Siglec-15 在唑來膦酸特異性γδ T 細(xì)胞活化、增殖及效應(yīng)分子分泌中的作用①

游紅琴 王小昆 徐本玲 李鐵鵬 秦 鵬 劉 雪 張夢(mèng)雨 王 瑤 陳廣玉 高全立

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州450008）

γδ T 細(xì)胞占外周血CD3+T 細(xì)胞的 5%~10%，可被磷酸抗原迅速活化，表達(dá)分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）69 和 CD25，通過分泌顆粒酶、穿孔素及IFN-γ發(fā)揮抗腫瘤作用［1-2］。在體外經(jīng)磷酸小分子抗原擴(kuò)增的γδ T 細(xì)胞被廣泛用于腫瘤患者的過繼治療［3］。唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素-15（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15，Siglec-15）是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素家族成員，最近的研究發(fā)現(xiàn)，Siglec-15 可通過抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖及IFN-γ的分泌，直接抑制特異性T 細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答［4］。但 Siglec-15 對(duì)抗原特異性γδ T 細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道，本研究旨在明確Siglec-15 對(duì)γδ T 細(xì)胞活化、增殖和分泌效應(yīng)分子的影響，以期為γδ T細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌血液標(biāo)本為2019年12月至2020年4月河南省腫瘤醫(yī)院免疫治療科GMP實(shí)驗(yàn)室的臨床檢測(cè)標(biāo)本，其中男性6例，女性7例。唑來膦酸（zole‐dronic acid，ZOL）購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)；IL-2 購自山東泉港藥業(yè)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE公 司 ；流 式 抗 體 BV510-TCRγδ、FITC-CD3、PECD69、APC-CD3、APC-CD25、PE-顆粒酶 B 和 APCIFN-γ 及同型對(duì)照抗體購自美國Biolegend 公司；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluoresce‐in diacetate succinimidyl ester，CFSE）購自美國Ther‐mo Fisher 公司；Fortessa 流式細(xì)胞分析儀和FlowJo V10流式分析軟件購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 γδ T 細(xì)胞的體外培養(yǎng) 空腹抽取外周靜脈血 3 ml 于 EDTA 采血管，離心 10 min（2 000/r min，離心半徑10 cm），取離心后的自體血漿備用。全血細(xì)胞經(jīng)生理鹽水1∶1稀釋后使用淋巴細(xì)胞分離液離心20 min（2 000/r min，離心半徑10 cm）吸取白膜層。用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心10 min（1 500/r min，離心半徑10 cm）去除血小板。再次以無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心8 min（1 200/r min，離心半徑10 cm）獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。用含3%自體血漿的 X-VIVO 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個(gè)/ml，分別添加 ZOL（濃度為 1 μmo/l L）和 IL-2（濃度為400 U/ml），將細(xì)胞懸液移入48孔板（1 m/l 孔），根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在培養(yǎng)體系中加或不加Siglec-15（5 μg/ml）重組蛋白。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行補(bǔ)液和傳代。

1.2.2 γδ T 細(xì)胞活化相關(guān)分子的流式檢測(cè) 分別取培養(yǎng)前及培養(yǎng)第2 和4 天的γδ T 細(xì)胞懸液，離心5 min（1 500/r min，離心半徑10 cm）后，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，每管200 μl，分別加入FITCCD3、BV510-TCRγδ、PE-CD69 和 APC-CD25 抗體各2 μl，混勻，4℃ 避光孵育 20 min，孵育畢，使用 PBS洗滌1 次，重懸于500 μl PBS 中，進(jìn)行活化相關(guān)分子表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.2.3 CFSE 法檢測(cè)γδ T 細(xì)胞的增殖 將培養(yǎng)至第10 天的γδ T 細(xì)胞（比例≥90%）靜息培養(yǎng)（無IL-2培養(yǎng)）48 h。收集細(xì)胞，PBS 洗滌 2 次，用5 μmo/l L的CFSE 工作液重懸細(xì)胞，于室溫避光孵育20 min，用5倍體積的冷完全培養(yǎng)基終止染色10 min，離心洗滌2次后，以適量的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入48孔板（1 m/l 孔），分別添加ZOL（1 μmo/l L）和IL-2（400 U/ml），根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模谂囵B(yǎng)體系中加或不加Siglec-15（5 μg/ml）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)終點(diǎn)收集細(xì)胞，以APCCD3 和BV510-TCRγδ 抗體進(jìn)行表面流式染色，將細(xì)胞重懸于 500 μl PBS 中進(jìn)行 γδ T 細(xì)胞增殖的流式檢測(cè)。

