綠原酸抑制糖酵解及脂肪酸代謝調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞極化①

藍(lán)春花 孟 玲 陳成英 藍(lán) 利 王新航 常升搏小吉 陸彩玲 李習(xí)藝 唐 深

（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧530021）

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是一種含有咖啡酸和奎寧酸的多酚物質(zhì)，存在于人類(lèi)飲食的咖啡或綠茶中，它已被證明具有多種有益的生物學(xué)特性，包括抗菌作用、抗炎作用、抗氧化作用以及抗腫瘤活性［1-2］。已有文獻(xiàn)報(bào)道 CGA 通過(guò) NF-κB 抑制前列腺素E 和環(huán)氧合酶-2 的合成，并通過(guò)抑制JNK/AP-1活化而發(fā)揮抗炎作用［3］。其抗炎作用通過(guò)抑制NF-κB的激活，降低TNF-α和IL-6的基因表達(dá)［4］。同時(shí)CGA也可以減輕肝、腎等多個(gè)器官的缺血或再灌注損傷。

炎癥是機(jī)體對(duì)損傷、感染和應(yīng)激的先天免疫反應(yīng)，它在促炎和抗炎細(xì)胞因子之間保持平衡［5］。過(guò)度促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能導(dǎo)致慢性炎癥性疾病的發(fā)展。慢性炎癥或過(guò)度炎癥反應(yīng)與非酒精性脂肪性肝炎、心肌梗死、糖尿病、阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化、感染性休克等有關(guān)［6-7］。巨噬細(xì)胞是主要的炎癥和免疫細(xì)胞，在非特異性和特異性免疫反應(yīng)中起著重要作用［5］。由于微環(huán)境中細(xì)胞因子的平衡，巨噬細(xì)胞可以分化為不同的活化狀態(tài)，它被廣泛歸類(lèi)為“經(jīng)典激活”促炎M1 型巨噬細(xì)胞和“替代激活”抗炎M2型巨噬細(xì)胞［8］。而巨噬細(xì)胞在不同極化狀態(tài)的代謝方式各異，M1 型的CD36 mRNA 表達(dá)水平增加可提高細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸和氧化型低密度脂蛋白的攝取，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平高于M2型［9］。促炎M1 型巨噬細(xì)胞主要依賴(lài)無(wú)氧糖酵解和磷酸戊糖途徑為主要代謝方式，以便巨噬細(xì)胞應(yīng)對(duì)高度增殖的細(xì)菌感染；而抗炎M2 型巨噬細(xì)胞則以氧化磷酸化和脂肪酸氧化為主［10］。研究發(fā)現(xiàn)，在ox-LDL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞脂質(zhì)積累的模型中，CGA 可激活SIRT1并調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)因子ABCA1、SREBP2和 miR-33 的表達(dá)［11］。飲食補(bǔ)充 CGA 對(duì) LPS 慢性輸注所致的大鼠肝損傷有肝保護(hù)作用，主要機(jī)制是CGA 參與下調(diào)肝臟中糖酵解酶的活性，上調(diào)了氧化磷酸化的酶的活性，導(dǎo)致能量代謝從糖酵解向線粒體氧化磷酸化的轉(zhuǎn)變［12］。文獻(xiàn)報(bào)道CGA 抑制NF-κB 或 JNK/AP-1 活化而發(fā)揮抗炎作用，但 CGA是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞糖酵解水平和脂肪酸代謝水平來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥極化尚不完全清楚。在本研究中，以THP-1細(xì)胞（人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系）構(gòu)建體外M1型巨噬細(xì)胞模型，探討了CGA 是否能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞糖酵解水平和脂肪酸代謝水平，從而影響M1 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，調(diào)控M1巨噬細(xì)胞的極化。

