中國傳統(tǒng)食品中丙烯酰胺的檢測方法及控制措施

蘇長順， 薛 鵬， 張 淼， 武新雨， 袁 媛

（ 吉林大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 吉林 長春 130062）

0 引言

丙烯酰胺（Acrylamide， AA） 為無色透明片狀晶體， 易溶于水、 乙醇， 微溶于苯、 甲苯， 其毒性主要包括神經(jīng)毒性、 遺傳毒性、 生殖毒性、 免疫毒性及致癌性等[1]。 自2002 年在油炸薯片中發(fā)現(xiàn)高水平的AA 開始， 由AA 引起的食品安全問題已引起人們的高度關(guān)注。 聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會在第64 次、 72 次會議上2 次對AA 的安全問題進(jìn)行評估并向公眾警示， 在保證做熟的情況下盡量避免過度烹飪食品， 同時(shí)應(yīng)注重平衡膳食， 減少油炸和高脂肪食品的攝入， 以確保食品安全[2]。

中國傳統(tǒng)膳食由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和加工方式， 可能會產(chǎn)生AA 等危害化合物。 因此， 闡明中國傳統(tǒng)食品中AA 等的形成機(jī)制、 影響因素及控制措施， 對于進(jìn)一步加強(qiáng)中國傳統(tǒng)食品的安全性具有重要意義。

1 不同種類傳統(tǒng)食品中AA 的含量

1.1 中國傳統(tǒng)膳食結(jié)構(gòu)

中國傳統(tǒng)膳食結(jié)構(gòu)以植物性食物為主， 主食為糧谷類食品（ 米、 面、 薯類等） ， 輔以各種新鮮的天然食品（ 水果、 蔬菜、 少量動物性食物等） ， 豆類及豆制品也占有重要位置。 肉類以豬肉和雞鴨肉為主，牛羊肉食用量較少， 近海地區(qū)魚蝦攝入占比較高。烹調(diào)方法以蒸、 炒、 燉為主， 在中外飲食文化交流中， 熏、 烤、 煎、 炸等烹調(diào)方法逐漸增多[3]， 烹調(diào)形式的多樣性也決定了中國傳統(tǒng)食品中AA 含量的多變性。

1.2 傳統(tǒng)食品中AA 含量

傳統(tǒng)淀粉類食品中以煎炸方式烹調(diào)產(chǎn)生的AA 量高于蒸煮方式； 加工肉制品中AA 的含量范圍為83～386 μg/kg， 且不同部位含量差別較大； 水產(chǎn)品中AA 的含量范圍為36～148 μg/kg； 炒制蔬菜中AA 的含量范圍為＜10～360 μg/kg。

中國傳統(tǒng)食品中AA 分布情況[4-15]見表1。

表1 中國傳統(tǒng)食品中AA 分布情況/μg·kg-1

在不同傳統(tǒng)食品中， AA 含量主要受食物種類、加工或烹調(diào)方式的影響。 由表1 可知， 在谷物、 蔬菜和肉類食品中， 谷物食品中AA 含量最高， 肉類次之， 蔬菜最低； 在食物加工過程中， 蒸煮方式不產(chǎn)生或產(chǎn)生少量AA， 烘焙方式產(chǎn)生AA 的量相對偏高， 而煎、 炸、 烤等方式產(chǎn)生量極高， 主要是由于長時(shí)間高溫狀態(tài)下美拉德反應(yīng)過度， 導(dǎo)致AA 的大量產(chǎn)生。

2 中國傳統(tǒng)食品中丙烯酰胺的檢測方法

2.1 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）

GC-MS 法以同位素稀釋技術(shù)為基礎(chǔ)， 將標(biāo)有13C3 標(biāo)記的AA 作為內(nèi)標(biāo)添加到樣品中， 以進(jìn)行多反應(yīng)或選擇性離子監(jiān)測。 GC-MS 作用的被分析物要求具備一定程度的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性， 但是AA 很容易被熱分解， 因此不可以直接被檢測， 通常將其衍生化來增強(qiáng)反應(yīng)的穩(wěn)定性。

