冷藏充二氧化碳對(duì)切花菊的影響

章康藝，余 莎，樓恬恬，鄔雨津，壽建昕，俞明操

（1.紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興 312000；2.浙江豐島股份有限公司，浙江新昌 312500）

菊花（Dendranthemuma morifolium）是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，在花卉生產(chǎn)、園林綠化和美化環(huán)境中占有十分重要的地位。我國(guó)是栽培菊花的起源中心和菊屬種質(zhì)資源的分布中心，菊屬有40 余種，在我國(guó)分布的就有20 余種，栽培品種達(dá)3 000 余個(gè)[1]。鮮切花生產(chǎn)是花卉產(chǎn)業(yè)中附加值最高的一個(gè)分支，正以前所未有的速度蓬勃發(fā)展。中國(guó)是世界鮮切花的最大生產(chǎn)國(guó)，鮮切花產(chǎn)銷量占全球切花總量的30%以上。我國(guó)菊花的產(chǎn)量和規(guī)模正在逐年擴(kuò)大，產(chǎn)銷量占全球鮮切菊花總量的18%以上，在國(guó)內(nèi)鮮切花中，菊花約占總產(chǎn)量的30%。切花采后的數(shù)量損失，發(fā)達(dá)國(guó)家為5%～25%，發(fā)展中國(guó)家為20%～50%[4]。世界發(fā)達(dá)國(guó)家的切花生產(chǎn)商都通過栽培及采后保鮮控制技術(shù)，滿足消費(fèi)者對(duì)切花觀賞性和延長(zhǎng)瓶插壽命的要求，但同國(guó)外相比，由于對(duì)菊花的采收前和采后生理研究不夠，保鮮技術(shù)水平仍有較大差距，導(dǎo)致我國(guó)菊花切花在采后和流通中的損失高達(dá)20%左右[5]，造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染和經(jīng)濟(jì)損失。切花菊采摘后，合成物質(zhì)減少，分解加速，逐漸失水萎蔫走向衰老，并且伴隨著復(fù)雜的生理生化變化。通過切花采摘并包裝后充入不同體積的二氧化碳，對(duì)切花菊水分、代謝相關(guān)酶和產(chǎn)物等生物學(xué)特征進(jìn)行研究，并且測(cè)試保存后切花菊的瓶插時(shí)間，以期為切花菊采后存儲(chǔ)運(yùn)輸條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 二氧化碳充氣保存法

在4℃下向長(zhǎng)40～50 cm、PVC 高阻隔材料制成的包裝袋中，充入2 個(gè)大氣壓的二氧化碳若干體積，每個(gè)包裝袋中放入10 支鮮切花，為了和生產(chǎn)方便程度對(duì)應(yīng)，項(xiàng)目組采用計(jì)時(shí)充氣法，設(shè)定0 min 為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組采用0.5、2.0、5.0 min。

1.2 葉相對(duì)含水量測(cè)定

取新鮮葉片稱重W1，放入烘箱內(nèi)殺青0.5 h 后80℃烘至恒重，稱重W2。相對(duì)含水量計(jì)算公式：相對(duì)含水量=[（W1-W2）/W1]×100%，每測(cè)定重復(fù)3 次。

1.3 可溶性糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法。取葉片擦凈表面污物，剪碎混合，稱取0.25 g，共3 份，分別放入3 支刻度試管中，加入5 mL蒸餾水，薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2 次），提取液過濾入25 mL 容量瓶中，用蒸餾水反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)⒍ㄈ葜?5 mL。吸取樣品提取液0.5 mL 于20 mL刻度試管中，加蒸餾水1.5 mL，然后按順序向試管中加入0.5 mL 2%的蒽酮乙酸乙酯和5 mL 濃硫酸，放入沸水中保溫1 min，自然冷卻至室溫，以不加提取液的空白作對(duì)照，在630 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。以蔗糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法，稍有改動(dòng)。稱切花菊葉片0.5 g，用5 mL 蒸餾水研磨成勻漿后，3 000 r/min 離心10 min，取上清液0.1 mL 放入具塞試管中，并加入蒸餾水0.9 mL，再加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，充分混合，放置2 min 后在595 nm 下比色，測(cè)定吸光度，并通過以牛血清蛋白所作標(biāo)準(zhǔn)曲線求值。

