)胞以及NK 細(xì)胞的百分率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），CD4+/CD8+差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究結(jié)果提示單采自體紅細(xì)胞的臨床運(yùn)用沒有對(duì)患者機(jī)體造成即刻的免疫影響。這與獻(xiàn)全血后淋巴細(xì)胞亞群的變化不同，在一項(xiàng)關(guān)于健康受試者捐獻(xiàn)500 ml 全血后淋巴細(xì)胞亞群變化的研究中發(fā)現(xiàn)總血容量的減少可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群的失衡，結(jié)果顯示CD4+細(xì)胞百分率降低，而CD8+細(xì)胞百分率顯著增加，導(dǎo)致CD4+/CD8+降低［15］。由此推測(cè)采集全血血容量降低幅度較大，可能會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群的失衡，但單采自體紅細(xì)胞血容量降低幅度較小，不會(huì)即刻引起T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群在血液中的所占的百分率的明顯變化。

本次研究通過(guò)對(duì)單采自體紅細(xì)胞前后患者WBC 參數(shù)和T/B/NK 淋巴細(xì)胞水平的觀察，探討單采自體紅細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)可能造成的影響。本研究表明，盡管單采自體紅細(xì)胞導(dǎo)致WBC、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的下降，但是有24 例都在正常值范圍內(nèi)，且其在血液中的所占的百分率沒有明顯變化，即細(xì)胞間的免疫平衡維持原有狀態(tài)。因此，從免疫學(xué)角度來(lái)說(shuō)，單采自體紅細(xì)胞的臨床運(yùn)用對(duì)患者機(jī)體造成即刻的免疫影響較小。然而，本研究時(shí)間由于客觀條件所限，如標(biāo)本量小、時(shí)間跨度較短，需要在后期的研究中進(jìn)一步加強(qiáng)和完善?？傊捎诿庖呦到y(tǒng)十分復(fù)雜，免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)是長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)調(diào)整過(guò)程，單采自體紅細(xì)胞的臨床運(yùn)用到底對(duì)免疫系統(tǒng)有什么樣的影響需要將更多的免疫細(xì)胞、免疫分子納入研究中，且盡可能對(duì)采集后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行追蹤觀察。