GC-MS 方法具有較高的靈敏度、 特異性， 但其不足是溴化衍生所需的時(shí)間長， 反應(yīng)條件苛刻， 如AA 不經(jīng)衍生， 則需要借助高靈敏度的氣相色譜檢測器， 如串級質(zhì)譜、 氮磷檢測器等， 但是樣品回收率較低。

2.2 液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）

使用液相色譜方法時(shí)， AA 不需要衍生， 在傳統(tǒng)的反相色譜中， LC 與UV 檢測器或二極管陣列檢測器的組合選擇性低， 僅適用于高AA 含量的檢測。 國標(biāo)GB/T 5009.204—2014 將13C3 標(biāo)記的AA 作為內(nèi)標(biāo)溶液， 基于穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)， 通過水溶劑萃取和純化后， 利用LC-MS/MS 進(jìn)行測定[16]， 該方法可直接測定， 過程簡便、 快捷、 準(zhǔn)確， 在食品中AA 的檢測應(yīng)用上更為廣泛。

2.3 毛細(xì)管電泳法（CE）

CE 由高壓直流場產(chǎn)生的電滲流驅(qū)動， 通過石英毛細(xì)管的熔融， 利用其內(nèi)壁形成的分離載體， 由于電泳、 電滲和分子擴(kuò)散的作用， 流動相與固定相之間的速度差使各組分被分離。 但AA 不帶電， 要先被表面活性劑包裹或其他方法使其帶電才能采用此方法進(jìn)行高效分析。 CE 法測定食品中的AA 的主要優(yōu)點(diǎn)是高效、 迅速、 檢測品量小、 無需復(fù)雜的設(shè)備及預(yù)處理且靈敏度很高。

2.4 熒光生物傳感法

Hu Qinqin 等人[17]首先發(fā)現(xiàn)的新型熒光生物傳感法， 利用霍夫曼反應(yīng)使AA 降解產(chǎn)生的乙烯胺與熒光物質(zhì)反應(yīng)， 生成的吡咯啉酮可以在波長480 nm 照射下發(fā)出強(qiáng)熒光， 熒光強(qiáng)度與AA 質(zhì)量濃度呈正比。 從而根據(jù)光強(qiáng)測定出AA 質(zhì)量濃度， LOD 值和線性范圍值分別為0.015， 0.05～20 μg/mL。

該方法的優(yōu)勢在于其簡單、 快速， 但不足之處在于只能用于可以發(fā)出紫外光的樣品， 且與傳統(tǒng)方法相比， 其靈敏度并不高， 容易受到食品基質(zhì)干擾。

2.5 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法利用抗原和抗體結(jié)合的高度特異性，結(jié)合酶催化產(chǎn)生顏色反應(yīng)， 進(jìn)而對樣品進(jìn)行迅速、定量的檢測， 主要分為直接競爭法和間接競爭法。由于AA 是小分子， 只具有半抗原的性質(zhì)， 不具備免疫原性， 所以必須將其與免疫性載體蛋白交聯(lián)， 制備的耦合物完全抗原使動物機(jī)體免疫進(jìn)而產(chǎn)生抗體[18]。

與傳統(tǒng)方法相比， ELISA 法靈敏度高、 成本低、方便快捷， 并且不需要復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備， 回收率高，但較難獲得穩(wěn)定性強(qiáng)、 高親和力又穩(wěn)定的抗體。

2.6 計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)

美拉德反應(yīng)生成AA 的過程有著明顯的顏色變化。 通過計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)將樣品圖像進(jìn)行顏色分區(qū)，并對其進(jìn)行分析處理， 建立食品中褐變率與AA 質(zhì)量濃度之間的定量關(guān)系。 此法簡便、 操作容易， 可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測食品中AA 的含量， 但其不足在于受物料、加工方式等因素影響， 只適合于AA 的初步篩查[19]。

