花菜類雜交種純度鑒定SSR 核心引物篩選

丁 燕 木萬福 楊 龍 張 鵬 管俊嬌

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，昆明 650205；2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，元謀 651300）

甘藍種（Brassica oleraceaL.）是十字花科蕓薹屬的二倍體種，起源于歐洲地中海沿岸，由甘藍野生種經(jīng)過自然和人工的雙重選擇形成了不同的栽培類型，如普通甘藍、羽衣甘藍、皺葉甘藍、紫甘藍、抱子甘藍、苤藍、青花菜、花椰菜以及芥藍等變種[1]?；ㄒ耍˙.oleraceavar.botrytis）和青花菜（B.oleraceavar.Italica）以其獨特的生殖器官花球為商品和食用器官，含有多種維生素、礦物質(zhì)、粗纖維等，特別是富含萊菔硫烷，具有防癌、抗癌功效。我國是花菜生產(chǎn)大國，也是花菜消費大國。然而，在我國花菜栽培歷史中，其生產(chǎn)用種主要依賴于國外進口。目前生產(chǎn)中青花菜用種90%以上仍然為進口，種子價格奇高。

種子純度是評價種子質(zhì)量的關(guān)鍵，在大面積種植之前快速準確地鑒定種子質(zhì)量，是非常關(guān)鍵和必要的步驟[2]。傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法是以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù)，其周期長、工作量大，且易受環(huán)境、季節(jié)因素影響。因此，開發(fā)快速、準確的種子純度鑒定方法已成為種子科研單位和企業(yè)急需解決的問題。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)在花菜類品種純度鑒定中得到應(yīng)用，具有快速、準確、穩(wěn)定、安全、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點。其中，SSR 標記具有操作簡便和穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，加之具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富，在雜交種子純度檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。然而，在以往的研究中，為解決少數(shù)雜交種的純度鑒定，往往需要進行大量的引物篩選工作，才能找到適合的鑒定引物[3]。確定一套適于純度鑒定的核心引物，并構(gòu)建品種純度鑒定體系，對花菜類種子的純度鑒定至關(guān)重要。有了核心引物就不再需要進行繁瑣的引物篩選，即使對未知品種，也只需進行少量的篩選，就能迅速找到合適的鑒定引物[4]。本研究通過對70 個花椰菜和青花菜材料的DNA 指紋分析，確定適于花菜類雜交種純度鑒定的核心引物，構(gòu)建了花菜類雜交種純度鑒定 體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗材料選取F1材料70 份，其中青花菜栽培品種22份，花椰菜47份，西蘭苔1份（表1），2020 年8 月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所基地種植，采樣后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 70 份供試材料的基本信息

1.2 試驗方法

1.2.1 全基因組DNA 提取以改良CTAB 法[5]提取全基因組DNA，獲得的全基因組DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR 引物依據(jù)前人研究公布的甘藍類SSR標記[6-8]，合成引物100 對，經(jīng)過初篩，在每條染色體上選擇1～3 對引物，共選擇22 對引物進行熒光標記，用于遺傳多樣性檢測，引物詳細信息見表2。

表2 22對SSR 引物

1.2.3 標記篩選采用22 對熒光引物對70 個雜交種全基因組DNA 進行擴增，PCR 總反應(yīng)體系為10μL：5μL 2×mix 混合液、0.3μL 10μmol/L 正向引物、0.3μL 10μmol/L 反向引物，1μL 樣品DNA，3.4μL 超純水。擴增程序為94 ℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)30 次；72℃延伸10min，4℃保存。引物及試劑均由北京擎科生物有限公司提供。擴增產(chǎn)物在毛細管熒光電泳系統(tǒng)AB 3730XL DNA 分析儀（Applied Biosystems，USA）上檢測。

用GeneMapper Ver.3.7（Applied Biosystems，USA）對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和校正，讀出每個樣品各位點的等位變異片段大小數(shù)據(jù)。由于花菜是二倍體，以及SSR 標記的共顯性特征，供試品種在每個引物位點上的基因型用X/X（純合）、X/Y（雜合）記錄，其中X、Y 為該位點上兩個不同的等位變異片段大小，小片段在前，大片段在后。無效等位變異的大小記錄為0/0。

評估引物多態(tài)性高低的指標用多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information content），評 估 引物位點雜合程度的指標用雜合率[3]。

1.2.4 分子標記有效性驗證隨機選取2 個花菜雜交組合，分別提取父母親本、F1的DNA，并用篩選出的純度檢測核心SSR 分子標記進行檢測，以評價所篩選出的核心SSR 分子標記的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度鑒定核心引物的篩選利用22 對SSR 引物建立了70 個花菜類雜交種的DNA 指紋圖譜，根據(jù)圖譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析引物的基因頻率、基因分布信息及多態(tài)性和雜合率表現(xiàn)。由表3 可知，在這70 份材料中，73%的引物位點的實際基因型數(shù)小于理論基因型數(shù)。多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.05～0.69，平均為0.43。根據(jù)衡量基因變異程度高低的多態(tài)性信息量指標[9]，當PIC ≥0.50 時，該引物為高度多態(tài)性信息引物；當0.25 ≤PIC ＜0.50 時為中度多態(tài)性信息引物；當PIC ＜0.25 時為低度多態(tài)性信息引物。22 對引物中有9 對高度多態(tài)性信息引物，9 對中度多態(tài)性信息引物，4 對低度多態(tài)性信息引物。雜合率的變化范圍為0～0.72，平均雜合率為0.36，表明這些雜交種遺傳背景狹窄，集中在幾個骨干親本的血緣關(guān)系上。

