關(guān)于親權(quán)鑒定基因座一步突變分析

許玲利 張靜 杜祎銘

摘 要：目的：分析親權(quán)二聯(lián)體親子鑒定中 STR 出現(xiàn)一步突變基因座的原因。方法：應(yīng)用多重 PCR 擴(kuò)增技術(shù)及毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行基因座分型，進(jìn)行DNA 檢測分析。結(jié)果：常染色體 STR 檢測結(jié)果中 D6S1043 基因座存在對樣一步突變，其他 STR 基因座均符合遺傳規(guī)律。結(jié)論：親權(quán)鑒定時發(fā)現(xiàn)基因座出現(xiàn)一步突變，必須增加 STR 位點檢測，計算累計親權(quán)指數(shù)， 正確判斷親權(quán)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：親權(quán)鑒定;短串聯(lián)重復(fù)序列;突變

短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR） 是人類的重要的遺傳標(biāo)記之一。在法醫(yī)學(xué)親子鑒定及遺傳病學(xué)分析中具有有重要作用[1]。STR 基因座突變的現(xiàn)象是親子鑒定中普遍存在的，突變的要機(jī)制與復(fù)制滑動突變密切相關(guān)。

所謂一步突變是指只涉及一個基序的加或減稱為一步突變，約占 STR 基因座的 90%，約有10%的個體涉及多個序列突變，稱多步突變 [3]。最多突變步數(shù)為四步。STR 核心序列的變異可能導(dǎo)致親子鑒定的誤判 [4]。因此法醫(yī)物證人員，尤其關(guān)注 STR 基因座突變。現(xiàn)對 1 例出現(xiàn)一步基因座突變的親子鑒定案件進(jìn)行分析，報告如下。

1 儀器、試劑及方法

1.1儀器及試劑

1.1.1 GeneAmp 9700 熱循環(huán)儀、3500xl 型遺傳分析儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.1.2試劑：21Plex 系統(tǒng)熒光標(biāo)記檢測試劑盒（ 2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA 聚合酶、 PCR Grade Water、Orange-500 。江蘇蘇博醫(yī)學(xué)科技南京有限公司）。AGCU EX 21+1 熒光檢測試劑盒 （ ReactionMix、Primers、Taq 酶、Allelic Ladder、 AGCU MarkerSIZ-500;無錫中德美聯(lián)生物技 術(shù)有限公司）;X-STR 系統(tǒng)熒光標(biāo)記檢測試 劑盒（包括 5×PCR 反應(yīng)緩沖液Ⅳ、5×17X 引物混合 物、去離子水、ORG-500;基點認(rèn)知技術(shù)（北京） 有限公司）。

1.1.3標(biāo)本：選擇直徑 1 cm 大小血斑一份，常溫晾干后存儲于 -20 ℃冰箱。

1.2方法： PCR 擴(kuò)增和電泳分型：PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序依據(jù)各試劑盒說明書嚴(yán)格操作，PCR 擴(kuò)增采用血斑直接擴(kuò)增。擴(kuò)增陽性和陰性對照方法如下：每次擴(kuò)增以陽性對照 DNA作陽性對照，陰性對照擴(kuò)增管中加入純水。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用 ABI3500xl 型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，由Data Collection v3.0 數(shù)據(jù)收集軟件收集電泳數(shù)據(jù)信息，電泳完成后把生成的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 GeneMapper ID-X v1.5 軟件中分析查看各基因座的基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析： 根據(jù)中國漢族人群 STR 基因座的等位基因頻率，根據(jù)規(guī)范推薦突變率，μ 為平均突變率 0.002，進(jìn)行親權(quán)指數(shù)、累積親權(quán)指數(shù)的計算。所有操作均按照法醫(yī)物證鑒定 X-STR 檢驗規(guī)范》、《 親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范書》執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 常染色體 STR 基因座分型結(jié)果

親子鑒定案件運用 21Plex 系統(tǒng)檢測 21 個基因座 分型結(jié)果是否符合遺傳規(guī)律。在該例親子鑒定的案 件中，發(fā)現(xiàn)存在一步突變的可能，涉及的 STR 基因座 為 D6S1043，其余 20 個基因座的檢測結(jié)果全部符合遺 傳規(guī)律（圖 1）。

父親 D6S1043 基因型為11，20”，孩子 D6S1043 基因型為“19，21”，孩子位點“21”與父親 位點“20”相差一個重復(fù)單位考慮有一步突變的可能。D3S1358等20個STR基因座均為人類的遺傳學(xué)標(biāo)記，遵循孟德爾遺傳定律，聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)行親權(quán)鑒定，其累積非父排除概率大于0.9999。綜上檢驗結(jié)果分析，除D6S1043基因座外，父親均能提供給孩子必需的等位基因。在D6S1043基因座，孩子的基因型為“19，21”父親的基因型為“11，20”，父親不能提供給孩子必需的等位基因“19，21”，不符合遺傳規(guī)律。按照GB/T 37223-2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》中不符合遺傳規(guī)律情形時親權(quán)指數(shù)的計算方法，D6S1043基因座的親權(quán)指數(shù)為0.0396。綜上20個STR基因座的累積親權(quán)指數(shù)為19872.9500。

