長(zhǎng)期不同施肥模式對(duì)農(nóng)田黑土微生物群落構(gòu)建的影響

高 威，王連峰，賈仲君

(1.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116028)

《東北黑土地白皮書(2020)》顯示，東北黑土區(qū)總面積為109萬(wàn)km2，是我國(guó)重要的商品糧生產(chǎn)基地，貢獻(xiàn)了我國(guó)糧食總產(chǎn)量的1/4。黑土被認(rèn)為是所有土壤分類中最肥沃的土類。然而，過(guò)去幾十年，不良的農(nóng)田施肥管理模式導(dǎo)致黑土質(zhì)量退化嚴(yán)重[1]。長(zhǎng)期過(guò)度施用化肥引起土壤板結(jié)、土壤酸化、養(yǎng)分利用率低和環(huán)境污染等問(wèn)題，導(dǎo)致黑土質(zhì)量大幅度下降[1-2]。因此，如何保護(hù)“耕地中的大熊貓”，實(shí)現(xiàn)黑土質(zhì)量可持續(xù)已成為當(dāng)前熱點(diǎn)研究課題之一[3]。越來(lái)越多的研究表明，有機(jī)物料添加，如農(nóng)家有機(jī)肥、秸稈等，具有替代工業(yè)化肥的巨大潛力[4-5]。針對(duì)全球690個(gè)不同試驗(yàn)的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與單施化肥相比，施用有機(jī)肥可顯著提升27%的作物產(chǎn)量，土壤有機(jī)碳提升幅度更大，高達(dá)38%[6]。而無(wú)機(jī)化肥-有機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式不僅可以快速提升土壤肥力，增加作物產(chǎn)量，還可以緩解單施化肥對(duì)土壤質(zhì)量和生態(tài)環(huán)境造成的危害[7]。人們?cè)谥匾暡煌┓使芾砟Ｊ较峦寥牢锢砗突瘜W(xué)性質(zhì)演替的同時(shí)，長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤生物學(xué)性質(zhì)影響的研究也在不斷深入。例如，針對(duì)新西蘭606個(gè)樣點(diǎn)3 000多個(gè)土壤樣品細(xì)菌群落的分析結(jié)果表明，通過(guò)微生物群落組成的變化可以預(yù)測(cè)不同土地的利用情況，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)85%[8]。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)最敏感的指標(biāo)，參與了土壤質(zhì)量演替的全過(guò)程。因此，闡明不同施肥管理模式下土壤微生物群落構(gòu)建差異，對(duì)于預(yù)測(cè)土壤演替方向和優(yōu)化施肥管理具有參考價(jià)值。

不同施肥模式下土壤微生物群落構(gòu)建過(guò)程也可能遵循了生態(tài)學(xué)理論。然而，已有的生態(tài)學(xué)理論主要來(lái)自于動(dòng)物和植物宏觀生態(tài)學(xué)，經(jīng)典生態(tài)學(xué)理論在微生物群落構(gòu)建過(guò)程中的作用尚不清楚[9]。例如，確定性和隨機(jī)性過(guò)程被認(rèn)為是動(dòng)植物地理分異規(guī)律的重要驅(qū)動(dòng)力，但在土壤微生物群落構(gòu)建方面的上述相關(guān)研究?jī)H有少量報(bào)道[10]。確定性過(guò)程包括非生物和生物因素的生態(tài)選擇，這些因素影響微生物的適應(yīng)性，從而決定微生物群落組成和豐度[11]。相反，隨機(jī)性過(guò)程涉及不可預(yù)測(cè)的擾動(dòng)以及微生物隨機(jī)的出生、死亡和擴(kuò)散過(guò)程[12]。近年來(lái)，隨著統(tǒng)計(jì)技術(shù)的發(fā)展，研究確定性和隨機(jī)性過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)成為研究熱點(diǎn)[10,13]。最新的微生物群落構(gòu)建模型主要通過(guò)β MNTD和β NTI來(lái)表征。例如，β NTI用于比較在經(jīng)歷105年演替后土壤確定性和隨機(jī)性過(guò)程的變化，研究發(fā)現(xiàn)確定性過(guò)程主導(dǎo)了土壤生態(tài)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程，且高有機(jī)碳周轉(zhuǎn)則被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)土壤微生物群落構(gòu)建的關(guān)鍵因子[10]。而針對(duì)不同空間尺度微生物群落的構(gòu)建研究也發(fā)現(xiàn)，小空間尺度由于具有高度相似的管理模式從而導(dǎo)致較強(qiáng)的確定性過(guò)程[14]。然而，東北黑土較其他土壤類型更加復(fù)雜，且長(zhǎng)期不同施肥模式下外源輸入物料類型顯著不同。因此，在田塊尺度下，農(nóng)田黑土微生物群落構(gòu)建對(duì)于長(zhǎng)期不同施肥模式是如何響應(yīng)的，目前并不清楚。

