蒲公英甾醇通過NOD1/NF-κB通路對Hp相關(guān)性胃炎脾胃濕熱證小鼠改善作用研究*

李翰嵩，賈純亮，梁 磊，張 磊，王 劍，劉遠(yuǎn)廷

（唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種定植于胃黏膜上皮細(xì)胞的慢性致病菌，可引起功能性消化不良、胃癌前病變（胃異型增生、腸黏膜化生等）和胃癌[1-2]。Hp因參與胃癌的發(fā)展，被WHO歸為Ⅰ類致癌物[3]。Hp感染后胃黏膜發(fā)生炎癥改變稱為Hp相關(guān)性胃炎（Hp associated gastritis，HAG），臨床上以脾胃濕熱證癥狀最為常見[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1（nucleotide binding oligomerization domain1，NOD1）是一種重要的模式識別受體，可識別并結(jié)合病原相關(guān)分子模式，激活核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）信號通路，誘導(dǎo)大量促炎性細(xì)胞因子分泌，使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[5]。蒲公英甾醇是從中藥蒲公英中分離的一種五環(huán)三萜化合物，具有抗炎、抗腫瘤活性，可通過調(diào)控NF-κB通路抑制炎癥反應(yīng)，被用于多種炎癥相關(guān)疾病的治療[6-7]。目前，蒲公英甾醇對脾胃濕熱證HAG的臨床治療研究較少，因此本研究擬通過建立脾胃濕熱證HAG模型，探討蒲公英甾醇對脾胃濕熱證HAG小鼠的炎癥抑制作用及機(jī)制，以期為蒲公英甾醇相關(guān)藥物研發(fā)及脾胃濕熱證HAG的臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡健康SPF級C57BL/6小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（22±4）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～55%，亮暗循環(huán)時間比1∶1，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，確保動物福利倫理，經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 蒲公英甾醇（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20940，HPLC≥98%）；Hp菌種（美國ATCC公司，編號：700392）；NOD1激動劑二氨基庚二酸（γ-D-glu-mesodiaminopimelic acid，iE-DAP）（美國InvivoGen公司，批號：20190312）；快速尿素酶檢測試劑盒（上海國藥生物公司）；兔抗鼠p65、p-p65抗體（美國Santa Cruz公司，批號：20190122）；兔抗鼠β-actin抗體（英國Abcam公司，批號：20181106）；小鼠干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IFN-γ-inducible protein 10，IP-10）ELISA試劑盒（批號：20190207）、小鼠干擾素β（interferon β，IFN-β）ELISA試劑盒（批號：20181223）均購自深圳欣博生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 SY96A型全自動酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；LV150N型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；CFX96型熒光定量PCR儀、1658033型電泳儀（美國Bio-rad公司）。

1.4 造模與分組[8]80只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組（17只）和造模組（63只）。采用復(fù)合病因（肥甘飲食+濕熱環(huán)境+Hp菌液）方法制備脾胃濕熱證HAG小鼠模型。造模組小鼠給予高脂飼料自由飲食，12 d后開始置于濕熱箱飼養(yǎng)，溫度（32±2）℃，相對濕度95%，6 h/d，17 d后開始灌胃Hp菌液，1×109CFU/mL，0.2 mL/d，每2 d感染1次，共5次，定植2周，感染及定植Hp期間繼續(xù)給予高脂飼料及濕熱箱飼養(yǎng)；正常組小鼠給予正常飲食+常規(guī)環(huán)境+同步飼養(yǎng)。第37天正常組及造模組分別隨機(jī)選取5只、15只小鼠，斷頭處死后取胃黏膜組織進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)及HE染色。小鼠反應(yīng)遲鈍、精神不振、毛發(fā)松弛無光澤、喜聚少動、肛溫升高、體質(zhì)量減輕、大便稀軟、快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果陽性及HE染色結(jié)果顯示脾胃濕熱證慢性淺表性胃炎,提示造模成功。將剩余的48只造模小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、蒲公英甾醇組、iE-DAP組、蒲公英甾醇+iE-DAP組，每組12只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 蒲公英甾醇組小鼠灌胃蒲公英甾醇[9]（生理鹽水配制），2.5 mg/kg，1次/d，連續(xù)灌胃4周；iE-DAP組小鼠腹腔注射iE-DAP，100 μg/只[10]，1次/周，連續(xù)注射4周；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠灌胃蒲公英甾醇，2.5 mg/kg，1次/d，腹腔注射iE-DAP，100 μg/只，1次/周，連續(xù)給藥4周；正常組和模型組小鼠灌胃、腹腔注射等體積生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組小鼠精神狀態(tài)、大便性狀、飲水、飲食、體質(zhì)量、肛溫、毛色及皮毛順滑度等。