3 中國傳統(tǒng)食品中丙烯酰胺的控制措施

自AA 在食品中被發(fā)現(xiàn)以來， 由于其毒性、 致癌性等危害引起了人們的廣泛關(guān)注， 其形成機(jī)理、 形成途徑、 影響因素等也被人們廣泛研究， 通過研究使人們能夠從原理上尋找降低中國傳統(tǒng)食品中AA 含量的方法， 從而為控制中國傳統(tǒng)食品中AA 的含量提供理論依據(jù)。

3.1 AA 的形成機(jī)理

目前， 國際上普遍認(rèn)可的AA 主要形成途徑是天冬酰胺途徑， 即還原糖與天冬酰胺在高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)。 而蛋白質(zhì)、 碳水化合物和油脂等在高溫條件下也能夠產(chǎn)生AA[20-22]。

天冬酰胺途徑生成AA 見圖1。

圖1 天冬酰胺途徑生成AA

根據(jù)AA 的形成機(jī)理及形成途徑可以推知， 在中國傳統(tǒng)食品的加工過程中AA 的產(chǎn)生量會受到反應(yīng)溫度、 反應(yīng)時(shí)間、 生產(chǎn)配方、 pH 值、 預(yù)處理方式、 氨基酸和還原糖的摩爾比等因素的影響。

3.2 傳統(tǒng)食品中AA 的控制措施

3.2.1 控制加工溫度

劉健南等人[23]在葡萄糖/ 賴氨酸模擬體系中研究發(fā)現(xiàn)在140～180 ℃條件下， 隨著溫度的不斷增加體系中AA 含量不斷增加且增幅超過100%， 在180～220 ℃條件下AA 的含量隨著溫度升高迅速下降， 其原因可能是隨著溫度的升高導(dǎo)致了葡萄糖的快速分解， 從而抑制了AA 的產(chǎn)生[24]， 所以可以通過控制加工溫度而降低AA 的生成。

3.2.2 控制加工時(shí)間

柴曉玲等人[25]研究發(fā)現(xiàn)， 在天冬酰胺和葡萄糖反應(yīng)的模擬體系中， 以固定溫度不斷加熱， 在低于200 ℃反應(yīng)條件下AA 的含量隨著時(shí)間升高有明顯的上升趨勢， 當(dāng)溫度高于200 ℃時(shí)AA 的含量有明顯的先上升后下降的趨勢。 韓小存[26]在研究燒餅加工條件對AA 含量的影響過程中發(fā)現(xiàn)， 在190 ℃加工條件下隨著烘烤時(shí)間的增加， 燒餅中AA 含量迅速上升， 與加工10 min 相比加工30 min 時(shí)燒餅內(nèi)AA 含量上升了292.7%。 因此， 在實(shí)際生產(chǎn)操作中在確保不影響食品品質(zhì)的前提下， 可以通過降低反應(yīng)時(shí)間或在不超過200 ℃的條件下適當(dāng)增加反應(yīng)時(shí)間， 從而達(dá)到降低AA 生成的目的。

3.2.3 調(diào)整生產(chǎn)配方

研究顯示， 在一些面食[27]的生產(chǎn)配方中通過減少蔗糖、 添加食鹽發(fā)現(xiàn)， 2 種條件下均可以降低其中AA 的含量。 這是由于蔗糖分解為單糖會促進(jìn)美拉德反應(yīng)， 從而導(dǎo)致產(chǎn)品中AA 含量升高； 食鹽則會抑制淀粉酶活性， 減少淀粉的分解， 降低還原糖的含量，從而降低AA 的產(chǎn)生， 但若添加過多的食鹽反而會抑制酵母的作用， 從而促進(jìn)AA 的生成。

3.2.4 調(diào)節(jié)pH 值

結(jié)果表明， 中性條件下最有利于AA 的生成， 而酸性條件下對AA 抑制效果最明顯， 有學(xué)者通過將一些酸性物質(zhì)添加至模擬反應(yīng)體系中降低體系的pH值， 發(fā)現(xiàn)其對美拉德反應(yīng)中的Schiff 堿的形成起抑制作用， 并對AA 的產(chǎn)生表現(xiàn)出明顯抑制作用[28]， 所以可以用酸性溶液浸泡耐酸性原料來降低其pH值， 進(jìn)而降低AA 的含量， 并且在一定程度上起到改善產(chǎn)品風(fēng)味的作用。