1.2.4 胞內(nèi)流式分析γδ T 細(xì)胞分泌的效應(yīng)分子 收集靜息培養(yǎng)48 h的γδ T細(xì)胞，PBS洗滌后，將細(xì)胞懸液移入 48 孔板（1 m/l 孔），分別添加 ZOL（1 μmo/l L）和IL-2（400 U/ml），根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模谂囵B(yǎng)體系中加或不加Siglec-15（5 μg/ml）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，加入布雷菲德菌素A（brefeldin，BFA）阻斷，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。收集上述不同培養(yǎng)條件的細(xì)胞，PBS 洗滌1 次，按照流式表面染色方法進(jìn)行FITC-CD3，BV510-TCRγδ 的表面染色。PBS 洗滌1 次，固定細(xì)胞，室溫避光孵育30 min。加入破膜液洗滌2 次，以破膜液重懸細(xì)胞，加入PE-顆粒酶 B 抗體，APC-IFN-γ 及同型對(duì)照抗體，4℃ 避光孵育30 min。破膜液洗滌2 次后，將細(xì)胞重懸于500 μl PBS中上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，服從正態(tài)分布，組間比較采用單因素t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Siglec-15 蛋白對(duì) ZOL 誘導(dǎo) γδ T 細(xì)胞活化的影響不顯著 以ZOL 聯(lián)合或不聯(lián)合重組Siglec-15 蛋白刺激PBMC，在刺激48 h 和96 h 后分別檢測(cè)表達(dá)活化相關(guān)分子 CD69 和 CD25 的 γδ T 細(xì)胞比例（圖1A）。結(jié)果表明：ZOL 刺激 48 h 后，CD69+γδ T 細(xì)胞的比例由刺激前的（0.159±0.086）%上調(diào)至（85.48±6.605）%，刺激96 h 后，CD69+γδ T 細(xì)胞比例上調(diào)至（95.33±1.424）%，CD25+γδ T細(xì)胞的比例由（0.005±0.004）%升高至48 h 的（50.94±18.678）%和96 h 的（87.53±2.612）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B~E），提示 ZOL 可刺激 PBMC 中的 γδ T 細(xì)胞活化；聯(lián)合 Si‐glec-15 刺激 48 h，CD69+和 CD25+γδ T 細(xì)胞比例分別為（88.64±5.034）%和（62.56±14.951）%，與ZOL 單獨(dú)刺激的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.421，P=0.350）；刺激 96 h 的 CD69+和 CD25+γδ T 細(xì)胞比例分別為（95.80±1.250）%和（87.60±4.329）%，與ZOL單獨(dú)刺激差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.990，P=0.815）（圖1C、E），提示 Siglec-15 對(duì) ZOL 誘導(dǎo)的 γδ T 細(xì)胞活化無顯著影響。

圖1 CD69和CD25在γδ T細(xì)胞的表達(dá)Fig.1 Expression of CD69 and CD25 in γδ T cells

2.2 Siglec-15 不影響 ZOL 特異性 γδ T 細(xì)胞的增殖 收集純度在90%以上的γδ T 細(xì)胞進(jìn)行CFSE 標(biāo)記，并以 ZOL 聯(lián)合或不聯(lián)合 Siglec-15 刺激 γδ T 細(xì)胞，在刺激 72 h 后檢測(cè) γδ T 細(xì)胞的分裂 CFSE 標(biāo)記（圖 2A）。ZOL 刺激后，增殖的 γδ T 細(xì)胞比例為（98.67±0.64）%；聯(lián)合 Siglec-15 刺激，增殖的 γδ T細(xì)胞比例為（98.2±0.38）%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.426，圖2B）。上述結(jié)果表明Siglec-15 不影響ZOL特異性γδ T細(xì)胞的增殖。

圖2 γδ T細(xì)胞的增殖Fig.2 Proliferation of γδ T cells

2.3 Siglec-15 降低 ZOL 特異性 γδ T 細(xì)胞分泌效應(yīng)分子IFN-γ 和顆粒酶B 的水平 以ZOL 聯(lián)合或不聯(lián)合Siglec-15 刺激γδ T 細(xì)胞（純度≥90%），胞內(nèi)流式分析 γδ T 細(xì)胞分泌 IFN-γ 和顆粒酶 B 的水平（圖3A）。結(jié)果顯示，ZOL 單獨(dú)刺激，使（11.98±1.98）%γδ T 細(xì)胞分泌IFN-γ；聯(lián)合 Siglec-15 蛋白刺激，分泌IFN-γ 的 γδ T 細(xì)胞比例顯著降低為（7.29±1.17）%（P=0.006，圖3B）。在ZOL 單獨(dú)刺激組，有（89.35±2.85）% γδ T 細(xì)胞分泌顆粒酶B，聯(lián)合Siglec-15刺激使分泌顆粒酶B 的γδ T 細(xì)胞比例降低為（81.53±5.31）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041，圖3C）。上述結(jié)果表明Siglec-15 可通過抑制IFN-γ 和顆粒酶B的分泌負(fù)向調(diào)控ZOL特異性γδ T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。