1.6.2 小鼠血清IP-10和IFN-β水平 藥物干預(yù)結(jié)束后次日，脫頸處死各組小鼠，采集下腔靜脈血，室溫靜置1 h，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，上清即為血清樣品。酶標(biāo)板設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，空白孔不加樣品，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔先后加40 μL樣品稀釋液和10 μL血清樣品，晃動混勻后封板，37 ℃孵育0.5 h，清洗液洗滌5次，吸水紙上拍干，除空白孔外，每孔各加50 μL酶標(biāo)試劑，混勻后封板，37 ℃孵育1 h，清洗液洗滌5次，拍干，每孔加100 μL TMB顯色液輕輕震蕩混勻，37 ℃避光20 min，標(biāo)準(zhǔn)品孔前5孔出現(xiàn)顏色梯度變化時，加50 μL終止液終止顯色反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度。

1.6.3 Hp定植率 取小鼠胃組織，稱質(zhì)量后加入PBS于勻漿器中勻漿，取100 μL勻漿液按照快速尿素酶檢測試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測，溶液在15 min內(nèi)顏色由黃色變?yōu)榉奂t色或紅色，尿素酶實(shí)驗(yàn)陽性；溶液仍為黃色則尿素酶實(shí)驗(yàn)陰性。勻漿液梯度稀釋后于哥倫比亞培養(yǎng)平板（含抗生素）上，37 ℃培養(yǎng)7 d，對平板上Hp菌落數(shù)量計數(shù)，以lgCFU與胃組織質(zhì)量比值表示Hp定植，記為lgCFU/g。

1.6.4 小鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化 取部分胃組織，10%甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片機(jī)進(jìn)行組織切片（厚度為4 μm），60 ℃烤片12 h，二甲苯脫蠟，酒精水化，蘇木精-伊紅（HE）染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜炎癥情況。

1.6.5 小鼠胃組織中NOD1 mRNA和受體相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）mRNA的表達(dá)水平 取50 mg胃組織，加液氮研磨，采用Trizol試劑提取總RNA，超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green Master Mix，1 μL 2.5 μmol/L上下游引物，2 μL cDNA，6 μL DEPC-ddH2O；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。qPCR引物使用premier 6.0設(shè)計，序列見表1。

表1 引物序列

1.6.6 小鼠胃黏膜組織p65、p-p65蛋白的表達(dá)水平 取100 mg胃組織，加液氮研磨后提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。95 ℃使蛋白變性，10%SDS-PAGE電泳，80 V恒壓電泳30 min，100 V恒壓電泳約1 h（溴酚藍(lán)接近膠板底端），轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用p65、p-p65和β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，加ECL發(fā)光液于暗室中曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況 正常組小鼠精神狀態(tài)良好，小便、大便、飲水和飲食正常，體質(zhì)量逐漸增加，肛溫基本恒定，皮毛光澤順滑；造模組小鼠在建模過程中出現(xiàn)精神不振，懶動，反應(yīng)遲鈍，小便黃，大便稀軟，飲水減少，食欲下降，體質(zhì)量減輕，皮毛松弛無光澤等脾胃濕熱證表現(xiàn)。蒲公英甾醇組小鼠灌胃開始后精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動量增加，小便顏色變淡，大便逐漸成形，飲水、飲食量增加，體質(zhì)量高于模型組，肛溫低于模型組；iE-DAP組小鼠較模型組脾胃濕熱證癥狀加重，蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠較iE-DAP組脾胃濕熱證癥狀明顯減輕。

2.2 各組小鼠血清IP-10、IFN-β水平比較 模型組小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明顯高于正常組（P＜0.05）；蒲公英甾醇組小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明顯低于模型組（P＜0.05）；iE-DAP組小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明顯高于模型組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明顯高于蒲公英甾醇組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠血清IP-10、IFN-β水平均明顯低于iE-DAP組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠血清IP-10、IFN-β 水平比較（）

表2 各組小鼠血清IP-10、IFN-β 水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒲公英甾醇組比較，cP＜0.05；與iE-DAP組比較，dP＜0.05

2.3 各組小鼠Hp定植率比較 蒲公英甾醇組小鼠Hp定植率低于模型組（P＜0.05）；iE-DAP組小鼠Hp定植率高于模型組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠Hp定植率高于蒲公英甾醇組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠Hp定植率低于iE-DAP組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠Hp 定植率比較（，lgCFU/g）

表3 各組小鼠Hp 定植率比較（，lgCFU/g）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與蒲公英甾醇組比較，bP＜0.05；與iE-DAP組比較，cP＜0.05

2.4 各組小鼠胃黏膜組織病理變化 正常組小鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整、腺體排列整齊、無炎癥細(xì)胞浸潤及充血腫脹；模型組小鼠胃黏膜充血腫脹、上皮結(jié)構(gòu)破壞，腺體結(jié)構(gòu)萎縮、排列無序，固有層有炎癥細(xì)胞浸潤；蒲公英甾醇組小鼠胃黏膜表面光滑、腺體排列整齊、少部分輕度充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤較模型組明顯減輕；iE-DAP組小鼠胃黏膜組織病理損傷程度較模型組加重；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠胃黏膜組織病理損傷較iE-DAP組明顯減輕。（見圖1）

