補(bǔ)體C9缺陷對LPS誘導(dǎo)的小鼠早期肝臟炎癥和損傷的保護(hù)作用及機(jī)制①

吳艷紅 付曉燕 于 洋 吳沛恩 許 虎 房佩佩 魏 濤 梁淑娟

（濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東省高校免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濰坊261053）

內(nèi)毒素性休克是由宿主對感染的免疫反應(yīng)失調(diào)引起的致命性疾病，通常引發(fā)多器官功能障礙，包括肺、腎、肝臟［1-2］。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的組成成分，其誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥模型是研究敗血癥及敗血癥休克病理生理學(xué)的重要工具［3］。研究證明LPS 與 CD14 和 Toll 樣受體 4（Toll like receptor 4，TLR4）相互作用激活炎癥信號(hào)并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的分泌，刺激炎癥細(xì)胞向靶器官浸潤從而導(dǎo)致組織損傷［4-6］。肝臟由于其獨(dú)特的解剖位置，經(jīng)常高度暴露于循環(huán)抗原、內(nèi)毒素甚至微生物中，是抵御炎癥的重要防線。肝臟可通過清除細(xì)菌、急性期蛋白以及對炎癥代謝的適應(yīng)等機(jī)制，對全身感染期間免疫防御的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，同時(shí)肝臟也是內(nèi)毒素休克相關(guān)損傷的重要靶標(biāo)和受累器官［7-8］。

補(bǔ)體系統(tǒng)在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均起重要作用，補(bǔ)體激活最終形成膜攻擊復(fù)合物（MAC或C5b-9）。MAC 由C5b、C6、C7、C8和多個(gè)C9組成，組裝形成環(huán)形孔嵌入靶細(xì)胞膜從而裂解細(xì)胞，補(bǔ)體C9 是 MAC 發(fā)揮作用的重要成分［9］。近年來的研究進(jìn)一步證明MAC是多種炎癥的重要驅(qū)動(dòng)因素，本課題組前期研究表明C9基因缺陷能夠保護(hù)小鼠免于LPS 誘導(dǎo)的休克性死亡，其機(jī)制與下調(diào)小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)［10］。為進(jìn)一步闡明 MAC 在 LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克中的相關(guān)病理機(jī)制，考慮到肝臟是內(nèi)毒素休克中多器官損傷的重要靶器官，本研究重點(diǎn)探討了補(bǔ)體C9缺陷在LPS 誘導(dǎo)的早期肝臟炎癥反應(yīng)和損傷中的作用及病理機(jī)制，從而為臨床上內(nèi)毒素血癥中肝臟損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 野生型B6. WT（C57BL/6）、補(bǔ)體C9基因缺陷型（B6.C9-/ -）小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境中。所有動(dòng)物研究皆根據(jù)濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。試驗(yàn)對象為8~10 周齡小鼠。LPS（0111：B4）購自 Sigma-Aldrich；ALT 和 AST 測試盒購自南京建成生物工程研究所；山羊血清購自北京中杉金橋。IF 檢測用的大鼠抗小鼠F4/80-Alexa Fluor 647（F4/80-647）、兔抗小鼠 C5b-9 抗體購自Abcam；大鼠抗小鼠Gr-1 抗體購自BioLegend；山羊抗大鼠 IgG（H+L）-FITC 購自 Invitrogen；山羊抗兔IgG（H+L）-Alexa Fluor 647 購 自 Jackson Immuno Research。FACS檢測用的大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體、F4/80-APC、CD11b-FITC、CD11b-PE、Gr-1-APC、Ly6C-FITC、Ly6G-APC 均購自 Biolegend。RIPA 裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio；小鼠IL-1β、TNF-α 檢測試劑盒購自eBioscience；小鼠IL-8 檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；sMAC 檢測試劑盒購自Miobiosource；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo scientific；qPCR 試劑盒購自羅氏公司；紅細(xì)胞裂解液購自Solarbio；多聚甲醛購自 sigma-Aldrich；Percoll 購自GE Healthcare。BioTek?酶標(biāo)儀購自美國 Thermo 公司；正置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；Light‐Cycler?480 Ⅱ購自羅氏公司；冷凍切片機(jī)購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS 誘導(dǎo) 取 8~10 周齡的 B6.WT 和 B6.C9-/ -小鼠，分為LPS 組（n=5）和對照組（n=3），LPS 組腹腔注射LPS（5 mg/kg），對照組注射等體積的生理鹽水，12 h后處死小鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 酶法檢測血清中ALT、AST 水平 收集小鼠血清，取5 μl 血清依據(jù)試劑盒說明書檢測ALT、AST的水平。

