豚鼠耳蝸植入阿糖胞苷緩釋模擬電極對術(shù)后 聽力的保護作用△

于浩然 黃玉宇 陳君敏 張帆 孫夏雨 賈歡 楊軍,5

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200092；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200011；3.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200031；4.上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海 200125；5.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所 上海 200125）

人工耳蝸被譽為目前最成功的生物醫(yī)學(xué)工程裝置，是重度和極重度感音神經(jīng)性聽力損失的幾乎唯一治療方式。最新數(shù)據(jù)顯示，全球人工耳蝸的裝機量超過60萬臺，但我國只有不足5萬臺，醫(yī)療缺口和發(fā)展需求巨大。而且隨著人工耳蝸植入（cochlear implantation,CI）手術(shù)操作的日趨完善和聲電技術(shù)的長足發(fā)展，CI手術(shù)的適應(yīng)證也在拓寬[1]，并越來越重視對殘余聽力的保留，加強聲電聯(lián)合刺激（electric acoustic stimulation,EAS）技術(shù)的應(yīng)用，進一步提高患者術(shù)后言語識別率和真實感，特別是對漢語這類聲調(diào)語言的使用者意義重大[2-3]。

但盡管國內(nèi)外對“柔手術(shù)”的概念深入人心，植入電極也不斷向更細、更軟的方向迭代，仍有報道指出30%～40%的患者術(shù)前殘余聽力在CI術(shù)后會立刻或逐漸喪失[4]，且與植入電極的類型無關(guān)[5]?？赡艿慕忉尦耸中g(shù)機械損傷外，還與術(shù)后炎癥反應(yīng)和內(nèi)耳纖維化[6]高度相關(guān)。因此，以地塞米松（dexamethasone,DXM）為代表的皮質(zhì)類固醇激素（簡稱激素）因具有強大的抗炎作用，在CI術(shù)后的殘余聽力保護方面已經(jīng)積累了大量的科研資料。而抗有絲分裂劑阿糖胞苷（aracytine，Ara-C）則可以有效抑制纖維組織增殖且不具有耳毒性[7]。本研究即在前期工作的基礎(chǔ)上[8]，制備了Ara-C緩釋模擬電極并成功構(gòu)建豚鼠耳蝸植入模型。繼而從聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR）閾值比較分析和基底膜培養(yǎng)兩方面進行了深入探究。

1 材料與方法

1.1 制備載藥模擬電極 采用直徑為0.2 mm的碳-氟纖維（上島，東陽）作為耳蝸植入模擬電極，根據(jù)筆者已經(jīng)發(fā)表的在電極表面用浸涂法制備高分子載藥薄膜的技術(shù)方案[8]，選取乙交酯丙交酯共聚物（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA,博立,深圳）為載體，以Ara-C（99%,Sigma,USA）為緩釋藥物，在模擬電極表面制備高分子緩釋載藥薄膜并用低溫等離子消毒。

1.2 實驗分組 健康白色豚鼠（斯萊克，上海）30只，雌性，體重（357±44）g，隨機分成3組，每組10只。陰性對照組無處理，陽性對照組植入PLGA模擬電極，實驗組植入Ara-C緩釋模擬電極。每個實驗組模擬電極上載藥20 μg。

1.3 構(gòu)建豚鼠耳蝸植入模型 所有手術(shù)操作均由同一位有經(jīng)驗的術(shù)者完成。豚鼠按30 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉生理鹽水溶液。麻醉滿意后，剃除術(shù)區(qū)毛發(fā)。豚鼠取側(cè)臥位，左耳朝上（所有模擬電極植入均為左耳），聚維酮碘消毒，局部皮下浸潤注射2%鹽酸利多卡因鎮(zhèn)痛。在左耳后溝中點外2 mm處向下弧形切開至左顳下頜關(guān)節(jié)上方。鈍性分離肌肉組織暴露乳突表面，以切割鉆稍磨即可突破。盡量擴大開口充分暴露耳蝸第1轉(zhuǎn)及圓窗龕，再以直徑0.5 mm金剛鉆（Medtronic，美國）低速于圓窗龕外側(cè)耳蝸第1轉(zhuǎn)側(cè)壁貼近基底部磨出骨窗，用探針挑開內(nèi)膜，即可見外淋巴液涌出。經(jīng)此處緩慢植入模擬電極，用肌肉組織封閉。生理鹽水沖洗后，滴入3滴氧氟沙星滴耳液預(yù)防感染。同樣方法暴露右側(cè)耳蝸，用鉤針將其破壞。

1.4 ABR的檢測 分別于耳蝸模擬電極植入術(shù)前和術(shù)后1 h、第7天、第14天、第28天和第90天檢測ABR閾值。ABR檢測儀（RZ6,Tucker-Davis Technologies,USA）刺激聲采用短純音，頻率為4、8、16、24、32 kHz，每一頻率的刺激聲強從90 dB SPL每隔5 dB SPL下降到20 dB SPL，疊加250次，在大概確定ABR波形消失的范圍后，在該聲強附近重復(fù)檢測，疊加1 000次以進一步驗證結(jié)果，并記錄ABR的閾值。豚鼠在戊巴比妥鈉麻醉下接受檢測，因?qū)?cè)耳蝸已破壞，故無需掩蔽。

