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    兩種大鼠哮喘模型的比較

    2014-05-14 11:34:08王雅娟趙一婷湯慧芳蔣雅麗汪雪峰陳季強(qiáng)
    關(guān)鍵詞:酸性白細(xì)胞粒細(xì)胞

    王雅娟,趙一婷,戴 斌,湯慧芳,蔣雅麗,汪雪峰,5,陳季強(qiáng)

    支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,其臨床的典型特征有氣道炎癥、氣道重塑及氣道高反應(yīng)性。目前,用來(lái)制備支氣管哮喘模型用于實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物有很多,包括大鼠、小鼠、豚鼠等,其中豚鼠由于其過敏反應(yīng)易于激發(fā),且與人類相近成為最為常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但使用豚鼠復(fù)制哮喘模型的缺點(diǎn)在于個(gè)體差異較大、難飼養(yǎng)、激發(fā)時(shí)死亡率高,并且用于檢測(cè)的相應(yīng)的分子生物學(xué)材料少見,獲取比較困難。因此,近年來(lái)研究人員更傾向于采用大鼠制作哮喘模型。大鼠來(lái)源廣、繁殖快,激發(fā)后能產(chǎn)生和人類較為相似的過敏反應(yīng),且死亡率較豚鼠低,并且用于檢測(cè)的分子生物學(xué)試劑常見,作為復(fù)制哮喘模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。其中,SD大鼠的應(yīng)用約占到使用頻率的60%左右[1-3]。

    目前,常用于復(fù)制大鼠哮喘模型的方法是用10%的氫氧化鋁凝膠作為佐劑,將卵白蛋白(ovalbumin,OVA)溶于佐劑制成致敏用溶劑,于腹腔或多點(diǎn)皮下注射致敏大鼠,再以O(shè)VA的生理鹽水溶液進(jìn)行霧化攻擊復(fù)制哮喘大鼠模型[4~6]。另有報(bào)道,使用OVA氫氧化鋁凝膠溶液腹腔注射與百日咳桿菌(pertussis)肌內(nèi)注射共同致敏,再以O(shè)VA的生理鹽水溶液進(jìn)行霧化攻擊造成的大鼠哮喘模型[2,7~13],這種新方法與傳統(tǒng)的OVA單獨(dú)致敏有何區(qū)別?百日咳桿菌加強(qiáng)致敏是否能增加模型復(fù)制的成功率?百日咳桿菌單獨(dú)致敏和OVA有區(qū)別嗎?為了解決這些問題,找到一種更為成功的造模方法,我們分別使用了OVA單獨(dú)致敏、pertussis單獨(dú)致敏和OVA+pertussis共同致敏這3種方法致敏大鼠,再進(jìn)行OVA生理鹽水溶液霧化攻擊,觀察以上3種致敏方法所復(fù)制的大鼠哮喘模型的差別。

    1 材料與方法

    1.1 試劑 卵白蛋白(美國(guó)Sigma產(chǎn)品);百日咳桿菌(購(gòu)自上海生物制品研究所);氨甲酰膽堿(Methacholine,MCh,Sigma公司,批號(hào):79H1505);其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠,清潔級(jí),♂,160~180 g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):Scxk(滬)2008-0016。

    1.3 儀器 霧化吸入器(BARI,MASTER,Germany);Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(V5.0,南京美易公司);磁力攪拌器(JB-4,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5840R,Germany);顯微鏡(Olympus BX51,Japan)。

    1.4 動(dòng)物處理 大鼠分為4組,每組12只:①正常對(duì)照組;②OVA單獨(dú)致敏組;③ pertussis單獨(dú)致敏組;④OVA+pertussis共同致敏組。致敏用OVA溶液是將OVA溶于新鮮配制的10%氫氧化鋁凝膠內(nèi),充分?jǐn)嚢杌靹颍琌VA的終濃度為0.2%。OVA致敏方法采用的是本課題組傳統(tǒng)的十點(diǎn)致敏法[10],包括兩前后足趾4點(diǎn),兩側(cè)腹股溝2點(diǎn),頸部1點(diǎn),背部左、中、右3點(diǎn),每點(diǎn)皮下注射0.05 ml OVA凝膠,另腹腔注射0.5 ml OVA凝膠,OVA致敏總體積為1 ml/鼠。致敏用百日咳桿菌溶液以生理鹽水配至1011個(gè)/ml,肌內(nèi)注射0.2 ml,終濃度為2×1010/鼠,d 0對(duì)各模型組大鼠分別按分組組別致敏。致敏d 14開始,用1%的OVA生理鹽水溶液霧化(德國(guó)Master超聲霧化器,1~5μm partical)吸入30 min進(jìn)行攻擊,持續(xù)7 d。