據(jù)此，該研究以揭示長(zhǎng)期不同施肥模式對(duì)農(nóng)田黑土微生物群落構(gòu)建的影響機(jī)制為目標(biāo)，依托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部哈爾濱黑土生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)平臺(tái)，選擇代表性的4種施肥管理模式農(nóng)田土壤，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)，闡明長(zhǎng)期不同施肥管理模式土壤微生物數(shù)量和豐度的變化規(guī)律。利用微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)和群落構(gòu)建模型β NTI，解析長(zhǎng)期不同施肥管理模式土壤微生物群落構(gòu)建規(guī)律。通過(guò)差異物種分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)，明確長(zhǎng)期不同施肥管理模式土壤關(guān)鍵微生物功能群。通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型(structural equation model,SEM)將土壤理化性質(zhì)、關(guān)鍵微生物功能群和微生物群落構(gòu)建過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，揭示長(zhǎng)期不同施肥管理模式下農(nóng)田黑土微生物群落構(gòu)建機(jī)制。研究結(jié)果可為確立完善的農(nóng)田黑土施肥管理制度和助力黑土可持續(xù)健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品概況

研究區(qū)位于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部哈爾濱黑土生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站(45°40′ N，126°35′ E)，年均氣溫為4～5 ℃，年最高氣溫為34 ℃，年最低氣溫為-35 ℃，年降水量為450～650 mm。試驗(yàn)于1979年設(shè)置，1980年開始進(jìn)行小麥-大豆-玉米輪作。試驗(yàn)區(qū)土壤類型為黑土，由第四紀(jì)黃土狀沉積物發(fā)育形成。選取代表性的4個(gè)試驗(yàn)處理進(jìn)行土壤樣品分析，即：(1)長(zhǎng)期不施肥(CK)；(2)單施化肥(NPK)；(3)單施有機(jī)肥(OM)；(4)化肥-有機(jī)肥配施(MNPK)。在施肥量上，小麥和玉米為N 150 kg·hm-2，P2O575 kg·hm-2，K2O 75 kg·hm-2；大豆為N 75 kg·hm-2，P2O5150 kg·hm-2，K2O 75 kg·hm-2；有機(jī)肥為純馬糞，按氮量75 kg·hm-2(馬糞約18 600 kg·hm-2)施用。土壤樣品采集于2015年小麥?zhǔn)斋@季，每個(gè)處理隨機(jī)選取6個(gè)采樣點(diǎn)，采集0～20 cm新鮮土壤，去除細(xì)根及雜物，研磨并過(guò)2 mm孔徑篩，保存在4 ℃冰箱中待用。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤理化性質(zhì)用來(lái)表征不同施肥處理黑土養(yǎng)分的變化情況。主要理化指標(biāo)包括：土壤田間持水量(SWHC)、土壤pH、土壤總有機(jī)碳(SOC)、土壤全氮(TN)、銨態(tài)氮(NH4+)、硝態(tài)氮(NO3-)和有效磷(AP)。所用測(cè)定方法參見文獻(xiàn)[15-16]。SWHC測(cè)定采用環(huán)刀法；土壤pH測(cè)定采用pH計(jì)，V(水)∶m(土)=2.5∶1；SOC測(cè)定采用燃燒法；土壤TN測(cè)定采用碳氮元素分析儀(Vario Max CN, Germany)；土壤NH4+和NO3-測(cè)定采用2 mol·L-1KCl浸提后用流動(dòng)分析儀Skalar(San++System, Netherlands)測(cè)定。土壤AP通過(guò)0.3 mol·L-1鹽酸氟化氫銨提取，采用經(jīng)典的Bray法測(cè)定。

1.3 土壤微生物呼吸活性的測(cè)定

利用土壤CO2排放通量變化表征土壤微生物呼吸活性。具體操作如下：對(duì)于4種處理，每種處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱取6 g相當(dāng)于干土的新鮮土壤均勻平鋪于120 mL血清培養(yǎng)瓶底部，調(diào)節(jié)土壤含水量至40%土壤田間持水量，預(yù)培養(yǎng)24 h。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)土壤含水量至60%土壤田間持水量，通過(guò)高純氬氣反復(fù)沖刷培養(yǎng)瓶2 min后，注入高純空氣，28 ℃恒溫密封避光培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)0、1、4、7、10和14 d時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)瓶頂空氣體中CO2濃度，隨后立即置換高純空氣。CO2濃度采用氣相色譜儀(Agilent 7890，USA)測(cè)定。CO2累積排放量計(jì)算公式為

F=△C×V×ρ/m×273/T。

(1)

式(1)中，F(xiàn)為CO2累積排放量，μg·g-1；△C為CO2濃度變化量，10-6；V為培養(yǎng)瓶體積，L；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下CO2密度，g·L-1；m為干土質(zhì)量，g；T為培養(yǎng)溫度，K。

