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    CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)綜述

    2021-11-24 16:44欽越陳志楊章平
    河南農(nóng)業(yè)·教育版 2021年7期
    關(guān)鍵詞:哺乳動(dòng)物

    欽越 陳志 楊章平

    摘要:CRISPR/Cas9首次在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn),是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分,現(xiàn)已廣泛用于工程改造基因組中激活或抑制基因表達(dá)。同時(shí),CRISPR/Cas9有望通過(guò)提供一種有效的技術(shù)來(lái)剖析癌癥發(fā)生的機(jī)制,確定藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo),并可能為基于細(xì)胞的療法提供支撐以加速癌癥的研究。對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展歷史和應(yīng)用范圍做了概述及展望,以期為CRISPR/Cas9技術(shù)的后續(xù)發(fā)展提供思路。

    關(guān)鍵詞:CRISPR/Cas9;基因編輯;哺乳動(dòng)物

    長(zhǎng)期以來(lái),基因療法一直被寄予希望可以治療或糾正人和動(dòng)物體內(nèi)的各種疾病和缺陷。隨著簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)的發(fā)現(xiàn)、基于CRISPR的原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(CRISPR相關(guān)系統(tǒng),Cas)的機(jī)制以及它的再利用成為一種有效的基因編輯工具,使得分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化,并激發(fā)了人們對(duì)新的和改進(jìn)的基因治療的興趣。CRISPR/Cas9(規(guī)律性成簇間隔的短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白)系統(tǒng)是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù),是現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里面效率最高、最簡(jiǎn)便、成本最低的技術(shù)之一,已成為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)。

    一、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的起源

    1987年,日本科學(xué)家在研究大腸桿菌的時(shí)候發(fā)現(xiàn)其基因組上有一段29bp的序列反復(fù)出現(xiàn)了數(shù)次且彼此之間被一段 32bp的序列所隔開(kāi)。1993年,西班牙科學(xué)家Francisco Mojica在地中海噬鹽菌中也同樣發(fā)現(xiàn)了這段重復(fù)序列。隨著后續(xù)的研究,他在二十多種不同的微生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了這種重復(fù)DNA結(jié)構(gòu),并將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 (Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)。通過(guò)對(duì)比多種細(xì)菌的幾千段CRIPSR序列,發(fā)現(xiàn)在 CRIPSR序列中存在許多片段與病毒的基因組序列高度一致,雖然不是完整的病毒基因組序列,但這些序列被夾在一段細(xì)菌精心設(shè)計(jì)的重復(fù)序列中。進(jìn)一步的研究證實(shí),這些與病毒基因組高度一致的序列來(lái)自于噬菌體。2007年,CRISPR序列對(duì)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的功能在嗜熱鏈球菌中得以證明。

    2011年,美國(guó)化學(xué)家詹妮弗,杜德納與法國(guó)生物化學(xué)家埃馬紐埃爾,卡彭蒂耶合作開(kāi)發(fā)CRISPR技術(shù),并于一年后在《Science》雜志中首次指出,CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外實(shí)驗(yàn)中能定點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行切割,顯著提升了基因編輯的效率。2013年,哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授喬治。徹奇和華人科學(xué)家、麻省理工學(xué)院教授、博德研究所資深研究員張鋒分別相繼證明了CRISPR序列與Cas9蛋白結(jié)合可以在人類細(xì)胞中高效地定位、剪切和修改基因組。

    二、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA(sgRNA)所組成,其中Cas9蛋白起切割DNA雙鏈的作用,sgRNA起向?qū)У淖饔?,在sgRNA的向?qū)峦ㄟ^(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,Cas9蛋白可對(duì)不同的靶部位進(jìn)行切割,實(shí)現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂。

    (一)CRISPR高度可變的間隔區(qū)的獲得

    當(dāng)有外源DNA人侵細(xì)胞時(shí),Cas1和Cas2編碼的蛋白會(huì)對(duì)該DNA進(jìn)行識(shí)別,并在過(guò)程中尋找到該DNA的PAM區(qū)域,CRISPR將以該P(yáng)AM區(qū)域附近的DNA序列作為候選的原型間隔序列。在識(shí)別后,Cas1/2蛋白復(fù)合物會(huì)對(duì)選擇出的間隔序列進(jìn)行剪切處理,同時(shí),會(huì)有一部分酶將原間隔序列插人到CRISPR序列的前導(dǎo)區(qū)下游區(qū)域。在通常情況下,斷裂的DNA會(huì)采用高效的非同源末端連接方式(NHEJ)進(jìn)行自我修復(fù),將被剪切的雙鏈缺口閉合。經(jīng)過(guò)該階段,一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。

    (二)CRIPSR基因座的表達(dá)

    CRISPR序列的前導(dǎo)區(qū)會(huì)調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pre-CRIS-PR RNA,tracrRNA(反式激活crRNA)在此時(shí)也會(huì)被轉(zhuǎn)錄出來(lái)與pre-crRNA序列進(jìn)行互補(bǔ)。pre-CRISPR RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與tracrRNA形成雙鏈RNA并與Cas9編碼的蛋白組裝成一個(gè)復(fù)合體。該復(fù)合體的目的是根據(jù)外源DNA的類型選取不同的間隔序列RNA,并在核糖核酸酶III(RNaseIII)的協(xié)助下進(jìn)行剪切,最終形成一段短小的CRISPR RNA(包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復(fù)序列區(qū))。

