小分子多肽（FNS007）對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠T細(xì)胞亞群的影響①

張彥景 劉 琰 張建新 （河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種進(jìn)展性、破壞性滑膜炎，會(huì)影響骨骼和關(guān)節(jié)，被公認(rèn)為是一種全身性自身免疫性疾病，T 細(xì)胞亞群失衡在其發(fā)病機(jī)理中非常關(guān)鍵［1］。目前RA 的治療藥物主要用于減輕患者疼痛，緩解癥狀，而針對(duì)其免疫學(xué)作用的藥物相對(duì)較少。FNS007 是一個(gè)小分子多肽，一種新型生物制劑，可直接作用于T 細(xì)胞，經(jīng)過前期的研究發(fā)現(xiàn)FNS007 可明顯改善關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥評(píng)分，下調(diào)關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平，對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-in‐duced arthritis，CIA）大鼠有治療作用［2］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上分析其治療作用與調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡的關(guān)系，為其進(jìn)一步應(yīng)用到臨床提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis雌性大鼠，6~7周齡，SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；牛Ⅱ型膠原蛋白（Collagen type Ⅱ）、不完全弗氏佐劑（incom‐plete Freund's adjuvant，IFA 購 自 Chondrex 公 司 ；FNS007 購自石家莊菲尼斯生物技術(shù)有限公司；FITC-anti-CD4抗體、PE-anti-IFN-γ抗體、PE-anti-IL-4抗體購自 BD 公司；PE-anti-IL17A 抗體、APC-anti-CD25 抗體購自 eBioscience 公司；PE-anti-Foxp3 抗體購自BioLegend 公司；電子天平（型號(hào)T5000）購自常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；流式細(xì)胞儀（型號(hào)FACSCali‐bur）購自BD 公司；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)MCO-175）購自SANYO 公司；離心機(jī)（型號(hào)Centrifuge 5810R）購自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 建立CIA 大鼠模型 在冰浴條件下，用0.05 mo/l L 乙酸溶液將Ⅱ型膠原均勻溶解，濃度為2 mg/ml，4℃過夜。然后將膠原溶液與相同體積的不完全弗氏佐劑混勻，充分乳化，取混合物100 μl于大鼠的尾根部皮內(nèi)注射，1 周后重復(fù)此操作。每日早晚兩次觀察大鼠足爪變化，當(dāng)大鼠關(guān)節(jié)腫脹且炎癥評(píng)分達(dá)到2 分時(shí)隨機(jī)入組，每組大鼠不少于8 只，另取8只空白大鼠作為對(duì)照，F(xiàn)NS007組按照0.5 m/l 100 g 的劑量尾靜脈注射給藥，兩日一次，模型組和空白對(duì)照組按照相同方式給予相同體積的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），給藥21 d后處死大鼠。

1.2.2 大鼠一般狀態(tài)及體重變化 觀察各組大鼠的一般狀態(tài)，包括精神面貌、活動(dòng)情況等，記錄體重，分析各組大鼠體重變化。

1.2.3 大鼠關(guān)節(jié)炎癥評(píng)價(jià) 根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)狀況進(jìn)行評(píng)分，嚴(yán)重程度：0 分=無關(guān)節(jié)腫脹；1 分=輕度，出現(xiàn)紅腫癥狀；2 分=中度，紅腫加重且大鼠行動(dòng)稍有不便；3 分=重度，紅腫進(jìn)一步加重，大鼠活動(dòng)受限；4 分=超重度，大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)畸形乃至不能負(fù)重。大鼠入組后兩天進(jìn)行一次評(píng)分，直至給藥結(jié)束。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞分型 在大鼠炎癥評(píng)分最高時(shí)開始給藥，兩日一次，連續(xù)21 d，末次給藥結(jié)束后處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，對(duì)血樣進(jìn)行處理，取0.6 ml 血樣加入0.6 ml 培養(yǎng)基，并加入50 ng/ml的PMA及1 μg/ml的離子霉素，在37℃、5%CO2條件下孵育2 h，其后加入0.1%BFA 繼續(xù)孵育2 h 即可。在流式管中先加入胞外抗體（FITC-CD4 抗體及APC-CD25抗體），然后加處理好的血樣150 μl，振蕩混勻，避光孵育20 min。經(jīng)過裂紅、固定、破膜，然后加相應(yīng)的胞內(nèi)抗體（PE-IFN-γ 抗體、PE-IL-4 抗體、PE-IL-17A 抗體、PE-Foxp3 抗體）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，以同型匹配抗體處理的血樣作為陰性對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析各細(xì)胞亞型的比例。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)滑膜組織中IL-17 的表達(dá) 取膝關(guān)節(jié)滑膜組織制作石蠟切片，脫蠟水化，過氧化物酶內(nèi)源性阻斷，微波爐內(nèi)抗原修復(fù)，動(dòng)物血清封閉，滴加一抗（兔抗1∶100），4℃ 過夜，加生物素化二抗（山羊抗兔）和SP 溶液，DAB 顯色，分化，脫水，透明，封片，光鏡觀察。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠基本情況 空白對(duì)照組大鼠毛色鮮亮，精神狀態(tài)佳，活動(dòng)自如，自給藥開始至結(jié)束的21 d 中體重平均增長(zhǎng)28.13 g；模型組大鼠精神萎靡，行動(dòng)不便，毛色臟污，足爪紅腫，與空白對(duì)照組相比，自第5 天開始體重明顯降低（P<0.01、P<0.05）；與模型組比較，F(xiàn)NS007組大鼠精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，體重在第5、7、9天明顯升高（P<0.05，圖1）。