1.4 土壤總DNA提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Miseq高通量測(cè)序

土壤微生物總DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil(MP Bio，美國(guó))試劑盒提取，具體操作參考試劑盒使用指南。土壤DNA質(zhì)量和純度采用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000，USA)測(cè)定。提取的土壤DNA保存于-20 ℃條件下待用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)測(cè)定16S rRNA基因拷貝數(shù)以表征土壤細(xì)菌數(shù)量。16S rRNA基因定量的通用引物為515F/907R[17]。利用nifH基因拷貝數(shù)表征功能固氮菌數(shù)量，nifH基因定量的通用引物為polF/polR[18]。具體操作參見文獻(xiàn)[16]，16S rRNA基因和nifH基因的擴(kuò)增效率分別為97.2%和99.3%。進(jìn)一步通過(guò)16S rRNA基因的Miseq高通量測(cè)序分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。16S rRNA基因V4-V5區(qū)擴(kuò)增通用引物為515F/907R[17]。50 μL PCR反應(yīng)體系包括：25 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、1 μL正反向引物(50 μmol·L-1)、2.5 μL DNA模板以及20.5 μL無(wú)菌雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃條件下預(yù)變性3 min；95 ℃條件下變性30 s，55 ℃條件下退火30 s，72 ℃條件下延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃條件下延伸10 min。獲得16S rRNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物后，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0試劑盒(TaKaRa Biotech，Dalian，China)進(jìn)行切膠純化，并將純化產(chǎn)物溶于無(wú)菌雙蒸水中。測(cè)定濃度后進(jìn)行等質(zhì)量混合，最后進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。建庫(kù)試劑盒為VAHTSTM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina?，測(cè)序試劑盒為MiSeq Reagent Kit v3。所有24個(gè)樣本Miseq高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)均提交到NCBI網(wǎng)站的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索號(hào)為SRP282507(SRR12648880-SRR12648903)。

1.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析和關(guān)鍵微生物功能群鑒定

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析主要借助QIIME軟件完成，分析步驟參見文獻(xiàn)[16]。具體地，首先通過(guò)“join_paired_ends.py”指令合并雙端測(cè)序文件，通過(guò)“extract_barcodes.py”指令去除測(cè)序接頭。然后，去除序列片段長(zhǎng)度<200 bp、質(zhì)量控制參考值<25、無(wú)法匹配的低質(zhì)量序列，并通過(guò)USEARCH61去除嵌合體，共計(jì)獲得495 169條高質(zhì)量序列。所有高質(zhì)量序列進(jìn)一步通過(guò)UCLUST算法以97%的相似度聚類成OTU。最后，與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥rdp.cme.msu.edu)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)樣品的物種組成。

微生物多樣性主要通過(guò)Alpha和Beta多樣性指數(shù)構(gòu)建。進(jìn)行多樣性分析之前，先通過(guò)goods coverage指數(shù)(0.976～0.988)評(píng)估微生物多樣性覆蓋度，并通過(guò)稀釋曲線Rarefaction curves驗(yàn)證測(cè)序深度。Alpha多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)(豐富度)和Shannon指數(shù)(均勻度)等，通過(guò)“collate alpha”指令完成。Beta多樣性通過(guò)PCoA(principal co-ordinates analysis)反映微生物群落組成的變化情況，PCoA計(jì)算通過(guò)R語(yǔ)言Vegan軟件包完成。

將關(guān)鍵微生物功能群(keystone phylotypes)作如下定義：在OTU分類水平上，與不施肥(CK)處理相比，長(zhǎng)期不同施肥管理模式下土壤微生物豐度發(fā)生顯著增加的生物標(biāo)志物(biomarker)。這部分微生物被認(rèn)為在長(zhǎng)期土壤培肥過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。關(guān)鍵微生物功能群的鑒定采用經(jīng)典的差異物種分析方法，具體步驟參考Galaxy在線分析平臺(tái)(http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。

1.6 微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、群落構(gòu)建分析和結(jié)構(gòu)方程模型構(gòu)建

生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：首先，剔除微生物類群(OTUs)豐度低于0.1/100的低豐度類群，并利用R語(yǔ)言的corr.test函數(shù)計(jì)算OTUs之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，得到相關(guān)性系數(shù)矩陣和P值矩陣，Spearman相關(guān)系數(shù)和P值的閾值分別設(shè)定為0.7和0.05。然后，通過(guò)Gephi軟件構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)代表一個(gè)OTU，各節(jié)點(diǎn)間的連接線(edge)代表各菌群之間的相關(guān)性。最后，通過(guò)Gephi軟件中的Analyzer工具計(jì)算生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)、網(wǎng)絡(luò)密度、聚類系數(shù)、度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

微生物群落構(gòu)建過(guò)程：主要通過(guò)基于零模型的微生物群落構(gòu)建參數(shù)β NTI來(lái)表征確定性過(guò)程和隨機(jī)性過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)，具體分析參見文獻(xiàn)[10,16]。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，當(dāng)β NTI> 2和β NTI<-2時(shí)，分別表示確定性過(guò)程的異質(zhì)性選擇和同質(zhì)性選擇占主導(dǎo)，而|β NTI|<2表示隨機(jī)性過(guò)程占主導(dǎo)。為了進(jìn)一步區(qū)分不同隨機(jī)性過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)，引入RCbray。當(dāng)|β NTI|<2且RCbray<-0.95時(shí)，表示隨機(jī)性過(guò)程的同質(zhì)化擴(kuò)散占主導(dǎo)；當(dāng)|β NTI|<2且RCbray>0.95時(shí)，表示隨機(jī)性過(guò)程的擴(kuò)散限制占主導(dǎo)。