圖3 γδ T細(xì)胞分泌IFN-γ和顆粒酶BFig.3 IFN-γ and granzyme B secretion of γδ T cells

3 討論

腫瘤免疫治療的模式已經(jīng)由激活全身性免疫應(yīng)答，轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^選擇性糾正有缺陷的免疫應(yīng)答促使免疫正?；?。例如針對(duì)程序性死亡受體-1（pro‐grammed cell death protein 1，PD-1）和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein，CTLA-4）的單克隆抗體，就是通過阻斷PD-1和CTLA-4 恢復(fù)腫瘤特異性T 細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)［5］。雖然免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法在臨床取得了顯著療效，但目前單用PD-1 和CTLA-4 阻斷劑治療的有效率只有30%左右，提示除了PD-1 和CTLA-4，腫瘤微環(huán)境中還存在未知的能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃逸的免疫檢查點(diǎn)分子［6］。據(jù)報(bào)道，Siglec-15 在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，但其對(duì)T 細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響尚不明確［7］。陳列平團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，Siglec-15 可通過持續(xù)抑制T 細(xì)胞增殖及IFN-γ 分泌進(jìn)而抑制抗原特異性T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并通過小鼠腫瘤模型進(jìn)一步證明了Siglec-15 可作為腫瘤免疫治療正?；呗缘臐撛诎悬c(diǎn)［4］。

γδ T 細(xì)胞是人體發(fā)揮抗腫瘤免疫功能的重要細(xì)胞，其T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）由γ 鏈和δ 鏈組成［8］。γδ T 細(xì)胞與經(jīng)典的 αβ T 細(xì)胞在活化、增殖及發(fā)揮效應(yīng)方面有諸多相似之處。兩種細(xì)胞在受到TCR 識(shí)別的抗原刺激時(shí)，均需要通過CD3 分子傳遞活化信號(hào)，表達(dá)活化標(biāo)記分子CD69 和CD25［9-10］。兩種 T 細(xì)胞在活化后迅速增殖，數(shù)量成倍增加。在效應(yīng)階段，γδ T 細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制與αβ T細(xì)胞類似，通過釋放穿孔素、顆粒酶誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡；表達(dá)Fas配體，通過Fas/FasL 途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；分泌IFN-γ 等細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤特異性T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性［11-12］。基于上述γδ T細(xì)胞與αβ T 細(xì)胞的相似之處，本研究集中在Siglec-15對(duì)ZOL 特異性γδ T 細(xì)胞活化、增殖及發(fā)揮效應(yīng)的影響。

ZOL 是含氮雙磷酸鹽，可抑制哺乳動(dòng)物甲羥戊酸代謝通路中異戊烯焦磷酸（isopentenyldiphos‐phate，IPP）下游的法呢基焦磷酸合酶促使IPP 在細(xì)胞內(nèi)累積，累積的IPP通過TCRγδ激活γδ T細(xì)胞［13］。本研究以ZOL 刺激外周血中的γδ T 細(xì)胞，無論Siglec-15是否存在，γδ T細(xì)胞均可迅速活化與增殖。與文獻(xiàn)報(bào)道的Siglec-15 可持續(xù)抑制αβ T 細(xì)胞增殖的結(jié)果不同，本研究結(jié)果提示Siglec-15 不影響ZOL誘導(dǎo)的γδ T 細(xì)胞的活化與增殖，推測(cè)這可能與兩種細(xì)胞具備不同的抗原識(shí)別特點(diǎn)有關(guān)。αβ T 細(xì)胞識(shí)別抗原的過程受到精細(xì)的調(diào)控，除TCR 與抗原肽結(jié)合外，還需要CD80/CD86提供共刺激信號(hào)才能觸發(fā)αβ T 細(xì)胞的活化與增殖。為了維持免疫自穩(wěn)，活化的αβ T細(xì)胞同時(shí)上調(diào)免疫抑制分子的表達(dá)水平［14］；而γδ T 細(xì)胞的抗原識(shí)別對(duì)共刺激信號(hào)的依賴很小，不具有MHC限制性，表達(dá)免疫抑制性分子的數(shù)量較αβ T 細(xì)胞更少，表達(dá)水平更低［15］。在特異性T 細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答中，Siglec-15 以類似PD-L1 的角色發(fā)揮抑制作用，但T 細(xì)胞表面表達(dá)的介導(dǎo)Siglec-15 發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的受體尚不明確，其在T 細(xì)胞上的表達(dá)特點(diǎn)未知。本研究結(jié)果表明，Siglec-15 對(duì)γδ T 細(xì)胞的活化與增殖無顯著影響，提示在此階段，γδ T 細(xì)胞不表達(dá)或低水平表達(dá)Siglec-15 的受體。本研究的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)：與Siglec-15抑制αβ T 細(xì)胞分泌 IFN-γ 相似，Siglec-15 可顯著降低 γδ T 細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)分子IFN-γ 和顆粒酶B 的水平，表明在效應(yīng)階段γδ T 細(xì)胞表達(dá)了Siglec-15 受體或受體的表達(dá)水平上調(diào)。

綜上，在活化增殖階段，Siglec-15對(duì)ZOL特異性γδ T 細(xì)胞的抑制作用不顯著，但在效應(yīng)階段可通過抑制IFN-γ 和顆粒酶B 的分泌負(fù)向調(diào)控ZOL 特異性γδ T 細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。這對(duì)探討γδ T 細(xì)胞在臨床治療腫瘤患者方面有一定的價(jià)值。