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    刺莧提取物體外抑石作用研究*

    2021-11-24 08:38:34江鳳玉張一靜唐靈芝柯俊芳陳蘭妹
    中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年11期
    關(guān)鍵詞:全草草酸鈣正丁醇

    江鳳玉,張一靜,唐靈芝,柯俊芳,陳蘭妹

    (廈門(mén)醫(yī)學(xué)院,福建 廈門(mén) 361023)

    刺莧(Amaranthus spinosus L.)為莧科莧屬一年生草本植物,全草入藥,性甘、涼,有清熱祛濕、散血消炎等療效[1]。因其能夠促進(jìn)膀胱的濕熱之氣向外排出,能夠消石通淋,刺莧用于治療腎結(jié)石,有較好的排石療效,且具有治療周期短、效價(jià)高、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)。刺莧的化學(xué)成分和相關(guān)活性研究文獻(xiàn)報(bào)道較少,目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的活性主要集中在利尿、免疫、降溫[2]、傷口創(chuàng)面愈合、抗菌[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、抗氧化[5-6]等方面。

    腎結(jié)石的主要組成成分草酸鈣(CaOX)存在兩種形式:一水草酸鈣(COM)和二水草酸鈣(COD),其中COM是COD的兩倍[7]。張生等[8]研究證明COD外表較圓鈍,黏附性不好,易于排出體外;而COM外表較尖銳,易黏附在損傷細(xì)胞表面形成結(jié)晶。筆者通過(guò)體外模擬實(shí)驗(yàn),利用電子顯微鏡(EM)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、掃描電鏡(SEM)、X射線(xiàn)衍射(XRD)等檢測(cè)方法,觀(guān)察刺莧提取物在體外是否具有抑制COM的生長(zhǎng)聚集或促使COM向COD轉(zhuǎn)化的作用,評(píng)估刺莧提取物的排石活性。

    1 材料與儀器

    1.1 藥材 刺莧,采自福建省漳平市和平鎮(zhèn)野外,經(jīng)廈門(mén)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系中藥專(zhuān)業(yè)鮑紅娟副教授鑒定為Amaranthus spinosus L.。

    1.2 儀器 Alpha1-2冷凍干燥機(jī)(德國(guó)christ);SQP十萬(wàn)分之一天平(Sartorius);ALPHA傅里葉紅外光譜儀(德國(guó)Bruker);FlexSEM 1000掃描電子顯微鏡(日本高新技術(shù)公司);XRD6100 X射線(xiàn)衍射儀(日本高新技術(shù)公司)。

    1.3 試劑 草酸鈉(泰坦科學(xué)股份有限公司,批號(hào):P1571587);無(wú)水氯化鈣(批號(hào):2004172)、氯化鈉(批號(hào):20170313)、無(wú)水乙酸鈉(批號(hào):20170303)、氫氧化鈉(批號(hào):20200826)、石油醚(60-90)(批號(hào):2102011)、乙酸乙酯(批號(hào):1810091)、正丁醇(批號(hào):1809111)、95%乙醇(批號(hào):2002171)、鹽酸(批號(hào):20071128)均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司,分析純。

    2 方 法

    2.1 刺莧粗提

    2.1.1 刺莧全草粗提 取刺莧全草525 g,加入5倍量的65%乙醇浸漬2 h,超聲功率400 W,溫度40 ℃,提取2次,每次1 h。過(guò)濾,濃縮,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行梯度萃取,濃縮得浸膏后冷凍干燥,得到4個(gè)樣品組分,分別為石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層,置于干燥器中貯存。

    2.1.2 刺莧根粗提 取刺莧根750 g,加入6.5倍量65%乙醇浸漬2 h,超聲功率400 W,溫度40 ℃,提取2次,每次1 h。過(guò)濾,合并濾液濃縮后取少量濃縮液作為醇提層,其余濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行梯度萃取,濃縮得浸膏后冷凍干燥,得到4個(gè)樣品組分,分別為醇提層、石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層,置于干燥器中貯存。

    2.2 溶液配制與樣品制備

    2.2.1 儲(chǔ)備液的配制 溶液A的配制:精密稱(chēng)取無(wú)水氯化鈣、氯化鈉、無(wú)水乙酸鈉,先用純化水溶解,后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容至100 mL,搖勻。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.7,配成濃度為10.0、8.5、1.0 mmol/L的CaCl2溶液。

    溶液B的配制:精密稱(chēng)取草酸鈉、氯化鈉、無(wú)水乙酸鈉,先用純化水溶解,后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容至100 mL,搖勻。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.7,配成濃度為5.0、1.5、1.0 mmol/L的Na2C2O4溶液。

    2.2.2 刺莧提取液的制備 稱(chēng)取刺莧全草和根8個(gè)樣品冷凍干燥組分各0.04 g,量取40.0 mL純化水,制備成1 000 μg/mL提取液,過(guò)濾,用純化水稀釋配制成750、500、250、125 μg/mL的提取液,備用。

