響應面法優(yōu)化清胃散水提工藝研究*

歐麗娜，鄭曉丹，毛文偉，李云霞，王 珂，張奧攀，李 杰

（河南科技大學醫(yī)學院，河南 洛陽 471000）

清胃散首載于李東垣《脾胃論》，是由升麻、黃連、當歸、生地黃、牡丹皮5味中藥組成，具有清胃涼血之功，主治胃中積熱，牙痛牽引頭痛，面頰發(fā)熱，其齒喜冷惡熱，或牙齦紅腫潰爛，或唇舌腮頰腫痛，口氣熱臭，口干舌燥，舌紅苔黃，脈滑數(shù)[1]。臨床上常用于治療口腔炎、牙髓炎[2]、牙周炎[3]等屬胃火上攻者。傳統(tǒng)用法為“水一盞半，煎至七分，去渣，放冷服之”。該方法攜帶不便且質(zhì)量不可控，但目前并未有成藥上市，亟待開發(fā)合適的劑型，補充臨床所需。

響應面法適用于考察連續(xù)變量及非線性數(shù)據(jù)處理等問題。因此，筆者采用多指標分析，以方中君藥黃連的主要成分鹽酸小檗堿含量[4]及復方的出膏率為評價指標，采用Box-Behnken設計法，對其水提工藝進行優(yōu)化研究，以期為清胃散制成現(xiàn)代劑型提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（LC2000，上海天美科學儀器有限公司）；電子分析天平（FA2204B，上海精密科學儀器有限公司）；超聲波清洗儀（KQ2200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-4A，金壇市精達儀器制造有限公司）；真空干燥箱（02R-6030，上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 藥物與試劑 黃連、升麻、生地黃、牡丹皮、當歸等藥材飲片均購于河南省洛陽市張仲景大藥房股份有限公司。鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201613，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、磷酸、磷酸二氫鉀為色譜純，甲醇、十二烷基硫酸鈉、硅藻土為分析純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法 分別按照處方比例稱取各藥材飲片，粉碎過12目篩，按各試驗設計量加入適宜體積倍數(shù)的純凈水，浸泡相應時間，加熱回流提取相應時間及次數(shù)，4層紗布過濾，濾液合并，置恒溫水浴鍋濃縮成稠膏，備用。

2.2 出膏率測定方法 取各試驗組稠膏，置于真空干燥箱105 ℃烘干3 h，移置干燥器中冷卻30 min，迅速精密穩(wěn)定質(zhì)量，以干燥品重量與原藥材重量比計算出膏率。

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 固定相：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（45∶55，每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm[5]；進樣量：20 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.140 mg/mL的對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.2”項下干膏適量，按照比例1∶1.5稀釋。取稀釋液1 mL與硅藻土2.5 g混勻，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲30 min，取上清液2 mL轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，甲醇鹽酸溶液（100∶1）定容得到供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

位于瑞金西北隅岡面鄉(xiāng)竹園村的中央蘇區(qū)紅軍兵工廠，是在第五次反“圍剿”戰(zhàn)爭初期，陸續(xù)從興國、于都等地遷入的官田兵工廠、寨上雜械廠和銀坑彈藥廠等軍工企業(yè)合并而成的。全廠六七百人的職工隊伍中，就有來自江西、福建、廣東、上海、沈陽各地的人。他們有的是自愿當紅軍來的，有的是被俘的國民黨軍人愿意留下來的，有的是經(jīng)當?shù)攸h組織動員或派遣來的。因而由鄉(xiāng)土意識、生活習慣、思想覺悟等差異而產(chǎn)生的不團結(jié)現(xiàn)象時有發(fā)生，有時還因此影響了廠里的生產(chǎn)。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備 按處方比例稱取除黃連外其他處方藥材，8倍水，浸泡1 h，回流2 h進行提取一次進行試驗。煎液濾過、濃縮及定容處理方法同“2.3.3”，制備陰性對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.5 測定法 精密吸取“2.3.2”或“2.3.3”或“2.3.4”項下制得的對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，進行測定，即得。（見圖1）

圖1 鹽酸小檗堿對照品、供試品及陰性對照品HPLC 色譜圖

2.3.6 線性關系考察 分別精密量取“2.3.2”項下制備的對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，制成質(zhì)量濃度分別為2.8 μg/mL、5.6 μg/mL、8.4 μg/mL、11.2 μg/mL、14.0 μg/mL的系列對照品溶液，依照“2.3.1”項的色譜條件進行檢測。依次記錄峰面積，以鹽酸小檗堿對照品峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程y=248 894x+115 651（R2=0.999 6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對照品質(zhì)量濃度在2.8～14.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關系良好。

2.4 單因素考察 分別對清胃散水提工藝中原料藥材粉碎與否、浸泡時間、提取時間、加水量及提取次數(shù)進行了單因素考察，根據(jù)考察結(jié)果，確定Box-Behnken響應面設計法中因素水平范圍。

2.4.1 粉碎度初步考察 按照處方比例，平行稱取原料藥2份，分別以粉碎過12目篩和不粉碎進行試驗，8倍量水浸泡1 h，回流2 h，提取1次，濾過，濾液濃縮，干燥，依法進行鹽酸小檗堿含量測定。結(jié)果顯示，粉碎組鹽酸小檗堿含量明顯高于未粉碎組，故選擇原料藥粉碎過12目篩。

2.4.2 浸泡時間初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥4份，粉碎，過12目篩，分別浸泡0.5、1、1.5、2 h，加8倍量水，回流提取2 h，提取次數(shù)為1次，依法測定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果顯示，浸泡1.5 h后鹽酸小檗堿含量增長不明顯，故響應面設計法浸泡時間的水平選取1、1.5和2 h。