    1.5 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)致敏大鼠末次攻擊后24 h,股動(dòng)脈放血處死。行氣管插管,用D-Hank’s液5 ml分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,反復(fù)抽打,回收BALF,回收率達(dá)95%。以1∶3比例加入白細(xì)胞計(jì)數(shù)液,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù),再以1 500 r·min-1離心10 min,棄去上清液,取20μl沉淀涂片,HE染色后進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

    1.6 致敏大鼠MCh的氣道反應(yīng)性的測(cè)定 致敏大鼠末次攻擊24 h后,用25%烏拉坦4.0 ml·kg-1腹腔注射麻醉大鼠,行氣管插管后,將大鼠置于密閉的自制身體容積描記箱內(nèi)。用Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄儀,記錄麻醉大鼠霧化吸入MCh前、后氣道流速、跨肺壓、潮氣量。實(shí)驗(yàn)時(shí)吸入的MCh由超聲霧化器霧化,吸入濃度依次為0.4、0.8、1.6、4.0、和 8.0 g·L-1,每一濃度霧化吸入 20 s,間隔 5~10 min后吸入下一個(gè)濃度,觀察并記錄吸入后5 min內(nèi)氣道流速、跨肺壓、潮氣量的變化。氣道阻力以跨肺壓與呼吸氣道流速之比計(jì)算,單位為cmH2O·s·ml-1。肺順應(yīng)性以平均潮氣量與平均跨肺壓之比計(jì)算,單位為ml·cmH2O-1。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以ˉx±s表示,采用Sigma Stat軟件包統(tǒng)計(jì),以one-way ANOVA和t檢驗(yàn)作差異的顯著性分析。

    2 結(jié)果

    2.1 不同致敏方法對(duì)大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的影響 由Tab 1、Tab 2可見,OVA+pertussis共同致敏并攻擊組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)升高最明顯,與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01),并且其中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05);OVA單獨(dú)致敏并攻擊組大鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù)也明顯增高,其中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量和正常對(duì)照組相比均明顯升高(P<0.01);pertussis單獨(dú)致敏并攻擊對(duì)大鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯影響,卻可明顯增加嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05),但這一增加作用較OVA單獨(dú)致敏和OVA+pertussis共同致敏并攻擊組微弱很多,對(duì)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞無(wú)明顯影響。

    Tab 1 Total inflammatory cells in bronchoalvelar fluid in OVA+pertussis sensitized,OVA sensitized and pertussis sensitized rats(ˉx±s,n=6)

    2.2 不同致敏方法對(duì)大鼠氣道高反應(yīng)性的影響 由Fig 1可見,OVA+pertussis共同致敏并攻擊組大鼠對(duì)MCh的反應(yīng)性明顯增強(qiáng),在1.6、4.0、8.0 g·L-1濃度的 MCh霧化吸入刺激時(shí),氣道阻力明顯增加,在 0.8、1.6、4.0、8.0 g·L-1濃度的MCh霧化吸入刺激時(shí),肺順應(yīng)性明顯降低,與正常組相比差異有顯著性(P<0.05)。OVA單獨(dú)致敏在4.0、8.0 g·L-1濃度的MCh霧化吸入刺激時(shí),可使氣道阻力明顯增加,肺順應(yīng)性明顯降低(P<0.05),pertussis單獨(dú)致敏在8.0 g·L-1濃度的MCh霧化吸入刺激時(shí),可使氣道阻力明顯增加,肺順應(yīng)性明顯降低(P<0.05)。

    Fig 1 Methacholine-induced increase of lung resistance(RL)and decrease of lung compliance(Cdyn)in OVA+pertussis sensitized,OVA sensitized and pertussis sensitized rats(ˉx±s,n=6)

    2.3 不同致敏方法對(duì)大鼠肺組織HE染色的影響 由Fig 2可見,正常對(duì)照組大鼠氣道壁及肺泡結(jié)構(gòu)正常,氣管黏膜上皮完整,未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。OVA+pertussis共同致敏并攻擊組大鼠氣道周圍及肺間質(zhì)可見有大量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),且支氣管管壁及平滑肌增厚、管腔狹窄,與正常對(duì)照組相比差異明顯。OVA單獨(dú)致敏并攻擊組氣道周圍及肺間質(zhì)也可見大量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),但淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不如OVA+pertussis共同致敏并攻擊組明顯。pertussis單獨(dú)致敏組大鼠氣道周圍也有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),但數(shù)量較OVA+pertussis共同致敏組和OVA單獨(dú)致敏組少很多,且少見嗜酸性粒細(xì)胞。