結(jié)構(gòu)方程模型構(gòu)建：結(jié)構(gòu)方程模型的基本假設(shè)為長(zhǎng)期施肥直接或者間接改變了土壤養(yǎng)分狀況和微生物群落構(gòu)建過(guò)程，進(jìn)而提升了土壤有機(jī)碳含量。該模型中，土壤呼吸通過(guò)土壤CO2排放量來(lái)表征，群落組成通過(guò)PCoA1來(lái)表征，多樣性通過(guò)Shannon指數(shù)來(lái)表征。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0完成。理化參數(shù)處理之間的差異采用SPSS 22.0軟件包完成(SPSS Inc.，Cary，NC，USA)，P<0.05表示差異顯著。微生物類群差異通過(guò)LEfSe分析完成。采用Heml軟件繪制Heatmaps，采用Origin軟件(OriginPro 2016， USA)繪制其他圖表。采用SPSS AMOS 21.0軟件分析構(gòu)建SEM。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥管理模式下黑土主要性狀的演替規(guī)律

表1顯示，長(zhǎng)期不同施肥管理均顯著提升SOC含量。土壤TN含量也呈類似變化趨勢(shì)。與CK相比，MNPK處理土壤TN含量增幅最大，為33.1%，而NPK和OM處理則分別增加15.4%和7.7%。土壤NH4+、NO3-和AP含量均呈類似變化規(guī)律。與CK相比，MNPK處理NO3-和AP含量分別增加8.43和8.48倍。值得注意的是，長(zhǎng)期施用NPK導(dǎo)致土壤出現(xiàn)一定程度的酸化，NPK處理土壤pH顯著低于CK處理，而長(zhǎng)期施用MNPK則在一定程度上緩解了土壤pH的下降。此外，MNPK處理土壤持水性能也發(fā)生顯著提升。

土壤微生物數(shù)量是表征土壤肥力狀況的重要生物學(xué)指標(biāo)?；?6S rRNA基因的qPCR分析表明，長(zhǎng)期施肥管理顯著增加土壤微生物數(shù)量(表1)。與CK相比，NPK、OM和MNPK處理16S rRNA基因拷貝數(shù)增幅分別達(dá)5.81%、24.4%和8.14%。就功能固氮類群而言，長(zhǎng)期施用OM和MNPK導(dǎo)致土壤nifH固氮基因數(shù)量顯著升高，而NPK處理nifH基因數(shù)量有所降低。同時(shí)，長(zhǎng)期施肥管理顯著影響微生物多樣性。施用NPK導(dǎo)致土壤微生物多樣性顯著降低。與CK相比，NPK處理微生物Chao1指數(shù)降低16.1%，而MNPK處理Chao1指數(shù)降幅有所減緩，為14.0%。上述結(jié)果表明，長(zhǎng)期施用有機(jī)-無(wú)機(jī)肥的平衡施肥管理模式(MNPK)不僅可以提升土壤肥力，而且在一定程度上減緩了單施化肥對(duì)土壤功能微生物數(shù)量和多樣性的危害。

表1 長(zhǎng)期不同施肥管理黑土基本理化和微生物性質(zhì)

2.2 長(zhǎng)期不同施肥管理模式對(duì)黑土微生物呼吸活性和群落組成的影響

土壤微生物呼吸是表征土壤微生物活性的重要參數(shù)，對(duì)于指示土壤有機(jī)碳周轉(zhuǎn)具有重要參考意義。土壤CO2動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，長(zhǎng)期不同施肥管理均顯著提升土壤微生物基礎(chǔ)呼吸，且有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式下土壤微生物呼吸活性最強(qiáng)(圖1)。

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)14 d，CK土壤CO2累積排放量(以C計(jì))為186.9 μg·g-1，NPK、OM和MNPK處理分別為210.6、218.7和228.7 μg·g-1，增幅分別為12.7%、17.0%和22.4%。不同施肥管理土壤微生物呼吸活性由低到高依次為CK

基于16S rRNA基因高通量測(cè)序分析表明，長(zhǎng)期施肥管理導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯分異。CK與OM處理土壤微生物群落表現(xiàn)出一定的相似性，而長(zhǎng)期NPK和MNPK施肥則顯著改變微生物群落結(jié)構(gòu)(圖1)。在微生物分類門水平上，CK優(yōu)勢(shì)微生物門為變形菌門(Proteobacteria，41.9%)和酸桿菌門(Acidobacteria，14.1%)，OM處理也為變形菌門(38.2%)和酸桿菌門(16.3%)，而NPK處理為變形菌門(42.9%)和厚壁菌門(Firmicutes，15.4%)，MNPK處理為變形菌門(43.7%)和厚壁菌門(21.1%)。在微生物分類屬水平上，這種趨勢(shì)更加明顯。CK優(yōu)勢(shì)微生物屬為藤黃單孢菌屬(Luteimonas，11.5%)、酸桿菌Gp6(Acidobacteria_Gp6，5.4%)和芽孢桿菌屬(Bacillus，4.6%)，OM處理為藤黃單孢菌屬(7.1%)、酸桿菌Gp6(7.8%)和芽孢桿菌屬(6.4%)，而NPK處理為芽孢桿菌屬(7.1%)、戴氏菌屬(Dyella，7.8%)和酸桿菌Gp3(Acidobacteria_Gp3，6.4%)，MNPK處理為芽孢桿菌屬(8.5%)和戴氏菌屬(6.1%)。