V樣品中蛋白質(zhì)的含量=[C×VT/VS×WF×1 000]（mg/g）

式中：C 為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值（μg）；VT為提取液總體積（mL）；VS為測(cè)定時(shí)的加樣量（mL）；WF為樣品鮮重（g）。

1.5 過氧化物酶活性測(cè)定

取10 mL 50 mmol/L（pH 7.8）的磷酸緩沖液于反應(yīng)管中，加入0.076 mL 0.3%液體愈創(chuàng)木酚，0.112 mL 30%的H2O2，0.1 mL 葉片粗酶液，立即搖勻，然后測(cè)定470 mn 處的吸光值，3 min 內(nèi)每隔30 s 記錄1 次，共計(jì)6 次。以1 min內(nèi)A470 變化0.01 為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.6 超氧化物歧化酶活性測(cè)定

SOD 反應(yīng)體系為3 mL：50 mmol/L 的磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.8）1.7 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液0.3 mL，750 μmol/L氮藍(lán)四唑溶液0.3 mL，l mmol/L EDTA-Na2溶液0.3 mL，20 μmol/L 核黃素溶液0.3 mL，酶液0.1 mL。同時(shí)做2 支對(duì)照管，取3 mL 反應(yīng)混合液加入0.1 mL PBS，其中一支管照光后，作為光最大還原管，另一支置于黑暗中，測(cè)定時(shí)用于調(diào)零。各管置于270 μmol/m2·s 日光燈25℃下照光反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后，分別測(cè)定各管在560 nm 處的吸光值。

1.7 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

稱取切花葉0.5 g，加入5 ml 5%的三氯乙酸（TCA），充分研磨，將勻漿轉(zhuǎn)入10 mL 的離心管中，在轉(zhuǎn)速3 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL（上清液為樣品提取液），加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸（TBA），在100℃沸水浴中煮沸30 min，冷卻（冰浴）后再離心1 次，分別測(cè)定上清液在450、532、600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度，（以2 mL 蒸餾水加2 mL 0.67% TBA 的混合液作為對(duì)照測(cè)定進(jìn)行比色）。

MDA 濃度（μmol/L）= 6.45（D532-D600）-0.56D450

MDA 濃度（μmol/g）= MDA 濃度（μmol/L）×提取液體積（5 mL）/植物組織鮮重（g）

1.8 切花瓶插檢驗(yàn)

采用自來水瓶插檢驗(yàn)，每種存儲(chǔ)條件下10 支1 組，重復(fù)3 組，觀察瓶插衰敗情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉相對(duì)含水量

對(duì)包裝后的箱裝切花菊分別進(jìn)行0、0.5、2.0、5.0 min的二氧化碳充氣，保存至4℃培養(yǎng)箱中，隔天取樣測(cè)定，保存14 d。從圖1 可以看出，前4 d 4 個(gè)保存組相對(duì)含水量無顯著性差異，第6 天充入0.5 min 的組相對(duì)含水量開始上升，顯著高于其他組別，充入5 min 組相對(duì)含水量開始顯著減少于其他組別。由于保存至第10 天，充入5.0 min的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)比較嚴(yán)重的腐爛，導(dǎo)致該組后續(xù)數(shù)據(jù)無法測(cè)得，3 個(gè)平行組均出現(xiàn)此現(xiàn)象，說明大量充入二氧化碳，切花菊進(jìn)入了無氧呼吸，產(chǎn)生了大量的乙醇，切花菊正常的采后生理被破壞。但充入0.5 min 的組直至14 d，相對(duì)含水量都要多于對(duì)照組，說明少量充入二氧化碳，對(duì)切花菊保持活性是有利的。