2.4.3 提取時間初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥4份，粉碎，過12目篩，加8倍量水，浸泡1.5 h，提取1次，分別考察回流時間為0.5、1、1.5、2 h對提取效率的影響。結(jié)果顯示，提取時間在1.5 h時鹽酸小檗堿含量有較大的提升，隨后變化不顯著，故響應面設計法提取時間的水平選取0.5、1、1.5 h。

2.4.4 加水量初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥4份，粉碎，過12目篩，分別加入6倍、8倍、10倍和12倍量水，浸泡1.5 h，回流提取2 h，提取1次，依法測定并計算綜合評分，結(jié)果顯示，加水量為8倍時，鹽酸小檗堿含量有顯著提升，隨后呈緩慢上升趨勢，故響應面設計法加水量的水平選取8倍、11倍和14倍。

2.4.5 提取次數(shù)初步考察 按照處方比例，平等稱取原料藥3份，粉碎，過12目篩，加入8倍量水，浸泡1.5 h，回流提取1 h，分別提取1次、2次、3次，依法測定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果顯示，提取2次和3次的鹽酸小檗堿含量差別不大，考慮到實際操作時間成本的問題，在進行響應面設計法優(yōu)選時選取提取2次。

2.5 Box-Behnken響應面設計法優(yōu)化提取工藝

2.5.1 實驗方案設計 基于單因素試驗的結(jié)果，對浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮回流時間（C）3個影響因素進行三因素三水平實驗設計，評價指標為：采用Hassan公式將鹽酸小檗堿和出膏率進行歸一化處理，得到兩個指標的幾何均數(shù)OD值。公式如下：OD=（d1×d2×…dn）/n，n為指標數(shù)，di=（yi-ymin）/（ymax-ymin），yi為實際值，ymax和ymin為同一指標在實驗中的的最大值和最小值[6]。因素水平表和設計結(jié)果見表1～2。

表1 試驗設計因素水平表

表2 Box-Behnken 實驗設計及結(jié)果

2.5.2 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析 采用Hassan公式將鹽酸小檗堿和出膏率2個指標進行歸一化處理，得到綜合評分的OD值。使用Design-Expert 8.0.6對浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮回流時間（C）進行二次多項式回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：OD=0.77+0.11A+0.22B+0.20C-0.099AB-0.025AC-0.003BC-0.11A2-0.15A2-0.23C2。（見表3）

表3 方差分析及顯著性實驗結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知，回歸方程決定系數(shù)R2＝0.95，說明模型擬合情況較好，模型F檢驗P＜0.05，失擬項P＞0.05，表明該回歸模型合理，可以分析和預測本水提工藝。由表3可知，回歸方程中一次浸泡時間（A）、加水量（B）、提取時間（C）均對綜合評分有顯著影響，二次項加水量（B）和提取時間（C）對綜合評分有顯著影響。各因素的影響程度為B＞C＞A。

采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制浸泡時間、加水量、提取時間的綜合評分的三維響應面圖和等高線圖，如圖2～4所示。預測最佳水提工藝為：浸泡1.6 h，加水量為11.6倍，提取時間為1.1 h。

圖2 浸泡時間和加水量對OD 值的等高線及響應面圖

2.5.3 驗證實驗 根據(jù)最佳提取工藝，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，考慮到實際生產(chǎn)工藝操作常取整數(shù)，故調(diào)整最佳水提工藝為：原料藥材粉碎過12目篩，加11倍量水，浸泡1.5 h，提取2次，回流時間為1 h。按照此工藝進行3次平行驗證實驗，OD值分別為0.833、0.829、0.841，平均值為0.834（RSD＝0.843%），與預測值（0.851）一致，說明該水提工藝優(yōu)化后合理可行。

3 討 論

響應面法近年來常被運用于中藥有效成分的提取工藝研究[7-8]，具有實驗次數(shù)少，所得結(jié)果直觀，能夠動態(tài)反應指標變化的優(yōu)點，本試驗依據(jù)清胃散傳統(tǒng)用法，以水為溶媒，回流提取，采用響應面法設計實驗，HPLC法檢測其中君藥黃連中鹽酸小檗堿的含量，實驗中嘗試了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液的不同配比，并比較了265 nm及345 nm兩種檢測波長[5,9]，根據(jù)色譜峰峰形及供試品雜峰的影響，最終選擇乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液45∶55為流動相，檢測波長為265nm。

清胃散為中藥傳統(tǒng)名方，方中黃連苦寒瀉火，直折胃腑之熱，為君藥；升麻取其清熱解毒，以治胃火牙痛，又可取其輕清升散透發(fā)，可宣達郁遏之伏火。加上牡丹皮、生地黃涼血滋陰，共同輔助黃連發(fā)揮清胃瀉火之功，共為臣藥；當歸養(yǎng)血活血，以助消腫止痛，為佐藥，升麻兼以引經(jīng)，兼為使藥。研究表明，該方中君藥黃連主要含有生物堿類化學成分，其中小檗堿含量高達10%[10]，具有廣譜抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌，以及紅色毛蘚菌、白色念珠菌等真菌敏感[11-12]，同時還有明確的抗炎和抗氧化作用[13-15]；而復方的出膏率變化對有效成分含量以及制劑的成型等都有顯著影響。故采用Hassan法對其進行歸一化處理，得到幾何平均OD值[6]作為評價指標，得出的最佳水提工藝為：原料藥材粉碎過12目篩，加11倍量水，浸泡1.5 h，提取2次，回流時間為1 h。

圖3 浸泡時間和提取時間對OD 值的等高線及響應面圖

圖4 加水量和提取時間對OD 值的等高線及響應面圖