    Tab 2 Antigen-induced lung inflammatory cells in bronchoalvelar fluid in OVA+pertussis sensitized,OVA sensitized and pertussis sensitized rats(ˉx±s,n=6)

    Fig 2 Histological pathology detection in lung tissues of rats(HE stain,×400)

    3 討論

    近年來(lái),由于環(huán)境污染及社會(huì)因素,哮喘發(fā)病率大大提升,尤其是兒童哮喘的發(fā)病率逐年上升[14-15],這已經(jīng)引起了人們的普遍關(guān)注,如何緩解哮喘的慢性炎癥并減少其急性發(fā)作是目前研究的重點(diǎn)。而一個(gè)成功穩(wěn)定的哮喘動(dòng)物模型在研究哮喘中至關(guān)重要。大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于哮喘模型的復(fù)制有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),如哮喘的發(fā)生特點(diǎn)許多和人類相似,其過敏反應(yīng)也由IgE介導(dǎo),產(chǎn)生的氣道高反應(yīng)性持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),激發(fā)后和人類一樣呈現(xiàn)速發(fā)性與遲發(fā)性雙相反應(yīng)[3],并且遲發(fā)反應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間約為激發(fā)后4~8 h,這與哮喘患者出現(xiàn)遲發(fā)性反應(yīng)時(shí)間非常接近。這些特點(diǎn)都使得大鼠成為目前哮喘的研究中越來(lái)越常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

    一個(gè)成功穩(wěn)定的動(dòng)物模型對(duì)于研究哮喘至關(guān)重要,本研究通過使用OVA和pertussis各自單獨(dú)使用,或二者共同使用3種方法對(duì)大鼠進(jìn)行致敏,再用OVA的生理鹽水溶液進(jìn)行霧化攻擊制備哮喘模型,從支氣管肺泡的炎癥浸潤(rùn)情況、氣道高反應(yīng)性的發(fā)生情況及肺部病理變化方面,觀察模型的成功性。結(jié)果顯示,OVA單獨(dú)致敏和OVA+pertussis共同致敏都可明顯增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中的白細(xì)胞數(shù)量,而pertussis單獨(dú)致敏則對(duì)白細(xì)胞數(shù)量影響較小。我們使用細(xì)胞涂片染色進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù),結(jié)果顯示,OVA單獨(dú)致敏和OVA+pertussis共同致敏都可明顯增加支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量,而pertussis單獨(dú)致敏僅對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量有較弱影響,且對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的增加作用與OVA致敏組相比極其微弱。眾所周知,嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是哮喘發(fā)病中的關(guān)鍵因素,哮喘的急性發(fā)作和慢性氣道炎癥伴隨著嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)和聚集。因此,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明pertussis可在復(fù)制哮喘動(dòng)物模型中起到加強(qiáng)致敏以增加造模的成功率的作用,但是,單用用于致敏不能復(fù)制成功的哮喘動(dòng)物模型。氣道高反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OVA+pertussis共同致敏、OVA單獨(dú)致敏和pertussis單獨(dú)致敏都可一定程度的增加大鼠的肺阻力,并降低其肺順應(yīng)性,但二者共同致敏并攻擊組對(duì)氣道高反應(yīng)性的影響效果明顯大于OVA單獨(dú)致敏組和pertussis單獨(dú)致敏組。肺組織HE染色結(jié)果顯示,OVA+pertussis共同致敏并攻擊組大鼠氣道周圍有大量的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),提示模型成功;OVA單獨(dú)致敏組也可明顯增加氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量,但效果不如二者共同致敏并攻擊組明顯;pertussis單獨(dú)致敏組淋巴細(xì)胞數(shù)量和正常對(duì)照組相比有明顯的增加,但是氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞的增加不明顯,而嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)恰恰是引起哮喘的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞。由此我們推斷,OVA在復(fù)制哮喘動(dòng)物模型的致敏環(huán)節(jié)中必不可少,可作為外來(lái)抗原引起動(dòng)物的免疫炎癥反應(yīng)。百日咳桿菌在致敏中可起到輔助和加強(qiáng)致敏的作用,但是單用不能引起大鼠明顯的氣道炎癥。

    綜合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們得出結(jié)論,OVA是復(fù)制大鼠哮喘模型中的必不可少的致敏物質(zhì),其與pertussis合用用于致敏效果優(yōu)于單獨(dú)使用的致敏效果。因此,OVA和pertussis共同致敏,并用OVA霧化攻擊是一種較為成功的復(fù)制大鼠哮喘模型的方法。

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