2.2 可溶性糖含量

將采后的切花菊按上述方法裝箱后，進(jìn)行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充氣，保存至4℃培養(yǎng)箱中，隔天取樣測(cè)定其可溶性糖的含量，分析在4℃下，充不同量二氧化碳對(duì)保存切花菊可溶性糖的影響。從圖2 可以看出，第4天0、0.5、2.0 min 3 個(gè)保存組間切花菊可溶性糖含量無顯著性差異，但充5.0 min 組可溶性糖含量顯著高于其他3組。但5.0 min 組在4 d 后可溶性糖含量出現(xiàn)急劇降低，第8 天降至25 mg/g。由于保存至第10 天，充入5.0 min 的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)比較嚴(yán)重的腐爛，導(dǎo)致該組后續(xù)數(shù)據(jù)無法測(cè)得，3 個(gè)平行組均出現(xiàn)此現(xiàn)象，說明大量充入二氧化碳，切花菊進(jìn)入了無氧呼吸，產(chǎn)生了大量的乙醇，切花菊正常的采后生理被破壞。0.5 min 和2.0 min 組第6 天可溶性糖含量接近，均顯著高于對(duì)照，其后至試驗(yàn)結(jié)束，充入0.5 min 二氧化碳組可溶性糖含量均顯著高于2.0 min 組及對(duì)照，這可能是由于裝箱后，切花菊轉(zhuǎn)入了暗反應(yīng)階段，充入低劑量二氧化碳有助于其糖類等有機(jī)物的合成。

圖2 4℃下充二氧化碳對(duì)切花菊可溶性糖含量的影響

2.3 可溶性蛋白（SP）含量

將采后的切花菊按上述方法裝箱后，進(jìn)行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充氣，保存至4℃培養(yǎng)箱中，隔天取樣測(cè)定其可溶性蛋白含量，分析在4℃下，充不同量二氧化碳對(duì)保存切花菊可溶性蛋白的影響。從圖3 可以看出，充入二氧化碳后4 個(gè)組別中可溶性蛋白均呈下降趨勢(shì)，但各組別間無顯著性差異，但由于保存至第10 天，充入5.0 min的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)比較嚴(yán)重的腐爛，導(dǎo)致該組后續(xù)數(shù)據(jù)無法測(cè)得，3 個(gè)平行組均出現(xiàn)此現(xiàn)象，說明大量充入二氧化碳，切花菊進(jìn)入了無氧呼吸，產(chǎn)生了大量的乙醇，切花菊正常的采后生理被破壞。說明在4℃下保存切花菊，二氧化碳的濃度對(duì)可溶性蛋白的影響不太大。

圖3 4℃下充二氧化碳對(duì)切花菊可溶性蛋白含量的影響

2.4 過氧化物酶（POD）活性

采后的切花菊按上述方法裝箱后，進(jìn)行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充氣，保存至4℃培養(yǎng)箱中，隔天取樣測(cè)定其過氧化物酶活性，分析在4℃下，充不同量二氧化碳對(duì)保存切花菊過氧化物酶活性的影響。從圖4 可以看出，4 個(gè)組別的切花菊中過氧化物酶活性在前4 d 均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中5.0 min 組的上升最為明顯，極顯著高于其他3 組，達(dá)到143.94 U/mg·FW，其后5.0 min 組過氧化物酶活性出現(xiàn)下降直至測(cè)定第8 天，由于保存至第10 天，充入5.0 min 的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)比較嚴(yán)重的腐爛，導(dǎo)致該組后續(xù)數(shù)據(jù)無法測(cè)得。對(duì)照組在第6 天后出現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。0.5 min 組第10 天出現(xiàn)上升，至170.76 U/mg·FW，其后出現(xiàn)降低，但過氧化物酶活性0.5 min 組極顯著高于其他組別。