1.2.3 HE 染色觀察肝臟組織病理學(xué)改變 肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟水化后，用蘇木素染色5 min，伊紅復(fù)染后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，觀察肝臟組織的病理損傷和炎癥反應(yīng)變化。

1.2.4 ELISA 檢 測 血 清 中 IL-1β、IL-8、TNF-α、sMAC 水平 收集小鼠血清，依據(jù)ELISA 試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-8、TNF-α、sMAC的水平。

1.2.5 IF 檢測肝臟組織巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及MAC 沉積 肝臟組織經(jīng)OCT 包埋，切片5 μm，冷丙酮固定10 min，10%山羊血清封閉1 h，用于后續(xù)檢測。檢測巨噬細(xì)胞時(shí)，組織用0.3%Triton X-100 破膜5 min，加入大鼠抗小鼠F4/80-647 抗體（1∶50），4℃避光孵育過夜，PBS洗滌后DAPI染色5 min，PBS洗滌后加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。檢測中性粒細(xì)胞和MAC時(shí)，組織先分別與大鼠抗小鼠 Gr-1 抗體（1∶100）、兔抗小鼠 C5b-9 抗體（1∶50）4℃孵育過夜，PBS 洗滌后，再分別與山羊抗大鼠IgG（H+L）-FITC（1∶400）和山羊抗兔IgG（H+L）-Alexa Fluor 647（1∶400）反應(yīng)，然后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 ELISA 檢測肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平 50 mg 肝臟組織加入 0.5 ml 預(yù)冷的RIPA 裂解緩沖液，冰上裂解10 min，11 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液。依據(jù)試劑盒說明書用BCA法檢測組織抽提物的蛋白濃度。依據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測每200 μg 肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α的水平。