2.3 長(zhǎng)期不同施肥管理模式對(duì)黑土微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)特征和群落構(gòu)建過(guò)程的影響

微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于解釋物種共存和維持物種多樣性至關(guān)重要。結(jié)果表明，長(zhǎng)期NPK施肥管理導(dǎo)致微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)更松散，且微生物類群間正向網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度顯著降低，而長(zhǎng)期施用OM，尤其是施用MNPK導(dǎo)致土壤微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度更緊密，且微生物類群間正向網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度明顯提升〔圖2(a)〕。

CK處理共發(fā)現(xiàn)4 946條共存網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)曲線，其中，正向關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)占比為82.8%，而NPK處理正向關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)占比僅為78.4%(3 276/4 181)。相比較而言，OM處理正向關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)有所增加，為97.4%(4 815/4 945)，而MNPK處理正向關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)占比最高，達(dá)99.6%(4 935/4 954)。這表明長(zhǎng)期有機(jī)-無(wú)機(jī)肥平衡施肥管理模式有助于土壤微生物共存，對(duì)于土壤功能的維持和穩(wěn)定具有重要意義。

圖2(b)表明，長(zhǎng)期施肥管理導(dǎo)致土壤微生物群落構(gòu)建確定性過(guò)程占比增加，主要為同質(zhì)化選擇的確定性過(guò)程。CK處理確定性過(guò)程占比為33.3%，而NPK處理確定性過(guò)程占比顯著增加，為53.3%，且由CK處理的異質(zhì)化選擇過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)镹PK處理的同質(zhì)化選擇過(guò)程。類似地，OM處理同質(zhì)化選擇過(guò)程占比為46.7%，而長(zhǎng)期MNPK施肥管理導(dǎo)致土壤微生物群落構(gòu)建確定性過(guò)程顯著增強(qiáng)，其同質(zhì)化選擇過(guò)程占比高達(dá)66.7%。上述結(jié)果表明，長(zhǎng)期施肥管理導(dǎo)致微生物類群定向富集，并構(gòu)建了穩(wěn)定的土壤微生物區(qū)系。

2.4 不同施肥模式黑土關(guān)鍵微生物功能群分析

長(zhǎng)期不同施肥管理土壤關(guān)鍵微生物功能群鑒定結(jié)果見圖3。

通過(guò)經(jīng)典的差異物種分析方法，進(jìn)一步明確不同施肥管理模式下農(nóng)田黑土關(guān)鍵微生物功能群。關(guān)鍵微生物功能群定義：與不施肥CK相比，長(zhǎng)期施肥管理模式下土壤微生物豐度發(fā)生顯著增加的類群。16S rRNA基因的高通量測(cè)序共計(jì)檢測(cè)出2 559個(gè)OTUs，其中，僅有2.77%的微生物類群(71/2 559)豐度發(fā)生顯著性上調(diào)，被稱為關(guān)鍵微生物功能群(圖3)。

結(jié)果表明，長(zhǎng)期不同施肥管理模式導(dǎo)致黑土關(guān)鍵微生物功能群發(fā)生明顯分異(圖3)。71個(gè)關(guān)鍵微生物功能群中，僅發(fā)現(xiàn)9個(gè)OTUs在不同施肥管理模式下均發(fā)生顯著性增加，主要包括OTU4(Bacillusmegaterium)、OTU24(Tumebacillusluteolus)和OTU58(Devosiainsulae)。而高達(dá)87.3%(62/71)的關(guān)鍵微生物類群具有明顯的生態(tài)位分化。例如，共計(jì)23個(gè)關(guān)鍵微生物功能群必須在有機(jī)肥存在的施肥管理模式下才發(fā)生顯著增加，主要包括OTU11(Bacillusacidiceler)、OTU10(Bacillusdrentensis)和OTU13(Streptomycesmutabilis)，這部分微生物類群適應(yīng)于復(fù)雜的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。而高達(dá)35個(gè)關(guān)鍵微生物類群必須在無(wú)機(jī)肥存在的施肥管理模式下才發(fā)生顯著增加，主要包括OTU2(Dyellamarensis)、OTU1326(Herbaspirillumsp.)和OTU5(Tuberibacilluscalidus)，這部分微生物類群對(duì)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境比較敏感。此外，僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)關(guān)鍵微生物類群只在MNPK處理土壤中顯著增加，包括OTU43(Armatimonadetes_gp4)、OTU26(Sphingomonaschangbaiensis)、OTU63(Pirellulastaleyi)和OTU38(Microbisporarosea)，與CK相比，MNPK處理這4個(gè)類群豐度分別增加2.30、0.78、2.44和1.79倍。這部分類群對(duì)環(huán)境要求較高，適應(yīng)于有機(jī)-無(wú)機(jī)配施的營(yíng)養(yǎng)均衡環(huán)境中。