    2.2.3 草酸鈣對(duì)照品的配制 按鄧芳等[9]的方法,量取1.1 mol/L的氯化鈣溶液、0.2 mol/L的氯化鈉溶液和適量的純化水于干凈的燒杯中,攪拌均勻后加0.033 mol/L的草酸鈉溶液,使最終溶液中c(Ca2+)=c(C2O42-)=11.0 mmol/L,攪拌反應(yīng)20 min,密封,陳化12 h。

    將陳化好的草酸鈣溶液用0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾,得草酸鈣沉淀,真空干燥,40 ℃,過(guò)夜,得空白對(duì)照品。

    2.2.4 草酸鈣樣品的配制 取干凈燒杯,分別加入1.1 mol/L的氯化鈣溶液,濃度為1 000、750、500、250、125 μg/mL的刺莧根提取物及適量的純化水,參考草酸鈣對(duì)照品的配制,得草酸鈣樣品。

    2.3 刺莧提取物體外抑石作用研究 將制備得到的草酸鈣對(duì)照品和草酸鈣樣品進(jìn)行EM、SEM、FTIR、XRD分析,通過(guò)FTIR檢測(cè)COD紅外特征峰(νs 1 324 cm-1和νas 1 646 cm-1)進(jìn)行定性分析,XRD檢測(cè)COD晶面(200)進(jìn)行定量分析。

    2.3.1 電子顯微鏡法觀(guān)察 24孔板中加入475 μL溶液A,50 μL的1 000 μg/mL刺莧全草水層提取液,475 μL的溶液B,制成不同摩爾比的草酸鈣溶液[10]。以含有50 μL純化水的樣品代替刺莧提取物作為空白對(duì)照。置于不同倍數(shù)的顯微鏡下觀(guān)察,并對(duì)晶體大小、形狀和密度進(jìn)行定性分析。

    2.3.2 SEM觀(guān)察草酸鈣晶體的外部形態(tài)結(jié)構(gòu) 參考文獻(xiàn)[11],制備草酸鈣晶體,量取0.01 mol/L的氯化鈣溶液、0.2 mol/L的氯化鈉溶液及適量的純化水,待攪拌均勻后,加0.01 mol/L的草酸鈉溶液,使c(Ca2+)=c(C2O42-)=1.00 mmol/L,攪拌反應(yīng)20 min,超聲功率100 W,溫度30 ℃,15 min,得樣品溶液。

    在培養(yǎng)皿中放大小相當(dāng)?shù)膱A形濾紙,用鑷子夾取5 mm×5 mm的單晶硅片,光亮面朝上,放于濾紙中央,用1~2滴無(wú)水乙醇清洗硅片,待干后加入上述溶液50 μL,自然晾干,得草酸鈣樣品。進(jìn)行SEM觀(guān)察,電壓10 kV。

    2.3.3 XRD的測(cè)試條件 參照胡鵬等[12]的XRD測(cè)試條件:Cu靶,Kα輻射,40 kV,20 mA;狹縫:DS,1°,RS,0.15 mm,SS,1;掃描速度:8(°)/min,掃描范圍:2θ為5°~60°。

    2.3.4 COD百分含量計(jì)算 按照文獻(xiàn)[13]的實(shí)驗(yàn)方法,用COD(%)=ICOD/(ICOM+ICOD)×100%計(jì)算樣品中COD的百分含量,式中ICOM為COM(101)晶面的強(qiáng)度,ICOD為COD(200)晶面的強(qiáng)度。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 EM結(jié)果分析 空白對(duì)照品中,隨著溶液中Ca/Ox摩爾比的減少,生成的草酸鈣晶體數(shù)量增加,且晶形也不同。(見(jiàn)圖1~8)劉虹等[14]的研究也表明,草酸鹽濃度對(duì)草酸鈣的形成影響更大。在空白對(duì)照品中分別加入1 000 μg/mL刺莧全草水層提取物后,可以發(fā)現(xiàn)所形成的草酸鈣晶體相應(yīng)的數(shù)量增加,但晶形聚集變小,聚集形狀由尖銳變?yōu)檩^圓鈍。由此可見(jiàn),刺莧全草水層提取物具有一定的抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)和聚集的作用。由ZARIN M A等[15]的研究結(jié)果可推測(cè)刺莧全草水層提取物中可能含有皂苷、黃酮苷等成分。

    圖1 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

    圖2 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM圖

    圖3 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM 圖

    圖4 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+):c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM圖

    圖5 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

    圖6 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=10∶1]EM圖

    圖7 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

    圖8 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=1∶5]EM圖

    3.2 草酸鈣對(duì)照品結(jié)果分析

    3.2.1 SEM結(jié)果分析 由文獻(xiàn)[8]可知,草酸鈣晶體的SEM圖像,COM多為外表棱角分明的六角形狀,COD為較圓鈍的四邊形椎體。本實(shí)驗(yàn)制備的草酸鈣晶體對(duì)照品中大多為COM。(見(jiàn)圖9)