1.2.7 qRT-PCR 檢測肝臟中 IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA 水平 小鼠肝臟組織Trizol 法提取總RNA，無RNase 水溶解后使用TAKE3TM超微量檢測系統(tǒng)檢測純度和濃度，完全符合試驗(yàn)要求。取5 μg RNA依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按照表1所顯示的序列由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成引物。取 2 μl cDNA 于 20 μl 反應(yīng)體系中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行 PCR 循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，以 β-actin 作為內(nèi)參，通過 2-ΔΔCt分析 IL-1β、IL-8、TNF-α 的mRNA 水平變化。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.8 FACS 檢測小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞 摘取小鼠肝臟，冰上研磨并過200 目尼龍網(wǎng)，細(xì)胞懸液 650 r/min，4℃ 離心 1 min。收集上清，1 500 r/min，4℃ 離心8 min。棄上清，細(xì)胞沉淀加入10 ml 紅細(xì)胞裂解液冰上裂解7 min，加入PBS 終止裂解后1 500/rmin，4℃ 離心8 min。棄上清，PBS 洗滌細(xì)胞沉淀 1 次，8 ml 40% 的 Percoll 重懸細(xì)胞沉淀，2 500/rmin，4℃離心25 min，所得細(xì)胞沉淀即肝臟單個(gè)核細(xì)胞。取1×106個(gè)細(xì)胞，加入1 μl抗小鼠CD16/CD32 抗體封閉15 min，加入相應(yīng)細(xì)胞群的檢測抗體：CD11b-FITC、F4/80-APC 和 CD11b-PE、Ly6C-FITC 抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞；CD11b-PE、Gr-1-APC 和 CD11b-PE、Ly6G-APC 抗體標(biāo)記中性粒細(xì)胞。避光染色30 min，加入1 ml PBS 洗滌細(xì)胞2 次，1 500/rmin，4℃ 離心 5 min，用 400 μl FACS buffer重懸細(xì)胞并過濾后上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用GraphPad Prism 8.0.1 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)體C9基因缺陷顯著降低小鼠血清中ALT、AST 水平和肝臟損傷及炎癥浸潤 LPS 處理后，首先檢測兩組小鼠血清中ALT、AST 的水平，觀察肝臟功能變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 注射組小鼠血清ALT、AST的水平均明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組，且B6.C9-/ -小鼠血清中ALT、AST 的水平明顯低于B6.WT 小鼠（P<0.001，圖1A、B），提示C9基因缺陷后小鼠肝臟損傷較輕。同時(shí)肝臟組織HE 染色表明，LPS 處理后，B6.WT 和 B6.C9-/ -小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、肝臟細(xì)胞腫脹、間隙減小、局灶性炎癥細(xì)胞浸潤，而B6.C9-/ -小鼠肝臟組織上述病理變化明顯輕于B6.WT小鼠（圖1C）。

圖1 血清ALT、AST水平及肝臟病理學(xué)改變Fig.1 Serum ALT，AST levels and liver pathological fea?tures

2.2 補(bǔ)體C9基因缺陷降低小鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α 水平 ELISA 檢測兩組小鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 注射組小鼠血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS處理后，B6.C9-/ -小鼠血清中 IL-1β（P<0.01，圖 2A）、IL-8（P<0.000 1，圖 2B）、TNF-α（P<0.000 1，圖2C）的水平顯著低于B6. WT小鼠，提示B6.C9-/ -小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平低于B6.WT小鼠。

圖2 血清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平Fig.2 Levels of IL-1β，IL-8，TNF-α in serum

2.3 補(bǔ)體C9基因缺陷顯著下調(diào)小鼠肝臟組織中MAC 沉積及血清中sMAC 的水平 通過MAC 的特異性標(biāo)志物進(jìn)行IF 染色，分析肝臟中MAC 沉積情況，結(jié)果表明，LPS 組小鼠肝臟組織MAC 沉積顯著高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟中MAC 沉積（圖3A）及熒光強(qiáng)度（P<0.01，圖3B）顯著低于B6.WT小鼠。同時(shí)ELISA檢測小鼠血清中sMAC 水平來反映小鼠體內(nèi)補(bǔ)體活化水平的高低，結(jié)果顯示LPS 組小鼠血清中sMAC水平明顯高于各自的生理鹽水對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠血清sMAC 水平顯著低于B6. WT小鼠（P<0.05，圖3C），提示B6.C9-/ -小鼠體內(nèi)補(bǔ)體活化水平低于B6.WT小鼠。

圖3 肝臟組織MAC沉積情況及血清sMAC水平Fig.3 MAC deposition in liver and serum sMAC level

2.4 補(bǔ)體C9基因缺陷降低肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8 的水平 ELISA 檢測兩組小鼠肝臟組織抽提物（liver tissue extracts，LTE）中IL-1β、IL-8、TNF-α的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 組小鼠 LTE 中 IL-1β、IL-8水平明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS處理后，B6.C9-/ -小鼠LTE中IL-1β（P<0.01，圖4A）、IL-8（P<0.05，圖4B）水平顯著低于B6.WT 小鼠，而TNF-α 水平與B6. WT 小鼠相比無顯著性差異（圖4C）。

圖4 肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8、TNF-α水平Fig.4 Levels of IL-1β，IL-8 and TNF-α in liver tissue ex?tracts