圖1 各組小鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化（HE，×200）

2.5 各組小鼠胃組織中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA表達(dá)水平比較 模型組小鼠胃組織NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于正常組（P＜0.05）；蒲公英甾醇組小鼠胃組織中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組（P＜0.05）；iE-DAP組小鼠胃組織中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于模型組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠胃組織中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于蒲公英甾醇組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠胃組織中NOD1 mRNA和RIP2 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于iE-DAP組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠胃組織中NOD1 mRNA、RIP2 mRNA表達(dá)水平比較（）

表4 各組小鼠胃組織中NOD1 mRNA、RIP2 mRNA表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒲公英甾醇組比較，cP＜0.05；與iE-DAP組比較，dP＜0.05

2.6 各組小鼠胃黏膜組織p65、p-p65蛋白表達(dá)水平比較 各組小鼠胃黏膜組織p65蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組小鼠胃黏膜組織p-p65蛋白表達(dá)水平高于正常組（P＜0.05）；蒲公英甾醇組小鼠胃黏膜組織p-p65蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.05）；iE-DAP組小鼠胃黏膜組織p-p65蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠胃黏膜組織p-p65蛋白表達(dá)水平明顯高于蒲公英甾醇組（P＜0.05）；蒲公英甾醇+iE-DAP組小鼠胃黏膜組p-p65蛋白表達(dá)水平明顯低于iE-DAP組（P＜0.05）。（見表5、圖2）

表5 各組小鼠胃黏膜組織p65、p-p65 蛋白表達(dá)水平比較（）

表5 各組小鼠胃黏膜組織p65、p-p65 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒲公英甾醇組比較，cP＜0.05；與iE-DAP組比較，dP＜0.05

圖2 各組小鼠胃黏膜組織p65、p-p65蛋白表達(dá)Western blotting圖

3 討 論

Hp是革蘭氏陰性螺旋形細(xì)菌，據(jù)統(tǒng)計全球約44億人感染Hp，盡管多數(shù)Hp陽性患者無明顯癥狀，但感染易導(dǎo)致各種臨床疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為Hp感染具有“濕熱”邪氣的相似特征，脾胃濕熱環(huán)境有利于Hp的生長繁殖。西醫(yī)治療通常以四聯(lián)療法根除Hp為主，但易引起患者高耐藥性、高復(fù)發(fā)率及腸道菌群紊亂等問題。中醫(yī)藥具有低毒、高效、副作用小、不易復(fù)發(fā)且不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)勢，因此，中藥用于多種疾病的治療。本研究旨在探討蒲公英甾醇對HAG的治療效果。

蒲公英具有清熱解毒、利尿通淋、消腫散結(jié)的功效。蒲公英包含多種有效成分，如菊苣酸、綠原酸、甾醇、倍半萜烯內(nèi)酯和多糖等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗補(bǔ)體及降血糖等生物學(xué)功效。其中，蒲公英甾醇是其主要有效活性成分之一，CHE L等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇可以減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織損傷，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。ZHENG F等[13]研究表明，蒲公英甾醇可抑制NF-κB激活，降低血管炎癥反應(yīng)。JIANG S H等[14]研究顯示，蒲公英甾醇可通過調(diào)節(jié)小鼠炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)蒲公英甾醇干預(yù)后，小鼠一般情況好轉(zhuǎn)，胃黏膜病理損傷程度減輕，血清IP-10、IFN-β水平降低，Hp定植減少，提示蒲公英甾醇可改善HAG小鼠脾胃濕熱證癥狀，抑制炎癥反應(yīng)。

模式識別受體主要包括RIG-I樣受體、Toll樣受體、NOD樣受體及胞漿病毒DNA受體。其中，NOD1是NOD樣受體家族成員之一，在炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中高度表達(dá)，能識別G-肽聚糖衍生肽iE-DAP，通過半胱天冬酶活化募集結(jié)構(gòu)域以ATP依賴的方式寡聚化并與RIP2相互作用[15]。NOD1/RIP2相互作用導(dǎo)致NF-κB激活，驅(qū)動趨化因子、促炎性細(xì)胞因子及Ⅰ型干擾素產(chǎn)生與釋放[16]。JEON D等[17]研究表明，蒲公英提取物可以通過抑制NF-κB通路減輕LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥變化。SANG R等[18]研究顯示，蒲公英甾醇可通過抑制NF-κB炎癥信號通路和抗凋亡信號通路預(yù)防伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎損傷。本研究結(jié)果顯示，蒲公英甾醇可下調(diào)HAG小鼠胃組織中NOD1 mRNA、RIP2 mRNA和p-p65蛋白表達(dá)，NOD1受體激動劑iE-DAP則呈相反的作用效果，iE-DAP和蒲公英甾醇同時處理后，iE-DAP對通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)，提示蒲公英甾醇可通過調(diào)控NOD1/NF-κB通路改善HAG小鼠脾胃濕熱證癥狀，抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，蒲公英甾醇可改善HAG小鼠脾胃濕熱證癥狀，抑制炎癥反應(yīng)，作用機(jī)制可能與調(diào)控NOD1/NF-κB通路有關(guān)。