圖4 4℃下充二氧化碳對(duì)切花菊過氧化物酶活性的影響

2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性

將采后的切花菊按上述方法裝箱后，進(jìn)行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充氣，保存至4℃培養(yǎng)箱中，隔天取樣測(cè)定其超氧化物歧化酶活性，分析在4℃下，充不同量二氧化碳對(duì)保存切花菊超氧化物歧化酶活性的影響。從圖5可以看出，前6 d 4 個(gè)組別超氧化物歧化酶活性均上升，其中5.0 min 組第6 天后出現(xiàn)迅速下降，由于保存至第10天，充入5.0 min 的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)比較嚴(yán)重的腐爛，導(dǎo)致該組后續(xù)數(shù)據(jù)無法測(cè)得。對(duì)照組和2.0 min 組第10 天后出現(xiàn)下降，但是2.0 min 組的SOD 酶活性高于對(duì)照組，0.5 min組除第14 天出現(xiàn)下降外，其他測(cè)試值均較前次增加，第12天出現(xiàn)最高值，達(dá)35.02 U/mg·FW。

圖5 4℃下充二氧化碳對(duì)切花菊超氧化物歧化酶活性的影響

2.6 丙二醛（MDA）含量

將采后的切花菊按上述方法裝箱后，進(jìn)行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充氣，保存至4℃培養(yǎng)箱中，隔天取樣測(cè)定其丙二醛的含量，分析在4℃下，充不同量二氧化碳對(duì)保存切花菊丙二醛含量的影響。從圖6 可以看出，4 個(gè)組別的丙二醛含量均出現(xiàn)持續(xù)上升，其中2.0 min 組在第10 天后出現(xiàn)快速增加，極顯著高于其他組別，到第14 天達(dá)到28.72 mol/g·FW。

圖6 4℃下充二氧化碳對(duì)切花菊丙二醛含量的影響

2.7 切花菊瓶插最大花徑和瓶插壽命

將經(jīng)過14 d 保存后的切花菊包裝打開進(jìn)行純水瓶插試驗(yàn)，測(cè)定切花菊瓶插后的最大花徑和瓶插壽命。從表1可以看出，由于5.0 min 組在實(shí)驗(yàn)第10 天出現(xiàn)腐爛，故不能繼續(xù)瓶插檢驗(yàn)，其他3 組純水瓶插后的試驗(yàn)結(jié)果表明：充二氧化碳0.5 min 與對(duì)照組在花徑大小上無顯著性差異，但是極顯著高于2.0 min 組，花平均壽命0.5 min 組最長(zhǎng)，達(dá)到16.49 d，極顯著高于對(duì)照組，2.0 min 組極顯著低于對(duì)照組，說明充入低劑量二氧化碳有利于瓶插時(shí)間的延長(zhǎng)。葉的壽命對(duì)照組與0.5 min 組無顯著差異，2.0 min組極顯著低于對(duì)照。

表1 切花菊瓶插最大花徑和瓶插壽命

3 結(jié)論

切花菊采摘后，合成物質(zhì)減少、分解加速，逐漸失水萎蔫走向衰老，并且伴隨著復(fù)雜的生理生化變化。項(xiàng)目組利用切花菊包裝后充入不同體積的二氧化碳，測(cè)定與切花菊衰老相關(guān)的指標(biāo)，來確定包裝切花菊的最適二氧化碳充入量。經(jīng)過測(cè)定后發(fā)現(xiàn)在4℃保存溫度下，充入低劑量的二氧化碳，有利于切花菊的瓶插延時(shí)，但隨著二氧化碳濃度增加，包裝中相對(duì)氧含量降低，導(dǎo)致切花菊開始進(jìn)行無氧呼吸，對(duì)其生理活動(dòng)影響很大，當(dāng)項(xiàng)目組在包裝中充入5.0 min 二氧化碳后，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。綜上，切花菊采后包裝完成后，應(yīng)盡快移至4℃冷庫冷藏，并且充入低劑量二氧化碳，能夠延長(zhǎng)瓶插時(shí)間。