2.5 補(bǔ)體C9基因缺陷降低小鼠肝臟中IL-1β mRNA 的表達(dá)水平 qRT-PCR 檢測小鼠肝臟中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA水平。結(jié)果顯示，LPS組小鼠肝臟IL-1β mRNA 水平明顯高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟IL-1β mRNA 水平顯著低于B6.WT 小鼠（P<0.05，圖5A），而 IL-8、TNF-α mRNA 水平與 B6.WT 小鼠相比無顯著性差異（圖5B、C）。

圖5 肝臟組織中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of IL-1β，IL-8，TNF-α mRNA in liver tissue

2.6 補(bǔ)體C9基因缺陷減少小鼠肝臟組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的聚集和浸潤 通過巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物進(jìn)行IF 染色，分析肝臟中兩群免疫炎癥細(xì)胞亞群浸潤的情況。結(jié)果表明，LPS組小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞（F4/80）、中性粒細(xì)胞浸潤（Gr-1）顯著高于各自用生理鹽水處理的對照組。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟巨噬細(xì)胞（圖6A）、中性粒細(xì)胞（圖6B）浸潤顯著少于B6.WT小鼠。

圖6 肝臟組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤情況Fig.6 Infiltration of macrophages and neutrophils in liver

2.7 補(bǔ)體C9基因缺陷顯著減少肝臟單個(gè)核細(xì)胞中巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的比例 小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞流式測定結(jié)果顯示，LPS 組小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例顯著高于各自用生理鹽水處理的對照組。為了全面分析兩群細(xì)胞浸潤水平的變化，使用兩種常用的細(xì)胞表面標(biāo)志對巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤情況進(jìn)行檢測。LPS 處理后，B6.C9-/ -小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞CD11b+F4/80+、CD11b+Ly6C+巨噬細(xì)胞（P<0.01，圖7A、B）及CD11b+Gr-1+、CD11b+Ly6G+（P<0.01，圖7C、D）中性粒細(xì)胞比例顯著少于B6.WT小鼠。

圖7 肝臟單個(gè)核細(xì)胞中巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的比例Fig.7 Proportion of macrophages and neutrophils in liver mononuclear cells

3 討論

補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫的主要組成部分，是先天性和適應(yīng)性免疫之間的重要紐帶，由多種血漿和膜結(jié)合蛋白組成。這些蛋白質(zhì)在防御病原體以及調(diào)節(jié)免疫和炎癥過程中起著核心作用［11-12］。補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)由3種途徑激活：經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑，3 種途徑于C3 處匯聚，并導(dǎo)致效應(yīng)分子C3a和C5a 等炎性介質(zhì)產(chǎn)生，最終匯聚于終末成分C9 及其參與組成的 MAC（或 C5b-9）［13-14］。MAC 的許多促炎作用已將其確立為炎癥的重要驅(qū)動(dòng)因素［15］，例如，ALAWIEH 等［16］研究發(fā)現(xiàn)通過抑制補(bǔ)體的激活顯著減弱創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)炎癥和功能障礙；KUMAR 等［11］研究表明MAC沉積在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）視網(wǎng)膜中，這導(dǎo)致NLRP3 炎性小體激活并增加IL-1β 的產(chǎn)生。MAC 的炎癥驅(qū)動(dòng)作用使得MAC有可能作為炎癥治療的新靶點(diǎn)，基于補(bǔ)體C9 作為MAC 形成裂解孔隙的最重要成分，本研究利用補(bǔ)體C9基因缺陷的小鼠，更直觀地探究MAC在補(bǔ)體相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理中的作用。