3.2.5 控制AA 生成前體物質(zhì)氨基酸和還原糖的含量

AA 主要是由天冬酰胺和還原糖反應(yīng)產(chǎn)生， 所以這2 種物質(zhì)含量的關(guān)系對AA 的生成有著很大的影響。 當(dāng)反應(yīng)物中2 種物質(zhì)含量比例適當(dāng)時(shí)， 產(chǎn)品中AA 的含量才會達(dá)到最大值； 當(dāng)一種物質(zhì)含量遠(yuǎn)低于另一種時(shí)， AA 的生成量就會大大降低。

與西方國家肉制品為主的飲食模式不同， 中國以糧谷類作為主食， 對于谷物類原料， AA 的生成量主要是與其中天冬酰胺的含量呈正比[29]， 不同種類的谷物淀粉中還原糖和天冬酰胺的含量不同， 所以可以選用天冬酰胺含量低的谷物來進(jìn)行加工， 從而從生產(chǎn)原料降低AA 的生成。

3.2.6 控制食品中的水含量

在美拉德反應(yīng)過程中， 含水量為12%～18%的條件下美拉德反應(yīng)最為迅速， 結(jié)果表明， 含水量為10%的小麥粉在相同反應(yīng)條件下所產(chǎn)生的AA 量是干燥小麥粉的10 倍左右[30]， 而當(dāng)水分含量過高時(shí)則會稀釋反應(yīng)物， 進(jìn)而降低美拉德反應(yīng)速率， 從而減少了反應(yīng)過程中AA 的生成。

3.2.7 加入AA 抑制劑

向食品中添加一些AA 抑制劑， 如金屬離子、 維生素、 大蒜素、 膠體、 天然抗氧化劑（ 黃酮類） 、 氨基磷脂和卵磷脂、 硫磺酸類等[31]均能在不同程度上抑制AA 的產(chǎn)生。

（1） 金屬離子。 溫超[32]通過研究K+、 Ca2+、 Zn2+、Fe3+、 Al3+5 種金屬離子對AA 的抑制作用過程中發(fā)現(xiàn)5 種金屬離子均在不同程度上對AA 的生成起一定的抑制作用， 且抑制作用均隨著金屬離子濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢， 其中Ca2+的抑制效果最好，其最高抑制率為71.3%， 但隨著金屬離子的濃度升高對AA 的抑制率明顯下降， 并且在高濃度下不能顯著降低AA 的生成量， 但其結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。

（2） 親水膠體。 研究結(jié)果顯示， 當(dāng)果膠、 褐藻酸和黃原膠等親水膠體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時(shí)， 會對一些油炸小吃中的AA 產(chǎn)生約30%的抑制率[33]。 此外， AA 的生成還受到原料在親水膠體中浸泡時(shí)間長短的影響。

（3） 維生素。 Zeng Xiaohui 等人[34]在食品及Glu-Asn 模擬體系中研究發(fā)現(xiàn)維生素對AA 的生成有良好的抑制效果， 且水溶性維生素比脂溶性維生素對AA有更好的抑制作用， 其中維B 的抑制效果最為明顯。

（ 4） 抗氧化劑。 饅頭是典型的中國傳統(tǒng)食品，Rikke Vingborg Hedegaard 等人[35]通過將1%迷迭香油、 迷迭香水提取物或干燥迷迭香葉子到小麥面團(tuán)中， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)饅頭中的AA 含量分別降低67%，62%， 57%。 雖然3 種典型的抗氧化劑不能直接對AA 的合成起破壞或抑制作用， 但其氧化產(chǎn)物會直接破壞AA 或其前體物質(zhì)天冬酰胺， 從而起到抑制作用。