1.5 影像學(xué)檢查 豚鼠耳蝸植入模擬電極后，用過量麻醉法處死。使用Micro CT（Skyscan 1176，比利時）掃描豚鼠顳骨，獲取影像學(xué)資料。

1.6 基底膜培養(yǎng) 取新生5 d的C57/B6小鼠（斯萊克，上海），用75%的乙醇浸泡消毒后，眼科剪斷頭并分離顳骨放入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中。在顯微鏡下用鑷子挑開蝸殼，分離螺旋韌帶，完整取下耳蝸基底膜并剪成大小相仿的片段。在16孔細胞培養(yǎng)板底部放置細胞爬片，加入250 μL含有10%胎牛血清（Biochrom，德國）的DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclon，美國），向每個孔中移入3～4個基底膜片段。培養(yǎng)24 h后棄液并加入1 mL培養(yǎng)基，同時向?qū)嶒灲M培養(yǎng)孔中加入載有Ara-C（80 μg）的PLGA薄膜（質(zhì)量約4 mg，面積約63 mm2）；對照組培養(yǎng)孔中加入同質(zhì)量和面積的空白PLGA薄膜。放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h換液1次，并在顯微鏡下觀察離體耳蝸基底膜的生長狀態(tài)，記錄成纖維細胞爬片半徑。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。用Mann WhitneyU檢驗比較實驗組與陽性、陰性對照組的ABR閾值差異。對基底膜體外培養(yǎng)中實驗組與對照組的成纖維細胞延伸半徑進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠耳蝸模擬電極植入 左耳后切口（圖1A）暴露豚鼠“乳突”（圖1B），磨開骨質(zhì)可見聽泡呈寬敞的橢圓形，內(nèi)表面覆蓋有薄而光滑的黏膜。內(nèi)側(cè)壁為耳蝸，圓窗面向鼓膜，第1轉(zhuǎn)朝向后上，蝸尖在前下（圖1C）。第1轉(zhuǎn)開窗植入模擬電極長度為8 mm左右（圖1D），若繼續(xù)向內(nèi)推進則阻力明顯增大且易造成蝸體和頂轉(zhuǎn)的損傷。整個手術(shù)過程約需30 min。

圖1 豚鼠耳蝸載藥模擬電極植入 A.左耳后切口；B.鈍性分離暴露“乳突”；C.磨除骨壁窺見圓窗龕并在耳蝸第1轉(zhuǎn)側(cè)壁開窗；D.模擬電極經(jīng)耳蝸開窗植入。

2.2 豚鼠術(shù)后影像學(xué)檢查 Micro CT圖像經(jīng)重建可清晰顯示豚鼠耳蝸矢狀、冠狀和橫截面，螺旋結(jié)構(gòu)清晰，骨螺旋板完整（圖2）。其中可見模擬電極顯影部分較細，整體位于蝸內(nèi)，覆蓋第1轉(zhuǎn)和部分第2轉(zhuǎn)。鼓室內(nèi)未見積液等異常密度影。

圖2 豚鼠耳蝸模擬電極植入后Micro CT影像 模擬電極顯像部分較細，在蝸內(nèi)呈高密度點狀影（箭頭）。A.左耳蝸橫截面；B.左耳蝸冠狀面；C.左耳蝸矢狀面。

2.3 豚鼠ABR檢測結(jié)果 不同組豚鼠各時期的ABR檢測結(jié)果顯示，陰性對照組豚鼠ABR閾值平均為（27.07±4.06）dB SPL（表1）。PLGA陽性對照組和實驗組豚鼠在模擬電極植入術(shù)后1 h出現(xiàn)全頻聽力損失，高頻（24、32 kHz）為65～75 dB SPL，中低頻（4、8、16 kHz）為45～55 dB SPL（表2、3）。隨著時間的推移，PLGA陽性對照組[0 d:（59.70±10.57）dB SPL；90 d:（64.60±9.47）dB SPL]ABR閾值出現(xiàn)繼發(fā)性升高（圖3）。而實驗組在4 kHz下，從術(shù)后第14天開始，其余頻率從術(shù)后第7天開始，ABR閾值與PLGA組相比均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.005，圖3）。且術(shù)后第90天時，在32 kHz頻率下實驗組ABR閾值較術(shù)后第7天進一步降低（P＜0.05）。而在其他頻率下，仍然維持了與術(shù)后第7天相似的ABR閾值。綜上所述，說明Ara-C的載藥方案發(fā)揮了顯著的殘余聽力保護作用，且這一獲益不需要藥物的長期作用維持。