肝臟是重要的免疫器官，具有獨(dú)特的免疫細(xì)胞群，參與先天性和適應(yīng)性免疫。LPS 相關(guān)的肝損傷是敗血癥及其他系統(tǒng)性肝臟疾病患者發(fā)病和死亡的重要原因。臨床研究表明，與急、慢性肝炎，肝硬化和肝細(xì)胞癌相關(guān)的內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率高達(dá)75%~95%［17-18］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分，可在炎癥動(dòng)物模型中用于誘導(dǎo)急、慢性組織損傷［19］。已有研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)的激活是內(nèi)毒素休克中病原體防御機(jī)制的關(guān)鍵事件之一，MAC 形成能夠激活 NLRP3 炎性小體［20］。本研究利用補(bǔ)體C9基因缺陷小鼠探究MAC 在LPS 誘導(dǎo)的肝損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制。通過檢測小鼠血清AST、ALT 水平和HE 染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化評估肝臟損傷情況，結(jié)果顯示LPS 刺激顯著上調(diào)小鼠血清中AST、ALT 水平，同時(shí)肝臟HE 染色顯示LPS刺激引起肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、肝臟細(xì)胞腫脹、間隙減小、局灶性炎癥細(xì)胞浸潤，而補(bǔ)體C9缺陷顯著減輕了上述病理變化，提示補(bǔ)體C9缺陷對LPS 誘導(dǎo)的小鼠肝損傷起保護(hù)作用。研究表明LPS 對TLR4的過度激活以及隨之而來的細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是內(nèi)毒素休克或敗血癥的基礎(chǔ)，LPS 能與細(xì)胞膜的Toll 樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活下游炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，炎性細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生是器官功能障礙并最終導(dǎo)致死亡的原因［21-23］。為探究補(bǔ)體C9缺陷在保護(hù)LPS誘導(dǎo)的肝損傷中涉及的炎癥過程和機(jī)制，本研究對相關(guān)促炎因子進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明補(bǔ)體C9基因缺陷顯著降低 LPS 處理后小鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平。為確認(rèn)補(bǔ)體C9 參與LPS 誘導(dǎo)肝損傷的免疫應(yīng)答過程與MAC 相關(guān)，IF 檢測肝臟中MAC 沉積，同時(shí)檢測小鼠血清中sMAC 的水平，結(jié)果顯示補(bǔ)體C9缺陷顯著下調(diào)肝臟中MAC 沉積及血清sMAC 水平，提示補(bǔ)體C9缺陷對LPS 誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用與下調(diào)補(bǔ)體活化和MAC 沉積有關(guān)。為探究MAC 在觸發(fā)或加速LPS 誘導(dǎo)肝損傷的免疫應(yīng)答機(jī)制，對肝臟中IL-1β、IL-8、TNF-α 蛋白質(zhì)和 mRNA 水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示補(bǔ)體C9缺陷顯著降低肝臟組織抽提物中IL-1β、IL-8 水平及肝臟中IL-1β mRNA 水平，提示補(bǔ)體C9缺陷通過下調(diào)MAC 抑制肝臟中炎性因子的產(chǎn)生和釋放。LPS 能夠觸發(fā)先天性免疫反應(yīng)，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是先天性免疫的兩種細(xì)胞類型，在急性炎癥啟動(dòng)過程中至關(guān)重要［24］。本研究通過IF以及FACS 檢測肝臟中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤情況，結(jié)果均顯示補(bǔ)體C9缺陷顯著減少肝臟中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤，提示MAC通過影響巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的炎癥過程誘導(dǎo)或加速了LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷。

上述研究結(jié)果提示補(bǔ)體C9缺陷后下調(diào)了肝臟組織中MAC 沉積，進(jìn)而減少促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α 的產(chǎn)生和釋放，從而抑制肝臟巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的聚集和浸潤，減弱了LPS 內(nèi)毒素休克中的肝臟組織損傷。進(jìn)一步提示MAC 在LPS 誘導(dǎo)的休克相關(guān)的炎癥反應(yīng)中具有促進(jìn)肝臟病理損傷的作用，將為臨床內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝損傷靶向治療方案設(shè)計(jì)和臨床治療策略提供新的思路。