紅柄白鵑梅葉醇提物對糖尿病小鼠胰腺氧化應(yīng)激的影響

彭華強，蔡金玲，梁文彬

（梧州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 梧州 543000）

隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展，全球的生活模式及飲食習(xí)慣已逐漸改變。我國的飲食習(xí)慣和生活方式已向高脂高糖飲食和輕型體力勞動模式轉(zhuǎn)變，而這種轉(zhuǎn)變使糖尿病患者數(shù)量急劇增加。目前，全球糖尿病患者已達到4.22億，我國則是糖尿病患者最多的國家，且發(fā)病率逐年增長，并有年輕化的趨勢[1-2]。糖尿病是一種胰島素分泌功能障礙的代謝性疾病，目前對糖尿病的治療手段以調(diào)控血糖為主，但無法進行根治，這也意味著糖尿病患者需終身接受治療[3]。對普通家庭來說，糖尿病的治療嚴重增加了家庭的負擔(dān)，且影響患者的生存質(zhì)量。故積極探索治療糖尿病的藥物，對于糖尿病的防治具有重要意義。紅柄白鵑梅葉為薔薇科白鵑梅屬落葉灌木紅柄白鵑梅（Exochorda giraldii Hesse）的干燥葉子，性味甘平，歸肝、腎經(jīng)，其根皮、樹皮、葉子通常作為入藥部位，具有通絡(luò)止痛、清熱解毒的功效，同時具有清除氧自由基的作用[4]。本課題組前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)紅柄白鵑梅葉醇提物具有調(diào)控糖尿病小鼠血糖的作用，但其降糖機制有待探究。故本研究以糖尿病小鼠為模型，探討紅柄白鵑梅葉醇提物對糖尿病小鼠胰腺氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡SPF級雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2019-0005。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫保持于18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h光照晝夜循環(huán)。本研究嚴格按動物倫理要求進行實驗。

1.2 藥物與試劑 紅柄白鵑梅葉購自玉林藥材市場，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院朱丹教授鑒定為紅柄白鵑梅（Exochorda giraldii Hesse）的干燥葉子。紅柄白鵑梅葉醇提物由本實驗室采用70%乙醇溶液，料液比為1 g∶30 mL，在50 ℃溫度下回流提取2 h，過濾，收集濾液。重復(fù)提取3次，合并濾液，用HPDBJQH型大孔樹脂，以70%乙醇洗脫后所得。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥，批號：AAL7603）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號：SLBB8324V）；ROS試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，批號：20191015）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191112）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191114）；氧化氫酶（CAT）試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，批號：20191107）；小鼠空腹胰島素（FINS）ELISA試劑盒（江萊生物，批號：JL19252）。

1.3 主要儀器 DDL-5型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；羅氏卓越型血糖儀（ACCU-CHEK Performa）；MPI-B型化學(xué)反應(yīng)發(fā)光多功能檢測器（西安瑞邁公司）；9602A-酶標儀（北京艾普生物設(shè)備有限公司）。

1.4 造模及分組 隨機取50只昆明種雄性小鼠，實驗前禁食不禁水12 h，尾靜脈注射用4 ℃的枸櫞酸緩沖液（pH=7.4）所溶解的STZ（50 mg/kg），1次/d，連續(xù)注射3 d，注射后予高脂高糖飼料喂養(yǎng)42 d。末次注射后42 d血糖儀檢測小鼠空腹血糖（FBG），以FBG≥11.1 mmol/L的小鼠為糖尿病模型[4-5]。將造模成功的48只糖尿病模型小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組、紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組，每組10只；2只造模失敗小鼠及未能隨機入組的8只糖尿病小鼠排除入組。另取10只健康昆明種雄性小鼠作為正常對照組。

1.5 實驗給藥 二甲雙胍組小鼠灌胃給予二甲雙胍生理鹽水混懸液，32 mg/kg；紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠分別灌胃予高、低劑量紅柄白鵑梅葉醇提物生理鹽水混懸液，劑量分別為150、75 mg/kg；正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 血糖、血清胰島素含量測定[6]末次給藥2 h后，取小鼠尾部末梢血，血糖儀檢測血糖。摘眼球取血，離心分離血清，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清中胰島素（FINS）含量，按公式計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）和胰島素抵抗指數(shù)（IRI）。ISI＝ln（1/FBG×FINS）；IRI＝FBG×FINS/22.5。

1.6.2 胰腺組織病理學(xué)觀察 取血后，頸椎脫臼處死小鼠，鈍性分離胰腺，切取部分胰腺組織置于10%甲醛固定液中，制蠟塊，病理切片，HE染色，觀察胰腺病理學(xué)變化。

1.6.3 胰腺組織中氧化應(yīng)激因子含量測定 切取部分胰腺組織，充分碾磨并經(jīng)RIPA裂解液裂解后，3 500 r/min、4 ℃的高速低溫條件下離心10 min，吸取上清液。ELISA試劑盒檢測胰腺組織中氧化應(yīng)激因子谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

1.6.4 胰腺組織中活性氧（ROS）含量測定 采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法測定胰腺組織中ROS水平。切取部分胰腺組織，制備成10%的組織勻漿，稀釋于pH值為7.4的Krebs-Hepes緩沖液中。加辣根過氧化物酶對其進行催化反應(yīng)。使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光檢測儀對催化反應(yīng)溶液進行發(fā)光檢測，溶液發(fā)光后加入0.1 mL魯米諾（5 mmol/L）。Origin軟件統(tǒng)計發(fā)光峰面積，計算發(fā)光強度表示ROS水平的高低。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進一步采用Bonferroni法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-WallisH秩和檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠給藥前后FBG比較 給藥前，模型組、二甲雙胍組、紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組、紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠FBG均明顯高于正常對照組（P＜0.05），證明造模成功。給藥后，與正常對照組比較，模型組小鼠FBG明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FBG均明顯降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FBG均升高（P＜0.05），且紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠FBG高于紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠給藥前后FBG 比較（，mmol/L）