1 材料與方法

1.1 材料 人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。綠原酸（chlorogenic acid，Sigma），佛波酯（phorbol myristate acetate，美國(guó)Sigma公司）；IFN-γ（北京Sino-Biological 公司）；青霉素、鏈霉素、LPS、糖酵解相關(guān)酶（HK、PK、LDH）試劑盒（索萊寶生物技術(shù)公司）；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑、TRIzo（l日本TaKaRa 公司）；SYBR?Green Master（美國(guó)Roche 公司）；引物由Invi‐trogen 公司合成；StepOne 熒光定量 PCR 儀、Multi‐skan Go 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均為美國(guó)Thermo Fisher Scientific 產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 的胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 THP-1 細(xì)胞分化及分組 THP-1 細(xì)胞以1.0×106個(gè)/孔接種于6 孔板，經(jīng)100 nmo/lL PMA 刺激24 h 活化為M0 型巨噬細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上將實(shí)驗(yàn)分為3 組。對(duì)照組（M0 型巨噬細(xì)胞）、M1 型巨噬細(xì)胞組（用 10 ng/ml LPS 和 20 ng/ml IFN-γ 處理 M0 巨噬細(xì)胞48 h）、CGA 處理組（用 50 μg/ml、100 μg/ml CGA 分別與 10 ng/ml LPS、20 ng/ml IFN-γ 共處理48 h），將細(xì)胞置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分化為M1型巨噬細(xì)胞。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和Image J 軟件進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和計(jì)數(shù) 細(xì)胞分組同1.2.2，各分組細(xì)胞極化完成后，倒置顯微鏡觀察各組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并攝取實(shí)驗(yàn)組3張細(xì)胞密度相近的細(xì)胞圖片，通過(guò)Image J 軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)各組內(nèi)3 張細(xì)胞圖片中的總細(xì)胞數(shù)和長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形細(xì)胞數(shù)，最終算出長(zhǎng)梭形和不規(guī)則形細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物IL-6、TNF-α、COX-2、CXCL-10 和脂肪酸代謝相關(guān)標(biāo)志物氧化物PPAR-γ、SREBP-1的mRNA 水平 THP-1 細(xì)胞按 1.0×106個(gè)/孔接種于 6 孔板，同1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組處理THP-1 細(xì)胞。分化完成后，各組實(shí)驗(yàn)孔用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗1次，每孔加入1 ml TRIzol 試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)提取總mRNA，以 500 ng 為總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，95℃預(yù)變性10 min，（95℃ 變性30 s，60℃ 退火10 s）×40 個(gè)循環(huán)，以 β-actin 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。引物見(jiàn)表1。

表1 引物名稱(chēng)和序列Tab.1 Primer names and sequences

1.2.5 微量法試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)糖酵解相關(guān) 酶活性 HK（PK、LDH）提取：THP-1 細(xì)胞以1.0×106個(gè)/孔接種于6 孔板，同1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，先棄掉上清，用PBS 洗2 次，每孔加入200 μl HK（PK、LDH）提取液，用無(wú)菌的細(xì)胞刮子將細(xì)胞收集于1.5 ml EP 管內(nèi)，在冰浴條件下超聲裂解細(xì)胞，4℃8 000 g離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。

按照試劑說(shuō)明步驟加入試劑和待測(cè)樣本：振蕩混勻，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)340 nm 測(cè)定各組20 s 時(shí)的吸光值 A1 和 320 s 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1，根據(jù)公式計(jì)算各組HK 的活性；再在波長(zhǎng)340 nm 測(cè)定各組20 s 時(shí)的吸光值A(chǔ)1 和200 s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2，根據(jù)公式計(jì)算各組PK 的活性；450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度A，計(jì)算ΔA=測(cè)定管A-對(duì)照管A，根據(jù)公式計(jì)算LDH活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，單因素方差分析及LSD 兩兩比較，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察CGA 處理后巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 THP-1 細(xì)胞經(jīng)PMA 刺激活化為M0 巨噬細(xì)胞，細(xì)胞逐漸扁平貼壁呈煎蛋樣，由光亮變成灰色，形態(tài)呈類(lèi)圓形或不規(guī)則形；M0 巨噬細(xì)胞極化M1 型巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞伸出偽足，呈梭形和不規(guī)則形；CGA 處理組與M1 型組相比，梭形細(xì)胞和不規(guī)則細(xì)胞占比減少，隨著CGA 濃度增加這種形態(tài)變化越明顯。細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化結(jié)果提示CGA 處理后能抑制M1型巨噬細(xì)胞長(zhǎng)梭形和偽足的形成（圖1）。

圖1 巨噬細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphological of macrophage polarization

2.2 CGA 對(duì)M1 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 mRNA 表達(dá)水平的影響 M1型與 M0 型相比，TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 這4 種極化相關(guān)標(biāo)志物mRNA 表達(dá)均升高（P<0.05）；加入 CGA 處理后，與 M1 型極化組相比，TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 mRNA 表達(dá)均降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上結(jié)果提示CGA 可降低M1 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因標(biāo)志物mRNA 表達(dá)水平（圖2）。

圖2 CGA對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA表達(dá)影響Fig.2 Effects of CGA on gene mRNA expression of M1 macrophage

2.3 CGA 對(duì) M1 巨 噬 細(xì) 胞 PPAR-γ、SREBP-1 的mRNA 表達(dá)水平的影響 M1 型與M0 型相比，PPAR-γ、SREBP-1 mRNA 表達(dá)升高；加入 CGA 處理后，與 M1 型極化組相比，PPAR-γ、SREBP-1 mRNA表達(dá)均降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上結(jié)果提示CGA 可降低M1 型巨噬細(xì)胞PPAR-γ、SREBP-1 mRNA的表達(dá)水平（圖3）。

圖3 CGA 對(duì) M1 型 巨 噬 細(xì) 胞 PPAR-γ、SREBP-1 基 因mRNA表達(dá)影響Fig.3 Effects of CGA on expressions of PPAR-γ and SREBP-1 genes in mRNA M1 macrophages