長(zhǎng)期不同施肥管理模式導(dǎo)致功能硝化微生物發(fā)生明顯的生態(tài)位分化(圖4)。長(zhǎng)期單施有機(jī)肥管理更有利于氨氧化古菌(AOA，Nitrososphaera)的生長(zhǎng)，而長(zhǎng)期單施化肥或者有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施管理則更有利于氨氧化細(xì)菌(AOB，Nitrosospira)的生長(zhǎng)。就優(yōu)勢(shì)的AOA而言，OM處理增加，而NPK和MNPK處理均顯著降低。OM處理AOA相對(duì)豐度為0.10%，而NPK和MNPK處理其相對(duì)豐度僅為0.011%和0.014%，OM處理分別為NPK和MNPK處理的9.1和7.1倍。與CK相比，NPK和MNPK處理優(yōu)勢(shì)的AOB相對(duì)豐度均顯著增加，而OM處理無(wú)顯著變化。而針對(duì)亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB，Nitrospira)，長(zhǎng)期不同施肥均未促進(jìn)其生長(zhǎng)，反而在長(zhǎng)期NPK和MNPK施肥管理模式下顯著降低。

2.5 不同施肥管理模式黑土理化性質(zhì)與微生物群落特征相互關(guān)系比較分析

通過(guò)SEMs進(jìn)一步探究長(zhǎng)期不同施肥管理模式下土壤養(yǎng)分狀況和微生物群落構(gòu)建過(guò)程是如何直接或者間接影響SOC累積。SEMs對(duì)SOC累積的解釋度高達(dá)95%以上(圖5)。研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期施肥模式下微生物區(qū)系活性與土壤肥力呈顯著正相關(guān)，其在NPK、OM和MNPK處理的綜合效應(yīng)分別高達(dá)97.3%、91.7%和98.6%。但長(zhǎng)期不同施肥管理模式下不同環(huán)境因子和不同微生物群落構(gòu)建過(guò)程對(duì)SOC含量提升的作用機(jī)制不同。長(zhǎng)期單施化肥管理模式主要通過(guò)改變土壤呼吸作用、有效磷的供應(yīng)和土壤微生物多樣性，以提升SOC含量〔圖5(a)〕。長(zhǎng)期單施有機(jī)肥管理模式則主要通過(guò)改變土壤呼吸作用、土壤微生物群落構(gòu)建和核心物種Bacillus以加速SOC累積〔圖5(b)〕。而長(zhǎng)期有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式下SOC含量的提升受土壤微生物呼吸、土壤有效磷的供應(yīng)以及微生物群落多樣性和組成等多個(gè)環(huán)境因子的共同作用調(diào)控〔圖5(c)〕。

3 討論

3.1 長(zhǎng)期不同施肥管理模式對(duì)黑土理化和微生物性質(zhì)的影響

合理的施肥管理措施是助力農(nóng)田黑土肥力提升、保障黑土可持續(xù)健康發(fā)展的重要途徑。筆者研究結(jié)果表明，有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式有利于黑土肥力的快速提升和微生物功能的穩(wěn)定。目前，基于長(zhǎng)期單施化肥或者單施有機(jī)肥的管理模式下土壤理化和微生物性狀的變化研究較為深入，而針對(duì)有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施管理下土壤肥力與土壤微生物活性、群落穩(wěn)定性以及群落構(gòu)建關(guān)聯(lián)研究鮮有報(bào)道。例如，通過(guò)為期21年的生物有機(jī)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)地塊中土壤肥力的增強(qiáng)和生物多樣性的持續(xù)性增加，一方面維持了作物產(chǎn)量，另一方面減少了對(duì)外部環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)依賴[5]。而通過(guò)全球?qū)嶒?yàn)的薈萃分析也發(fā)現(xiàn)，與單施化肥相比，施用有機(jī)肥可大幅度提升作物產(chǎn)量和土壤有機(jī)碳含量，有機(jī)培肥管理模式可以通過(guò)改變碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素激活相關(guān)的微生物胞外酶活性來(lái)加速土壤有機(jī)質(zhì)的累積[6]。筆者研究也得到類似結(jié)果。不僅如此，有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥模式同時(shí)緩解了土壤酸化，極大地提升了土壤肥力，維持了土壤微生物功能穩(wěn)定，其對(duì)土壤質(zhì)量的提升效果明顯優(yōu)于單施化肥以及單施有機(jī)肥管理模式。值得注意的是，長(zhǎng)期單施化肥導(dǎo)致土壤固氮菌數(shù)量顯著下降，可能是由于外源無(wú)機(jī)氮的引入削弱了土壤固氮微生物的固氮作用，而長(zhǎng)期有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施或有機(jī)培肥管理模式均顯著促進(jìn)固氮微生物生長(zhǎng)(表1)，這是因?yàn)榇罅坑袡C(jī)物料的投入導(dǎo)致土壤碳氮比顯著升高，固氮微生物則通過(guò)生物固氮作用補(bǔ)充氮素，進(jìn)而維持土壤穩(wěn)定的碳氮比[19]。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)土壤微生物呼吸活性與土壤有機(jī)碳的變化規(guī)律較為一致。而SEMs進(jìn)一步證實(shí)，土壤微生物呼吸能夠較好地反映土壤肥力狀況，且微生物通過(guò)增加相互作用強(qiáng)度進(jìn)而維持微生物功能(圖5)。這些結(jié)果暗示微生物對(duì)土壤質(zhì)量的積極作用，同時(shí)也說(shuō)明微生物性狀指標(biāo)，如微生物呼吸、微生物數(shù)量和微生物關(guān)聯(lián)度等，可以較好地解釋土壤肥力狀況。因此，在未來(lái)土壤質(zhì)量監(jiān)測(cè)中可以考慮納入微生物指標(biāo)，例如微生物呼吸活性、微生物數(shù)量等，從而更全面地認(rèn)識(shí)土壤質(zhì)量狀況，并為生態(tài)系統(tǒng)中有效的施肥管理提供重要依據(jù)。