表1 各組小鼠給藥前后FBG 比較（，mmol/L）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組小鼠胰腺組織病理學(xué)改變情況 正常對照組小鼠胰腺組織細胞完整、胰島數(shù)量豐富，大小均勻；模型組小鼠胰島排列紊亂且分布較散，其大小不一，皺縮變形，有大量空泡出現(xiàn)及炎癥細胞浸潤；二甲雙胍組小鼠胰島形狀有所恢復(fù)，數(shù)量較模型組多，存在少量空泡及炎癥細胞浸潤；紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰島細胞皺縮得到明顯改善，空泡數(shù)量少于模型組；紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠胰島細胞形狀較紊亂，有明顯皺縮現(xiàn)象，存在較多的空泡和炎癥細胞浸潤。（見圖1）

圖1 各組小鼠胰腺的病理學(xué)改變情況（HE，×400）

2.3 各組小鼠FINS、ISI、IRI比較 與正常對照組比較，模型組小鼠FINS和ISI均降低，IRI升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FINS和ISI均升高，IRI均降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠FINS和紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠IRI均降低（P＜0.05），而紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠ISI與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠FINS、ISI、IRI均低于紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠FINS、ISI、IRI 比較（）

表2 各組小鼠FINS、ISI、IRI 比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組小鼠胰腺中氧化應(yīng)激因子活性比較 與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺中SOD、CAT、GSH-Px的活性均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠胰腺中SOD、CAT、GSH-Px的活性均升高（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠胰腺中SOD、CAT、GSH-Px的活性和紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中SOD、CAT的活性均降低（P＜0.05），而紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中GSH-Px的活性與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中SOD、GSH-Px的活性高于紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組（P＜0.05），而CAT的活性與紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠胰腺中氧化應(yīng)激因子活性比較（，U/mg）

表3 各組小鼠胰腺中氧化應(yīng)激因子活性比較（，U/mg）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組小鼠胰腺中ROS含量比較 與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺中ROS含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高、低劑量組小鼠胰腺中ROS含量均明顯降低（P＜0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物低劑量組小鼠胰腺中ROS含量高于二甲雙胍組和紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組（P＜0.05）；紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組小鼠胰腺中ROS含量與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠胰腺中ROS 含量比較（，nmol/mg）

表4 各組小鼠胰腺中ROS 含量比較（，nmol/mg）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與紅柄白鵑梅葉醇提物高劑量組比較，dP＜0.05

3 討 論

糖尿病的發(fā)病、發(fā)展及其并發(fā)癥的出現(xiàn)與氧化應(yīng)激的損傷作用有著密切的關(guān)系。持續(xù)的高糖內(nèi)環(huán)境，可激活糖自氧化、多元醇代謝等反應(yīng)及蛋白激酶C的活性增加，降低自身抗氧化能力，促使ROS的產(chǎn)生，造成機體氧化應(yīng)激，氧化損傷多種蛋白分子，破壞細胞的正常功能和完整性，影響糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[7-8]。糖尿病發(fā)病初期，持續(xù)的高血糖會使25%～50%的胰島β細胞受損，隨著病程的發(fā)展，β細胞受損數(shù)量會持續(xù)增加，甚至?xí)耆珕适砉δ躘9]。因此，緩解機體氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護胰島β細胞功能是預(yù)防或治療糖尿病的關(guān)鍵。

糖尿病發(fā)病的基礎(chǔ)是機體外周組織如肌肉和脂肪的胰島素抵抗和其β細胞胰島素分泌缺陷。而胰島素抵抗程度、胰腺損傷和β細胞數(shù)量減少與ROS的異常有著密切的關(guān)系。正常情況下，胰島素和胰島素受體結(jié)合后會將信號向下游傳遞，正常作用于骨骼肌、肝臟和脂肪。而在ROS異常大量形成的情況下，會阻礙胰島素受體底物1的磷酸化進程，降低胰島素受體底物1與胰島素受體的結(jié)合能力，影響胰島素信號傳導(dǎo)而引起IR的發(fā)生[10-12]。同時機體在氧化還原狀態(tài)失衡時，ROS會影響葡萄糖轉(zhuǎn)運體的正常轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，紅柄白鵑梅葉醇提物能降低糖尿病小鼠FBG和IRI，升高FINS、ISI，提示紅柄白鵑梅葉醇提物有調(diào)節(jié)糖尿病模型小鼠血糖代謝紊亂的作用。

糖尿病病理狀態(tài)下，胰島β細胞中的GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶活性低下，未能有效清除因高糖而產(chǎn)生的過量ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，造成大量ROS及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在胰腺組織中的堆積，形成氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞胰腺組織線粒體內(nèi)外膜的結(jié)構(gòu)，影響線粒體能量代謝，進而抑制β細胞胰島素的合成和分泌[14-15]。本研究結(jié)果顯示，紅柄白鵑梅葉醇提物能增加胰腺組織中CAT、SOD、GSH-Px的活性，減少胰腺組織中ROS的含量，提示紅柄白鵑梅葉醇提物可減少胰腺中ROS的含量，改善機體氧化應(yīng)激水平。

綜上所述，紅柄白鵑梅葉醇提物具有調(diào)節(jié)血糖、改善胰島素抵抗的作用，其作用機理可能與其提高機體中抗氧化因子的活性，減少ROS的含量，以及調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激水平有關(guān)。