2.4 CGA 對(duì)M1型巨噬細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶HK、PK、LDH 活性的影響 M0 型誘導(dǎo)極化為 M1 型，HK、PK、LDH酶活性均增加（P<0.05），CGA處理組與M1型極化組相比，HK、PK、LDH 活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，CGA 可以降低M1型巨噬細(xì)胞的糖酵解水平（圖4）。

圖4 CGA對(duì)M1型巨噬細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶活性的影響Fig.4 Effects of CGA on glycolytic enzyme activity in M1 macrophage

3 討論

巨噬細(xì)胞是組織中的天然免疫細(xì)胞，作為介導(dǎo)炎癥的主要吞噬細(xì)胞，負(fù)責(zé)清除機(jī)體損傷組織和細(xì)胞碎片以及入侵的病原體，并參與炎癥損傷后的組織修復(fù)。在炎癥急性期，“經(jīng)典激活”促炎M1 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過(guò)釋放促炎介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧等，誘導(dǎo)激活多種抗菌機(jī)制，有助于殺滅病原體和維持正常炎癥反應(yīng)［13］。研究表明CGA 具有抗炎作用，促進(jìn)傷口愈合，減輕肝缺血再灌注所致的肝損傷。CGA 通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路激活從而下調(diào)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟炎癥和纖維化模型中血清IL-1β、TNF-α 和IL-6細(xì)胞炎癥因子水平［14］。

在腎缺血再灌注損傷的小鼠模型中，炎癥介質(zhì)因子表達(dá)量增加，巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，CGA通過(guò)降低TLR-4 信號(hào)通路相關(guān)蛋白（NF-κB、TNF-α 和MCP-1）的mRNA 表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞的數(shù)量，從而減輕炎癥反應(yīng)［15］。本研究中CGA 處理組的梭形細(xì)胞和不規(guī)則細(xì)胞數(shù)量減少，類(lèi)圓形細(xì)胞增多，細(xì)胞伸出偽足減少，M1 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物IL-6、TNF-α、CXCL-10、COX-2的mRNA 表達(dá)量下降，表明CGA 能降低M1 型巨噬細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，并抑制M1 型巨噬細(xì)胞貼壁展開(kāi)和偽足形成。文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)LPS處理RAW 264.7細(xì)胞可顯著提高細(xì)胞IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞上清液中 IL-6、TNF-α濃度，而CGA 與LPS 共孵育時(shí)，則表現(xiàn)出明顯的降低［16］，與本研究結(jié)果相似。

巨噬細(xì)胞在極化時(shí)會(huì)顯著改變其代謝途徑，在LPS，Th1細(xì)胞因子或IL-12的刺激下，其代謝向無(wú)氧糖酵解途徑的轉(zhuǎn)變，LPS和IFN-γ會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取，抑制脂肪酸攝取和氧化［17-19］。SREBPs 是調(diào)控脂肪酸和膽固醇生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，LPS 和炎癥細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的SREBP-1產(chǎn)生活性；相反，SREBP-1c 缺乏的小鼠巨噬細(xì)胞在LPS 刺激后 IL-1β 分泌降低［20-21］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是屬于類(lèi)固醇/甲狀腺激素受體超家族的核受體，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，PPAR-γ 可通過(guò)激活促進(jìn)脂質(zhì)攝取和脂肪生成的基因來(lái)調(diào)節(jié)脂肪酸的儲(chǔ)存。PPAR-γ 的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致脂肪組織和肝臟中的脂質(zhì)積累［22］。本研究結(jié)果顯示，由M0 型分化為M1 型巨噬細(xì)胞后，糖酵解HK、PK、LDH 活性均增加，脂肪酸合成相關(guān)基因PPAR-γ、SREBP-1 的 mRNA 水平增加，提示細(xì)胞內(nèi)糖酵解和脂肪酸代謝增加。研究表明，CGA 通過(guò)AKTPH結(jié)構(gòu)域激活A(yù)KT/GSK3β/FOXO1信號(hào)，過(guò)調(diào)節(jié)糖異生和糖酵解酶，如葡萄糖6-磷酸酶（G6P）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）的基因表達(dá)，在肝臟維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。CGA 也可降低小鼠肝臟組織脂肪酸合成酶和PPAR-γ2 的基因表達(dá)水平來(lái)降低脂肪酸的合成，起到保護(hù)肝臟的作用［23-24］。本研究結(jié)果表明 CGA 可以降低 M1 型巨噬細(xì)胞 HK、PK、LDH 活性，下調(diào) PPAR-γ、SREBP-1 的mRNA 表達(dá)水平，提示CGA 處理后M1 型巨噬細(xì)胞中糖酵解和脂肪酸水平被抑制。這可能是CGA 參與負(fù)調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞炎癥極化的機(jī)制之一。

綜上所述，CGA 可能通過(guò)抑制糖酵解和脂肪酸代謝水平，降低M1 型巨噬細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，負(fù)調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞炎癥極化。本研究為探索CGA 在巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥性疾病的免疫營(yíng)養(yǎng)治療提供新思路。