3.2 長(zhǎng)期不同施肥管理模式下黑土關(guān)鍵微生物功能群

施肥管理通過(guò)外源輸入物料，使有限資源中的優(yōu)勢(shì)類群得以生長(zhǎng)繁殖。因此，筆者研究通過(guò)比較不同施肥管理模式下核心物種差異，可為預(yù)測(cè)土壤演替方向、助力黑土定向培肥提供參考。已有研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期無(wú)機(jī)化肥施肥管理導(dǎo)致土壤微生物群落發(fā)生明顯變化[20]。筆者研究結(jié)果與之一致，即長(zhǎng)期NPK施肥管理模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同于CK。值得注意的是，筆者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用OM處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與CK高度相似(圖1)。這一結(jié)果表明，有機(jī)培肥管理有利于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，主要原因是外源有機(jī)物料的營(yíng)養(yǎng)供給相對(duì)較慢，對(duì)土壤環(huán)境擾動(dòng)相對(duì)較小，從而導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)變異不明顯。而長(zhǎng)期有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施土壤微生物類群類似于長(zhǎng)期單施化肥處理，這表明與有機(jī)肥相比，化肥對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響更大。盡管如此，筆者仍然發(fā)現(xiàn)一部分類群在所有不同施肥管理模式下均大量富集，例如，OTU4高度相似于Bacillusmegaterium，其可以通過(guò)降解土壤中難溶的含磷化合物為作物提供養(yǎng)分。同時(shí)也有報(bào)道認(rèn)為，巨大芽孢桿菌與根瘤菌混合培養(yǎng)時(shí)具有固氮增效作用，非常適合于制成微生物肥料[21]。而OTU24高度相似于Tumebacillusluteolus，普遍存在于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中[22]。這類微生物對(duì)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)要求較低，適應(yīng)能力極強(qiáng)，可以作為未來(lái)菌種資源挖掘的重要突破口。然而，絕大部分核心菌群具有完全分化的生態(tài)位特征，這為識(shí)別不同施肥模式下的指示物種提供了很好的借鑒。例如，OTU2(Dyellamarensis)和OTU1326(Herbaspirillumsp.)對(duì)無(wú)機(jī)氮磷鉀肥的響應(yīng)非常迅速，這類菌群屬于典型的r-型菌，因此，更容易在長(zhǎng)期無(wú)機(jī)肥施肥管理土壤中生長(zhǎng)[23]。而OTU11(Bacillusacidiceler)和OTU10(Bacillusdrentensis)屬于植物根際促生菌，可以通過(guò)降解土壤中難溶的含磷化合物為作物提供養(yǎng)分，屬于典型的K-型菌，這類微菌群對(duì)環(huán)境底物的利用能力較強(qiáng)，因此，容易在長(zhǎng)期有機(jī)物料存在的土壤中富集[23]。

長(zhǎng)期不同施肥也導(dǎo)致功能硝化微生物發(fā)生明顯的生態(tài)位分異。在長(zhǎng)期施用OM土壤中AOA相對(duì)豐度較高，而其在長(zhǎng)期施用NPK和MNPK土壤中顯著下降(圖4)。這意味著長(zhǎng)期施用化肥會(huì)導(dǎo)致氨氧化古菌功能逐漸喪失。與之相反，NPK和MNPK處理AOB相對(duì)豐度均顯著增加，而長(zhǎng)期施用OM處理其豐度較低。筆者之前的研究結(jié)果與之一致，即細(xì)菌是農(nóng)田氨氧化過(guò)程的主要作用者，長(zhǎng)期施用化肥會(huì)導(dǎo)致土壤氨氧化細(xì)菌顯著增加[24]。AOA和AOB的生態(tài)位分化受土壤pH影響顯著。有研究表明，AOA基因表達(dá)量一般隨著pH的增加而增加，而AOB基因表達(dá)量一般隨著pH的增加而減少[25]。必須強(qiáng)調(diào)的是，盡管筆者研究通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分類解析了不同施肥管理模式下關(guān)鍵的微生物功能群，但是其生理生化意義有限。事實(shí)上，同一屬的多個(gè)物種的功能表型可能完全不同[26]，而且微生物的存在并不代表微生物的功能。因此，未來(lái)的研究應(yīng)同時(shí)開展同位素示蹤和分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，從多個(gè)角度多個(gè)方面解析不同施肥管理模式下土壤核心物種的生理生化特征，為黑土定向培肥提供更重要的參考。