表3 22 對SSR 引物檢測到的遺傳多樣性信息

根據(jù)王鳳格等[3]提出的核心引物的篩選原則，把引物分為3 類：第1 類為多態(tài)性高，且雜合率高的引物，包括BoGMS0624、BoGMS0941 和OI11G11；第2 類為多態(tài)性高或中，且雜合率高或中的引物，如BoE607、BoE761、BoGMS2431、BoGMS0808 和BoGMS1530；其余引物歸為第3 類，多態(tài)性低或中，且雜合率低。

70 個雜交種中有68 個可以用BoGMS0624、BoGMS0941 和OI11G11 3 個引物找到雜合帶型，只有2 個品種（W131 和亞松20003）不具有雜合帶型，所以這3 個引物可作為花菜純度鑒定的核心引物。

2.2 花菜純度鑒定特異引物的確定表4 匯總了引物的最低頻率基因型，有22 個基因型僅出現(xiàn)一次，其中亞松20002 有2 個位點的基因型僅出現(xiàn)一次，最低頻率為0.014（1/70）。根據(jù)王鳳格等[3]對特異引物的定義，在指定品種范圍內(nèi)，利用某一引物檢測，指定品種的雜合基因型表現(xiàn)唯一，或者依據(jù)引物的基因頻率表，當預(yù)測基因型頻率低于一定數(shù)值時，可將該引物視為該品種的特異引物。在本研究中有21 個品種具有特異性引物，但并不是所有的特異性引物都可為純度鑒定所用。如松1963 在BoGMS0624 位點的基因型327bp/335bp，在70 個品種中僅出現(xiàn)一次，且為雜合基因型，實際基因型頻率為0.014，但是其理論基因型頻率為0.039，即還有可能出現(xiàn)相同帶型的品種，該引物可用于鑒定松1963自交苗，但是不能用于異型株的鑒定，也就不能作為松1963的特異引物使用。在21 個品種中有8 個品種的實際基因型頻率小于理論基因型頻率，這些基因型的引物不能作為純度鑒定特異引物使用。此外，雅翠91（252bp/252bp）、貝綠美（254bp/254bp）和亞松20003（368bp/368bp）3 個基因型為純合基因型，這些位點也不適合作為純度鑒定特異引物。因此，本研究共篩選出浙青75、浙青80、蝴蝶等11 個品種（圖4 最后一列加粗品種）的純度鑒定特異引物，可以用于這些品種純度快速檢測。

表4 具有最低基因型頻率的基因型

2.3 花菜純度鑒定核心引物的有效性驗證采用篩選出的3 個純度檢測核心SSR 分子標記對隨機選取的2 個花菜雜交組合（MS048-1-2×C18232、MS048-1-2×C18199）的父母親本、F1的DNA 進行檢測。結(jié)果顯示，2 個雜交組合都從核心引物中篩選到了互補型條帶。如圖1 所示，A 中為雜交 組 合MS048-1-2×C18232 及F1（松1821）在BoGMS0941 引物的擴增條帶，a1 為母本MS048-1-2（234bp），a2 為父本C18232（224bp），a3 為F1出現(xiàn)了父母本的2 個互補條帶（224bp/234bp）。B 中為雜交組合MS048-1-2×C18199 及F1（松1963）在OI11G11 引物的擴增條帶，b1 為母本MS048-1-2（129bp），b2 為父本C18199（154bp），b3 為F1出現(xiàn)了父母本的2 個互補條帶（129bp/154bp）。

3 結(jié)論與討論

SSR 標記技術(shù)可以通過檢測待鑒定樣品是否具有某一品種的基因特異片段來辨別其真?zhèn)?，從而對種子純度進行檢測，具有快速、準確、穩(wěn)定、安全、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點。目前，SSR 標記已被廣泛應(yīng)用于水稻、棉花、玉米等作物的雜交種純度鑒定。本研究中引物的實際基因型數(shù)普遍低于理論基因型數(shù)，多態(tài)性較低，平均PIC 值為0.43，雜合率也不高，平均雜合率為0.36，揭示了目前花菜的遺傳背景狹窄，主要集中在幾個骨干親本。這增加了雜交種的區(qū)分難度，也不利于雜交種純度 檢測。

雜交種純度鑒定一是檢測母本自交、父本誤收因素造成的雜交種混雜，二是鑒定由異源花粉污染或機械混雜等造成的異型株。檢驗自交苗時需1 對雙親互補型引物，再利用特異引物或引物組合檢驗異型株。引物雜合率高，更容易篩選到雙親互補型引物用于檢驗自交苗；引物多態(tài)性高，可降低相同帶型出現(xiàn)頻率，有利于區(qū)分異型株。本試驗篩選出了3 個共顯性SSR 標記BoGMS0624、BoGMS0941 和OI11G11，作為花菜品種純度檢測的核心引物。這3個引物雜合率高，97%的品種均可以找到具有雜合帶型的引物，滿足檢驗自交苗的需要，且這3 個引物多態(tài)性高，具有較高的驗雜能力。因此，這3 個引物可以推薦作為純度鑒定的首選核心引物。其他5 個中等表現(xiàn)的引物BoE607、BoE761、BoGMS2431、BoGMS0808 和BoGMS1530 可作為純度鑒定的備選引物，補充解決上述3 個引物不能鑒定的品種。目前已有的研究多是針對特定品種的純度鑒定引物篩選[10]，從核心引物中選擇合適的引物用于特定品種的純度鑒定，極大地縮減了工作量，提高了檢測效率，降低了檢測成本。此外，本研究共篩選出浙青75、浙青80、蝴蝶等11 個品種的純度鑒定特異引物，不僅可鑒別自交株，還可鑒別異形株，大大加快了純度檢測速度。