表1 陰性對照組各時期的ABR檢測結(jié)果 單位：dB SPL

表2 PLGA陽性對照組術(shù)后各時期的ABR檢測結(jié)果 單位：dB SPL

表3 Ara-C組術(shù)后各時期的ABR檢測結(jié)果 單位：dB SPL

2.4 耳蝸基底膜體外培養(yǎng) 培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察基底膜貼壁生長良好，外周有新生上皮細胞、成纖維細胞長出（圖4A），高倍鏡下可見位于成纖維細胞內(nèi)圈的耳蝸毛細胞、支持細胞等結(jié)構(gòu)（圖4B）。向?qū)嶒灲M和對照組分別加入載藥或空白PLGA薄膜后繼續(xù)培養(yǎng)7 d，實驗組基底膜成纖維細胞爬片半徑[（90.6±16.1）μm，圖4C]較對照組[（219.6± 14.4）μm，圖4D]明顯減小，但內(nèi)圈毛細胞、支持細胞等結(jié)構(gòu)厚度[實驗組（27.1±4.9）μm，對照組（27.0±5.5）μm]未見明顯差異，提示Ara-C有效抑制了成纖維細胞的增殖，但對毛細胞、支持細胞等無明顯影響。

圖4 耳蝸基底膜培養(yǎng) A.第1個24 h貼壁生長良好；B.高倍鏡下可見上皮細胞及成纖維細胞區(qū)（a）、毛細胞區(qū)（b）以及支持細胞區(qū)（c）；C.實驗組加入載藥PLGA薄膜（X）培養(yǎng)7 d后成纖維細胞爬片半徑（r）；D.對照組加入空白PLGA薄膜培養(yǎng)7 d后成纖維細胞爬片半徑（R）。

3 討論

本研究基于已經(jīng)報道的一種快速制備耳蝸載藥電極的方法，選用PLGA作為載體，在耳蝸植入模擬電極的表面制備了載藥緩釋薄膜，隨模擬電極將藥物一同送進內(nèi)耳。這種遞藥方法比鼓室注射、內(nèi)耳注射、電極開槽等[9]更加簡單、有效且進一步實現(xiàn)了藥物的劑量調(diào)節(jié)和持續(xù)長期作用。

得益于豚鼠較大的聽泡結(jié)構(gòu)，植入手術(shù)采取了耳后徑路。需要注意的是，麻醉藥物戊巴比妥鈉的安全劑量范圍較窄，且腹腔注射給藥難以靈活控制血藥濃度，容易出現(xiàn)麻醉過深而引起呼吸抑制的情況。結(jié)合已有經(jīng)驗，2%的戊巴比妥鈉生理鹽水溶液按30 mg/kg的劑量，一次性腹腔注射，既可以獲得持續(xù)60～80 min的有效鎮(zhèn)靜，又不會影響ABR閾值的檢測[10]。

本研究中實驗組豚鼠耳蝸植入Ara-C緩釋模擬電極后，ABR閾值較對照組持續(xù)改善且在第28天以后，保持平穩(wěn)。一方面說明生物可降解的PLGA載藥薄膜設(shè)計降解周期為30 d左右，藥物釋放完全后隨著濃度的降低也不再繼續(xù)發(fā)揮作用；另一方面也說明Ara-C在術(shù)后1個月左右的時間里對殘余聽力的保護作用可以形成長久獲益，不依賴藥物維持。與已經(jīng)發(fā)表的DXM相關(guān)聽力保護作用的研究相比，Ara-C緩釋電極憑借其低濃度、低細胞毒性以及對成纖維細胞高效抑制作用而優(yōu)勢明顯。首先，激素類藥物的靜脈全身應(yīng)用，存在一系列副作用和禁忌人群[11]。其次，即使局部通過圓窗膜滲透給藥，也只能改善豚鼠高頻聽力（32 kHz）[12]。當然也有學(xué)者[13]使用含DXM的硅膠電極直接植入耳蝸，取得了良好的聽力保護效果，但Jia等[14]指出局部應(yīng)用DXM并不能逆轉(zhuǎn)電極植入帶來的遲發(fā)性聽力損失，這或許與高濃度DXM的神經(jīng)毒性有關(guān)。

若在分子水平上解釋Ara-C的作用機制，研究人員發(fā)現(xiàn)電極植入會刺激成纖維細胞、巨噬細胞釋放炎性因子和生長因子[13-14]，前者會進一步激活由MAPK/JNK介導(dǎo)的促凋亡級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致外毛細胞凋亡[15]；后者促進纖維組織的增生，導(dǎo)致電極周圍形成瘢痕。而經(jīng)典的抗有絲分裂藥物Ara-C可以抑制免疫細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1和成纖維細胞的增殖，從而抑制了內(nèi)耳纖維化[14]。

綜上所述，Ara-C可通過高分子薄膜搭載于耳蝸植入電極上，隨電極進入內(nèi)耳發(fā)揮CI術(shù)后殘余聽力的保護作用，效果可靠，優(yōu)勢突出?；诖四Ｊ剑磥砜衫^續(xù)探索更多單藥甚至復(fù)合載藥方案，提高EAS的治療效果，讓更多患者獲益。