圖1 FNS007對(duì)CIA大鼠體重的影響Fig.1 Effect of FNS007 on weight in CIA Rat

2.2 大鼠炎癥評(píng)分 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠炎癥評(píng)分從第1 天至21 天明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)NS007 組大鼠炎癥評(píng)分在第2、3、4、5和7、8天明顯降低（P<0.05、P<0.01，圖2）。

圖2 FNS007 對(duì)CIA 大鼠炎癥評(píng)分的影響Fig.2 Effect of FNS007 on inflammation score in CIA rats

2.3 各組大鼠T 細(xì)胞分型情況 如表1 所示，模型組大鼠Th1、Th17 細(xì)胞所占比例較空白對(duì)照組明顯升高，Th2、Treg 細(xì)胞所占比例明顯降低（P<0.05、P<0.01）；與模型組相比，F(xiàn)NS007 組大鼠 Th1、Th17細(xì)胞所占比例降低，Th2、Treg 細(xì)胞所占比例升高（P<0.01，圖3）。

圖3 FNS007 對(duì) CIA 大鼠 Th1、Th2、Th17、Treg 細(xì)胞分型的影響Fig.3 Effect of FNS007 on proportion of Th1，Th2，Th17，Treg in rats

表1 FNS007 對(duì) CIA 大鼠T細(xì)胞分型的影響（）Tab.1 Effect of FNS007 on proportion of T cell in CIA rats（）

表1 FNS007 對(duì) CIA 大鼠T細(xì)胞分型的影響（）Tab.1 Effect of FNS007 on proportion of T cell in CIA rats（）

Note：Compared with control group，1）P<0.01，3）P<0.05；compared with model group，2）P<0.01，4）P<0.05.

Treg（%）5.96±0.66 4.15±0.691）5.52±0.682）Groups Control Model FNS007 Th1（%）0.15±0.04 0.39±0.171）0.16±0.094）Th2（%）4.41±0.88 3.53±0.523）4.53±0.502）Th17（%）0.69±0.09 1.08±0.081）0.87±0.092）

2.4 各組大鼠滑膜組織中IL-17 染色結(jié)果 呈現(xiàn)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)里的黃棕色顆粒狀細(xì)胞為陽性染色的細(xì)胞，免疫組化結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠滑膜扁平，結(jié)構(gòu)清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生，未見或少見IL-17 陽性染色細(xì)胞；而模型組大鼠滑膜組織粗糙，結(jié)構(gòu)混亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，IL-17陽性染色細(xì)胞明顯增多，且多數(shù)集中在滑膜襯里層及襯里下層；與模型組比較，F(xiàn)NS007 組炎癥細(xì)胞少量存在，IL-17陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖4）。

圖4 FNS007 對(duì)CIA 大鼠滑膜組織IL-17表達(dá)的影響Fig.4 Effect of FNS007 on expression of IL-17 in CIA rats synovial tissues

3 討論

RA 是一種以關(guān)節(jié)滑膜腔內(nèi)強(qiáng)烈的免疫激活和多種全身表現(xiàn)為特征的慢性炎癥性疾病，如果不及時(shí)治療，兩到三年后可能發(fā)生永久性傷殘，給患者帶來嚴(yán)重危害。目前RA 的病理生理機(jī)制尚不完全清楚，有文獻(xiàn)報(bào)道T細(xì)胞通過調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在RA 的發(fā)展中發(fā)揮作用，作為T 細(xì)胞的主要子集，Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞亞群的失衡十分關(guān)鍵，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞極化可能是潛在的治療靶標(biāo)［3-4］。FNS007是一條小分子多肽，其取代了Ⅱ型膠原肽中與T細(xì)胞結(jié)合的氨基酸，而與人類白細(xì)胞DR 抗原（HLADR）結(jié)合的氨基酸保持不變，在RA 發(fā)病的初始環(huán)節(jié)，與抗原提呈細(xì)胞表面的HLA-DRB1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，同時(shí)破壞自身抗原與HLA-DRB1 的結(jié)合，進(jìn)而抑制“TCR-抗原肽-HLA”三分子復(fù)合物形成，阻斷T細(xì)胞激活的初始信號(hào)，從而延緩RA 的病情進(jìn)展達(dá)到治療目的，屬于直接作用于T 細(xì)胞的生物制劑［5］。CIA 是一種成熟的關(guān)節(jié)炎模型，與RA具有相同的發(fā)病機(jī)制和生理特點(diǎn)，而Lewis 雌性大鼠的關(guān)節(jié)誘導(dǎo)發(fā)生率較高，對(duì)于評(píng)估抗RA 藥物的療效非常重要［6］。