（5） 硫醇。 Hidalgo F J 等人[36]研究表明在無氧條件下, 硫醇易與AA 發(fā)生反應(yīng)并生成穩(wěn)定的聚合物，從而降低AA 的含量。 在有氧條件下， 硫醇會轉(zhuǎn)化成相對應(yīng)的硫醇自由基， 可以誘導(dǎo)AA 聚合， 從而抑制AA 的生成。

（6） 加入天冬酰胺酶。 天冬酰胺酶會使食品原料中的天冬酰胺發(fā)生分解， 從而阻斷AA 的生成， 但其存在并不會影響其他的氨基酸和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)， 因而不會影響食品的色澤和風(fēng)味等感官性狀。結(jié)果表明[37]， 在45 ℃條件下向面粉中添加10 U/g 的天冬酰胺酶能使其面制品的AA 含量降低90%以上。但由于使用酶對溫度的要求較高， 所以在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)盡量控制其溫度在酶的適宜活性范圍內(nèi)。

（7） 天然黃酮類。 天然黃酮類具有多種生物活性， 如抗腫瘤、 抗氧化、 抑制炎癥等。 黃酮類化合物的分布極其廣泛， 其主要存在于蔬菜、 水果、 香料和藥用植物中。 此外， 天然黃酮類化合物還可以有效抑制AA 的合成。 ①黃酮醇： 張英等人[38]通過Glu-Asn 模擬體系試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)， 黃酮醇對AA 的抑制率可達(dá)48.9%～69.3%， 且其酚羥基數(shù)量越多， 對AA 形成的抑制作用越強(qiáng)。 此外， 高瑜悅等人[39]通過研究黃酮類物質(zhì)對AA 毒性的抑制作用過程中發(fā)現(xiàn)，黃酮醇還可以顯著降低AA 的毒性。 ②黃酮苷： 黃酮苷是自然界中多種植物的次級代謝產(chǎn)物， 具有多種生物活性， 程璐等人[40]研究發(fā)現(xiàn)黃酮苷能夠抑制甚至阻斷AA 的形成過程， 并且在大多數(shù)情況下， 只需用黃酮苷浸泡、 噴灑或于配料過程添加， 就能使AA 大幅度減少， 同時(shí)對成品的感官特性不造成顯著影響。③異黃酮： 異黃酮主要存在于豆科植物中， 而葛根素是從豆科植物野葛中提取得到的一種有代表性的異黃酮。 苗雨田等人[41]的研究表明當(dāng)葛根素濃度在10-6～10-3mmol/mL 時(shí)， 葛根素濃度對AA 形成的抑制率呈正相關(guān)； 而在10-3～10 mmol/mL 濃度區(qū)間內(nèi)， 葛根素濃度越高， AA 形成量越多； 其對AA 的抑制率為51.7%～84.7%。 ④類黃酮： 類黃酮是植物重要的一類次生代謝產(chǎn)物， 其中槲皮素是一種非常有代表性的類黃酮。 劉黃友[42]在研究天然黃酮對AA 的抑制作用過程中發(fā)現(xiàn)在Fru-Asn 模擬體系中槲皮素對AA的最佳抑制濃度為10-4mmol/L， 與其對應(yīng)的最佳抑制率為69.30%， 顯著抑制了AA 的生成。4 結(jié)論

中國傳統(tǒng)食品中普遍含有不同量的AA， 整體上谷薯類食品的AA 含量大于肉類和蔬菜， 煎、 烤、熏、 炸等加工方式產(chǎn)生量多于蒸、 煮。 如今， 國際上已開發(fā)了包括GC-MS、 HPLC-MS/MS、 CE 等多種傳統(tǒng)和新興的檢測方法， 通過大量的試驗(yàn)研究得到多種影響傳統(tǒng)食品中AA 含量的因素， 并總結(jié)出相應(yīng)的控制措施， 用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)， 降低AA 的含量，減少中國傳統(tǒng)食品中AA 危害， 最終保障消費(fèi)者的身體健康。