    (三)CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮

    由CRISPR RNA,Cas9以及tracrRNA組成的復(fù)合物將識(shí)別整個(gè)外源DNA序列,并識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列。這時(shí),復(fù)合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域,DNA雙鏈將被解開(kāi),形成R一Loop。此時(shí)crRNA與互補(bǔ)鏈相連接,而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。Cas9蛋白隨后會(huì)精準(zhǔn)的平端切割位點(diǎn)位于PAM上游3個(gè)核苷酸的位置,形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的那一條DNA鏈,而RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另外一條非互補(bǔ)DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂(DSB),外源DNA的表達(dá)被沉默。

    三、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

    (一)基因敲除(Knock-out)

    在通常情況下,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂的情況時(shí),會(huì)采用高效的非同源末端鏈接(Non-homologous end join-ing,NHEJ)對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。但是,在修復(fù)過(guò)程中通常會(huì)發(fā)生堿基插人或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象,造成移碼突變,使靶標(biāo)基因失去功能。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以利用Cas9蛋白對(duì)靶基因組進(jìn)行剪切,形成DNA的雙鏈斷裂,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因敲除。

    Zhou等川利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對(duì)山羊成纖維細(xì)胞中的BLG位點(diǎn)進(jìn)行敲除,獲得p-乳球蛋白(BLG)基因敲除山羊,通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在敲除山羊的乳汁中BLG蛋白表達(dá)極顯著降低,為羊奶的品質(zhì)優(yōu)化提供了有效依據(jù)。G.N.Singina等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了PAEP和LOC100848610基因敲除的胚胎成纖維細(xì)胞系以用于生產(chǎn)不合成p-乳球蛋白的牛的轉(zhuǎn)基因后代。Watanabe等使用CRISPR / Cas9在人胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞系中敲除 KDM6A,證明KDM6A缺失的細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲性表型。Yuza等4證實(shí),敲除PAN02細(xì)胞中的SphK1基因可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。利用CRISPR /Cas9技術(shù),Chugh等日將 C1CALT1基因從PDAC細(xì)胞中敲除,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、遷移率等指標(biāo)的表達(dá)都有顯著提高。在胰腺癌的研究中,也有許多基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究,即敲除胰腺癌細(xì)胞的特異性基因,然后觀察不同表型的變化。

    (二)基因敲入(Knock-in)

    當(dāng)DNA雙鏈斷裂后,如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)人到細(xì)胞中,基因組斷裂部分會(huì)依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)(HDR),從而實(shí)現(xiàn)基因敲人。修復(fù)模板由需要導(dǎo)人的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列(同源臂)組成,同源臂的長(zhǎng)度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈,也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低,通常小于10%。為了增加基因敲人的成功率,目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率,將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時(shí)期,促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行;或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ,提高HDR的效率。魏姣舊等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在雞胚中注射腺病毒載體比慢病毒載體具有更高的轉(zhuǎn)染效率,通過(guò)CRISPR /Cas9腺病毒載體注射可以在雞胚ATP5E位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)EGFP基因敲人。Xie等利用CRISPR/Cas9技術(shù),成功地將豬RSAD2基因(pRSAD2)定點(diǎn)插人到豬rosa26(pR0-SA26)位點(diǎn),獲得了pRSAD2基因敲人PK一15細(xì)胞(pRSAD2-KI)和豬胎兒成纖維細(xì)胞(PFFs),并從 pRSAD2-KI豬分離的成纖維細(xì)胞減少了CSFV的感染。Chu等圖應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)將8-11kb插人片段敲人C57BL/6小鼠受精卵的Rosa26中,在此基礎(chǔ)上建立了Cre/loxP依賴性進(jìn)行Cas9表達(dá)的新小鼠系。

    (三)基因抑制/激活(Repression or Activation)

    Cas9具有獨(dú)立切割和結(jié)合靶基因的能力,其能夠通過(guò)點(diǎn)突變的方式使RuvC-和HNH一兩個(gè)Cas9的結(jié)構(gòu)域失活,形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因,而不具備剪切DNA的功能。因此,將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),可以阻斷轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng),從而抑制基因表達(dá);將dCas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物,使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9nickase的不同之處在于,dCas9造成的激活或者抑制是可逆的,并不會(huì)對(duì)基因組DNA造成永久性的改變。陳渙蘭等9通過(guò)基因抑制的方法構(gòu)建了1種雙質(zhì)粒CRISPR-dCas9系統(tǒng),該系統(tǒng)可以抑制乳酸乳球菌NZ9000基因轉(zhuǎn)錄,通過(guò)此方法成功將乳酸乳球菌NZ9000中假定的青霉素?;D(zhuǎn)移酶LLNZ-07335鑒定為膽鹽水解酶。Brook E. Heaton等叫使用CRISPR激活技術(shù)對(duì)限制IAV感染的基因進(jìn)行了全基因組過(guò)表達(dá)篩選,并通過(guò)鑒定篩選出了B4GALNT2基因,該基因雖然通常不在肺中表達(dá)但能夠完全預(yù)防IAV感染,該因子可在將來(lái)用于預(yù)防嚴(yán)重的人和禽流感疾病。