在前期的藥效學(xué)基礎(chǔ)上，本課題組采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)Lewis 雌性大鼠制作CIA 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FNS007 在CIA 鼠模型中可發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。與空白對(duì)照組相比，模型組T 細(xì)胞分化趨向Th1、Th17 型細(xì)胞，而向 Th2、Treg 型細(xì)胞偏移減少。Th1 細(xì)胞可促進(jìn)補(bǔ)體定型、誘導(dǎo)與細(xì)胞毒性相關(guān)抗體產(chǎn)生［7］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Th1細(xì)胞可分泌促炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ，TNF-α可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥和血管翳的形成，導(dǎo)致軟骨和骨骼的侵蝕破壞；而IFN-γ 則通過激活巨噬細(xì)胞來推動(dòng)炎癥的進(jìn)展，在RA 關(guān)節(jié)組織和滑液中均可檢測(cè)到大量IFN-γ，T細(xì)胞分化偏向Th1細(xì)胞，表明炎癥細(xì)胞因子分泌會(huì)相應(yīng)增加，從而加重關(guān)節(jié)炎癥［8］。對(duì)于Th2 細(xì)胞來說，其激活可以抑制RA 中的炎癥反應(yīng)，IL-4是Th2細(xì)胞分泌的標(biāo)志性細(xì)胞因子，體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-4可通過影響破骨細(xì)胞和減少分泌促炎癥細(xì)胞因子來抑制骨吸收，而給予外源性IL-4 可以減輕CIA 小鼠的臨床癥狀、關(guān)節(jié)損傷和炎癥反應(yīng)［9-10］。本實(shí)驗(yàn)中，模型組T 細(xì)胞不正常偏移導(dǎo)致Th2 細(xì)胞減少，是誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥的原因之一。T 細(xì)胞分化向Th17 型細(xì)胞偏移同樣會(huì)加重關(guān)節(jié)炎癥，Th17 細(xì)胞主要通過分泌IL-17 促進(jìn)自身免疫性疾病的進(jìn)程，同時(shí)IL-17 又能進(jìn)一步促進(jìn)Th17 細(xì)胞的分化并增強(qiáng)Th17 細(xì)胞活性，IL-17 還可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的產(chǎn)生，并與其形成一個(gè)正反饋的環(huán)路［11］。本研究中，利用免疫組化技術(shù)特異性檢測(cè)滑膜組織中IL-17 的表達(dá)，模型組大鼠滑膜組織IL-17 表達(dá)升高，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，異常增生，符合關(guān)節(jié)炎模型大鼠T 細(xì)胞向Th17偏移的規(guī)律。與Th17細(xì)胞相反，Treg細(xì)胞介導(dǎo)抗炎反應(yīng)，通過分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β抑制其他T 細(xì)胞亞型，并保持自身免疫耐受狀態(tài)［12-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者滑膜中的炎癥細(xì)胞因子可抑制Treg 細(xì)胞增殖和分泌功能性細(xì)胞因子，在RA 發(fā)展進(jìn)程中，Treg 細(xì)胞的比例呈減少趨勢(shì)［14-15］。本研究中模型組大鼠Treg 細(xì)胞比例明顯下降，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。在給予FNS007 干預(yù)后，CIA 大鼠體內(nèi)Th1/Th2/Treg/Th17 的比例發(fā)生變化，Th1、Th17 所占比例減少，而Th2、Treg 所占比例增加，表明FNS007 可以通過抑制Th1、Th17 的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，促進(jìn)原始T 細(xì)胞向Th2、Treg 分化來發(fā)揮作用，滑膜組織中RA 的炎性生物標(biāo)志物IL-17 的表達(dá)進(jìn)一步佐證了這個(gè)論點(diǎn)。

綜上所述，F(xiàn)NS007 可以調(diào)節(jié) Th1、Th2、Treg 和Th17 細(xì)胞的分化，減少向致炎型細(xì)胞Th1、Th17 轉(zhuǎn)化，增加向抑炎型細(xì)胞Th2、Treg轉(zhuǎn)化，通過恢復(fù)T細(xì)胞的正常平衡并干擾滑膜的免疫細(xì)胞入侵來治療或減輕RA 癥狀，這為其臨床治療RA 和其他T 細(xì)胞免疫相關(guān)疾病提供了新的治療策略。