3.3 長(zhǎng)期不同施肥管理模式對(duì)黑土微生物群落構(gòu)建的影響

微生物群落構(gòu)建機(jī)制研究對(duì)于預(yù)測(cè)黑土演替方向和黑土定向培肥具有重要意義。目前，主流的觀點(diǎn)認(rèn)為，土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)速率是土壤微生物群落構(gòu)建的關(guān)鍵因子[10,27]。筆者前期的研究結(jié)果表明，在高有機(jī)碳周轉(zhuǎn)的草地和農(nóng)田土壤中，其確定性過(guò)程顯著高于低有機(jī)碳周轉(zhuǎn)的堿地，并且高有機(jī)碳周轉(zhuǎn)是導(dǎo)致土壤確定性過(guò)程增加的關(guān)鍵因子[16]。筆者研究結(jié)果與之具有相似之處，長(zhǎng)期施肥管理在提升土壤肥力的同時(shí)，強(qiáng)化了土壤微生物群落構(gòu)建的確定性過(guò)程。不僅如此，筆者還發(fā)現(xiàn)，微生物群落構(gòu)建過(guò)程與施肥類型緊密相關(guān)，且單施無(wú)機(jī)肥處理土壤微生物確定性過(guò)程顯著高于有機(jī)肥處理(圖2)。由于無(wú)機(jī)肥的投入能夠提供大量易利用底物，此時(shí)r-型菌處于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致核心微生物定向富集而強(qiáng)化群落組裝的確定性過(guò)程；而有機(jī)肥處理土壤易利用底物水平相對(duì)較低，微生物類群對(duì)環(huán)境資源的競(jìng)爭(zhēng)更大，從而使得微生物定向富集的作用有所減弱。此外，筆者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不施肥土壤微生物群落構(gòu)建確定性過(guò)程占比高達(dá)33.3%，這是由于黑土本身的肥力較高，微生物群落定向富集過(guò)程依然存在。而微生物共存網(wǎng)絡(luò)也表明，單施有機(jī)肥土壤微生物正向網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度明顯高于單施化肥處理。這進(jìn)一步解釋了有機(jī)培肥管理對(duì)土壤微生物群落穩(wěn)定性的維持具有重要作用，這與前人的報(bào)道[28]一致。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)無(wú)論是微生物關(guān)聯(lián)度，還是正向網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度，有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施處理均顯著高于其他施肥處理，這說(shuō)明有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式能夠提供更加均衡的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，也更有利于維持土壤功能菌群的長(zhǎng)期穩(wěn)定。

微生物是調(diào)控土壤養(yǎng)分循環(huán)的主角，而土壤養(yǎng)分的變化反過(guò)來(lái)也會(huì)塑造不同土壤特定的微生物群落[28]。它們之間的直接或者間接作用關(guān)系很難通過(guò)常規(guī)分析手段來(lái)闡明。筆者通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型則能夠很好地將微生物類群與土壤養(yǎng)分變化建立聯(lián)系。結(jié)果表明，長(zhǎng)期不同施肥管理模式下環(huán)境因子和微生物群落構(gòu)建過(guò)程對(duì)土壤有機(jī)碳含量提升的作用機(jī)制明顯不同(圖5)。長(zhǎng)期單施化肥管理模式由于提供了微生物易利用底物，則更多地影響微生物活性，而長(zhǎng)期單施有機(jī)肥管理模式由于提供了復(fù)雜的有機(jī)物料，則強(qiáng)化了微生物群落構(gòu)建和核心物種的重要作用。而長(zhǎng)期有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式提供了相對(duì)均衡的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，受環(huán)境多因子的調(diào)控。盡管筆者研究并未設(shè)置多種有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配比處理，但是將土壤肥力演替和微生物群落構(gòu)建過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，從微生物群落構(gòu)建角度，提供了有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施的平衡施肥管理模式有助于土壤質(zhì)量穩(wěn)定發(fā)展的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

4 結(jié)論

綜上所述，長(zhǎng)期不同施肥管理模式引起土壤有機(jī)碳含量、有效磷含量和土壤結(jié)構(gòu)等發(fā)生明顯變化，這些因素直接或間接地作用于土壤微生物并改變其生理活性，進(jìn)而影響土壤有機(jī)質(zhì)的累積及周轉(zhuǎn)過(guò)程。長(zhǎng)期有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施管理模式下土壤有機(jī)碳含量、土壤微生物活性以及微生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性等土壤質(zhì)量指標(biāo)均明顯優(yōu)于單施化肥和單施有機(jī)肥。這些結(jié)果表明，有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施管理模式更有利于提升土壤肥力和維持微生物功能的穩(wěn)定。結(jié)合微生物群落構(gòu)建也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施肥導(dǎo)致微生物類群定向富集而強(qiáng)化了群落組裝的確定性過(guò)程。NPK和MNPK處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)更為相似，核心類群主要包括Bacillus和Dyella這2個(gè)屬，而OM處理核心類群為Bacillus。就土壤硝化微生物而言，施用OM土壤中氨氧化古菌AOA相對(duì)豐度較高，而施用NPK和MNPK土壤中AOB顯著富集。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了有機(jī)-無(wú)機(jī)肥配施管理模式的重要意義，為今后農(nóng)田黑土合理施肥管理提供參考。