    (四)基因多重編輯(Multiplex Editing)

    將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中,可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯,具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應(yīng)用包括:使用雙Cas9 nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率、大范圍的基因組缺失及同時(shí)編輯不同的基因。通常情況下,一個(gè)質(zhì)粒上可以構(gòu)建2~7個(gè)不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯。

    (五)功能基因組篩選

    利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞,因此,利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的?;蚪M篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù),但是shRNA有其局限性:具有很高的脫靶效應(yīng)以及無(wú)法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果。CRISRP/Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢(shì),在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用。目前,CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對(duì)表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因,如對(duì)化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫(kù)對(duì)潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。

    四、CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的問(wèn)題及展望

    CRISPR /Cas9系統(tǒng)與ZFN和TALEN的基于蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合的一個(gè)關(guān)鍵區(qū)別是使用短RNA序列作為特異性決定元件來(lái)驅(qū)動(dòng)靶部位DSB的形成。CRISPR/CAS9的使用避免了蛋白質(zhì)工程開(kāi)發(fā)針對(duì)特定DNA靶序列的位點(diǎn)特異性核酸酶的需要,只需要合成一段新的RNA。這大大簡(jiǎn)化并減少了基因編輯設(shè)計(jì)和實(shí)施所需的時(shí)間。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展迅速,已取代之前的基因編輯技術(shù),然而要充分實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的潛力,仍需要應(yīng)對(duì)許多挑戰(zhàn)。

    目標(biāo)位點(diǎn)的選擇和sgRNA設(shè)計(jì)是一件非常復(fù)雜的工作。Cradick等叫在他們的研究中表明,CRISPR/Cas9的特異性可能低于ZFN或TALEN,這是因?yàn)槠浒邢蛐蛄邢鄬?duì)較短。因此,sgRNA的合理設(shè)計(jì)仍然需要大量的工作,目前并沒(méi)有簡(jiǎn)單的算法可以幫助科研人員進(jìn)行設(shè)計(jì)。同時(shí),為了提高特異性和減少脫靶率,Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)也并不簡(jiǎn)單,同樣需要大量的工作。雖然Cas9本身不會(huì)引起脫靶效應(yīng),但對(duì)Cas9蛋白的改進(jìn)可以限制這些效應(yīng)。

    關(guān)于sgRNA和Cas9蛋白的遞送仍然是CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用的障礙之一,目前還沒(méi)有出現(xiàn)通用的遞送方法。雖然已經(jīng)出現(xiàn)許多可用于將CRISPR傳遞到單元的多種方法,但每種方法都有利有弊,有些方法可能非常特殊或不適合某些類型的傳遞。

    活體生物的安全性也一直是一個(gè)令人擔(dān)憂的問(wèn)題,能夠以高特異性靶向所需細(xì)胞的遞送工具也將限制非靶標(biāo)效應(yīng)并提高安全性。在納米顆粒載體的情況下,對(duì)組件的安全性進(jìn)行長(zhǎng)期研究是至關(guān)重要的。目前,關(guān)于納米顆粒傳遞系統(tǒng)的各種成分最終在體內(nèi)的哪里,它們?cè)谀抢锿A袅硕嚅L(zhǎng)時(shí)間,以及是否有任何與任何成分相關(guān)的長(zhǎng)期毒性的信息和研究仍是有限的。

    CRISPR是現(xiàn)代基因工程的新面孔。2020年,詹妮弗.杜德納和埃馬紐埃爾,卡彭蒂耶被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),以表彰她們?cè)凇皯{借開(kāi)發(fā)基因組編輯方法”方面作出的貢獻(xiàn),諾貝爾委員會(huì)在官方頒獎(jiǎng)詞中表示:“借助這些技術(shù),研究人員可以非常精準(zhǔn)地改變動(dòng)物、植物、和微生物的DNA。CRISPR /Cas9基因剪刀徹底改變了分子生命科學(xué),為植物育種帶來(lái)了新機(jī)遇,有望催生創(chuàng)新性癌癥療法,并可能使治愈遺傳性疾病這一人類夢(mèng)想美夢(mèng)成真?!蔽覀円蚕M鸆RIS-PR/Cas9最終能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)愿望,當(dāng)然這是一個(gè)仍然需要繼續(xù)研究的重要領(lǐng)域。

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    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目“miR-140調(diào)控奶牛乳腺脂肪酸代謝的分子機(jī)制研究”,項(xiàng)目編號(hào):31802035。

    作者簡(jiǎn)介:路欽越(1997-),男,內(nèi)蒙古包頭人,碩士,研究方向:動(dòng)物遺傳育種與繁殖。

    (責(zé)任編輯馮會(huì)利)

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