    圖9 草酸鈣晶體對(duì)照品的SEM 圖

    3.2.2 FTIR結(jié)果分析 在COM和COD的標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖中,在3 000~3 600 cm-1處的寬峰由O-H的伸縮振動(dòng)引起,其中COM分裂成5個(gè)小峰,而COD為1個(gè)大峰,強(qiáng)度比COM強(qiáng),主要是因?yàn)镃OD比COM多含有1個(gè)H2O。草酸根(COO-)的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νs(COO-)分別為1 316 cm-1和1 324 cm-1,反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νas(COO-)分別為1 620 cm-1和1 646 cm-1。指紋區(qū)COM的吸收帶出現(xiàn)在949 cm-1、885 cm-1和663 cm-1,COD則出現(xiàn)在912 cm-1和611 cm-1處[17]。(見(jiàn)圖10)

    圖10 一水草酸鈣(上)和二水草酸鈣(下)的標(biāo)準(zhǔn)IR 譜圖[16]

    經(jīng)FTIR定性,草酸鈣對(duì)照品草酸根(COO-)的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νs(COO-)與COD的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰相似,而反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νas(COO-)主要存在COM的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰,指紋區(qū)出現(xiàn)COM的吸收峰663 cm-1,說(shuō)明草酸鈣對(duì)照品中同時(shí)存在COM和COD,以COM為主。(見(jiàn)圖11)

    圖11 草酸鈣對(duì)照品IR 圖

    3.2.3 XRD結(jié)果分析 由文獻(xiàn)[7]可知,COM主要晶面為(101)、(020)、(202)、(130),COD主要晶面為(200)、(211)、(400)、(213)。草酸鈣對(duì)照品的XRD圖中以COM晶面為主要存在形式。(見(jiàn)圖12)

    圖12 草酸鈣對(duì)照品XRD 圖

    因此,綜上可以確定草酸鈣對(duì)照品中的主要成分主要為COM。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)FTIR和XRD,將草酸鈣樣品與草酸鈣對(duì)照品進(jìn)行比較,觀(guān)察刺莧根提取物是否可以抑制草酸鈣晶體中COM的生長(zhǎng)或誘導(dǎo)COD的形成,探究其是否存在抑石作用。

    3.3 草酸鈣樣品結(jié)果分析

    3.3.1 FTIR結(jié)果分析 FTIR測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個(gè)刺莧根提取物的5個(gè)不同濃度FTIR結(jié)果相差不大,結(jié)合XRD結(jié)果,分別從中選取一個(gè)作用較明顯的濃度進(jìn)行比較。(見(jiàn)圖13~16)

    圖13 醇提層樣品500 μg/mL IR 圖

    圖14 正丁醇層樣品500 μg/mL IR 圖

    圖15 乙酸乙酯層樣品1 000 μg/mL IR 圖

    圖16 石油醚層樣品1 000 μg/mL IR 圖

    將草酸鈣對(duì)照品與草酸鈣樣品的FT-IR譜圖進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 不同草酸鈣樣品的FT-IR 檢測(cè)結(jié)果

    由表1可知,刺莧根4個(gè)不同部位提取物制備的草酸鈣樣品的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νs(COO-)無(wú)明顯差異,與COD的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰相似。而反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νas(COO-),正丁醇層和石油醚層顯示COD伸縮振動(dòng)峰,醇提層和乙酸乙酯層無(wú)顯著區(qū)別,主要與COM的伸縮振動(dòng)峰相似。

    由FTIR譜圖結(jié)果可知,刺莧根的4個(gè)不同部位提取物制備得到的草酸鈣樣品,均存在COD的特征峰,說(shuō)明刺莧根提取物可以誘導(dǎo)COD的生成,具有一定的抑石活性。

    3.3.2 XRD結(jié)果分析 根據(jù)COD(%)=ICOD/(ICOM+ICOD)×100%計(jì)算COD的百分含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 不同草酸鈣樣品所含COD 的含量

    由表2可知,刺莧根的4個(gè)不同部位提取物制備的草酸鈣樣品中含有一定量的COD,且隨著濃度的增加,誘導(dǎo)生成的COD百分含量增加。由XRD圖可以看出,草酸鈣樣品中均以COM晶面為主要存在形式,COD晶面僅少量存在。(見(jiàn)圖17~18)由此可見(jiàn),刺莧根的4個(gè)不同部位提取物均有一定程度的誘導(dǎo)COD晶體形成的作用,但作用并不顯著。

    圖17 醇提層500 μg/mL XRD 圖

    圖18 石油醚層1 000 μg/mL XRD 圖

    4 結(jié) 論

    腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的常見(jiàn)病,草酸鈣結(jié)石在腎結(jié)石中最常見(jiàn)[18],本實(shí)驗(yàn)采用EM、FTIR、XRD、SEM等方法比較研究了刺莧根4個(gè)不同部位提取物對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的調(diào)控作用。研究表明,4個(gè)不同部位的刺莧根提取物有一定的抑制草酸鈣晶體成核和生長(zhǎng),以及誘導(dǎo)COD晶體形成的作用,但作用不顯著。結(jié)合本課題組的前期研究[19],在以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立的體內(nèi)草酸鈣結(jié)石損傷模型中,刺莧根正丁醇層提取物表現(xiàn)出明顯的排石活性,可以發(fā)現(xiàn)刺莧提取液的排石活性機(jī)制可能主要為利尿作用,抑石作用較為微弱。

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