2.2 新增基因座分型結(jié)果

采用 AGCU EX21+1 試劑盒進(jìn)一步檢測，包含 21 個 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 檢測系 統(tǒng)中也包含， 采用 AGCU EX21+1 試劑盒進(jìn)一步檢測，包含 21 個 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 檢測系 統(tǒng)中也包含， D6S474等21個STR基因座均為人類的遺傳學(xué)標(biāo)記，遵循孟德爾遺傳定律，聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)行親權(quán)鑒定，其累積非父排除概率大于0.9999。父親F在D6S474，D12ATA63和D1S1677等基因座不能提供給孩子必需的等位基因（圖 2）。經(jīng)計算，累積親權(quán)指數(shù)為9.9965×10-20（注：小于0.0001）。

2.3 應(yīng)用 GoldeneyeTM DNA 身份鑒定系統(tǒng) 17X 試劑盒，這 16 個 X-STR 基因座在女性群體的累積個人識別率為 0.999 999 999 999 992，在男性群體的累積個人識別率為 0.999 999 996 577 712，在三聯(lián)體中的累積非父排除率為 0.999 999 971，在二聯(lián)體中的累積非父排除率為 0.999 992 574。 這 16 個X-STR 基因座達(dá)到了法醫(yī)物證學(xué)應(yīng)用要求，尤其對特殊的親權(quán)鑒定案件具有重要的應(yīng)用價值。X-STR 基因座上的分型結(jié)果： 本案例又增加檢測了17 個 X-STR 基因座，被 檢標(biāo)本 C 與被檢標(biāo)本 F 的X-STR 基因座大部分不一致，結(jié)果如表 1 所示。

2.4依據(jù)人類染色體遺傳規(guī)律，孩子的遺傳基因一 定來自親生父母雙方 [2]。綜上檢驗結(jié)果分析，D3S1358等40個STR基因座均為人類的遺傳學(xué)標(biāo)記，遵循孟德爾遺傳定律，聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)行親權(quán)鑒定，其累積非父排除概率大于0.9999。綜上檢驗結(jié)果分析，父親F在D6S1043，D6S474和D12ATA63等基因座不能提供給孩子必需的等位基因。經(jīng)計算，累積親權(quán)指數(shù)為5.2314×10-19（注：小于0.0001）。40個常染色體STR基因座分型后 CPI 值為5.2314×10-19（注：小于0.0001）。案例突變 基因座位點和 PI 計算結(jié)果見表 2。

3討論：所謂的突變均是建立于在認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的假設(shè) 上。STR 基因座突變與遺傳多態(tài)性程度有著一定的 關(guān)系，其主要機(jī)制為復(fù)制滑動。復(fù)制滑動突變主要表 現(xiàn)為 STR 基因座等位基因重復(fù)單位的增加或減少 [3]。 序列結(jié)構(gòu)比較均一的基因座容易發(fā)生突變，而等位基 因中含有不完全序列的基因座發(fā)生突變的概率較低，擴(kuò)增片段較大的 STR 基因座更容易發(fā)生突變，這可 能是由于重復(fù)單位多的基因座其長度也較長，必然多 態(tài)性程度也較高，其突變概率會隨之增加 [4]。

司法鑒定技術(shù)規(guī)范要求累計親權(quán)指數(shù)大于 10 000 時，支持被檢測男子（或被檢測女子）是孩子 生物學(xué)父親（或母親），累計親權(quán)指數(shù)小于 0.000 1 支持被檢測男子（或被檢測女子）不是孩子生物學(xué)父親 （或母親）。如果只有 1～2 個基因座不符合遺傳規(guī)律，累計親權(quán)指數(shù)在 0.000 1～10 000 之間應(yīng)增加檢測 其他高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的 STR 基因座，以避免 由于 STR 基因座突變導(dǎo)致錯誤地排除親權(quán)關(guān)系。 該二聯(lián)體案例首先用 21Plex 體系檢測 20 個常染色體STR，出現(xiàn)一個矛盾基因座 D6S1043 ，父親F為（19，21）， 孩子 C 為（11，20），相差 一個重復(fù)單位，累計親權(quán)指數(shù) 19872.9500。考慮到是父女鑒定，使 用 X-STR 試劑盒進(jìn)一步擴(kuò)增檢測，被檢樣本 F 與樣 本C的 X-STR 基因型不相同，說明二人不符合同一母系 遺傳規(guī)律。因為 X-STR 基因座具有伴性遺傳的特征，女性在X-STR基因座具有兩個等位基因，一個來自于父親，一個來自于母親;男性在X-STR基因座僅具有一個等位基因，且來自于母親 ， 不同基因座中存在連鎖的可能。本案例雖然檢測了 17個 X -STR 基因座，但是部分基因座之間存在連鎖 不平衡，鑒于不同的群體中連鎖狀態(tài)不相同，群體遺 傳學(xué)數(shù)據(jù)有限，檢測結(jié)果只是作為參考，未計算親權(quán) 指數(shù)。 STR 基因座等位基因的突變與性別也有著一定 的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，來源于父親的突變多于來源于 母親的突變?；虻耐蛔兟逝c細(xì)胞分裂次數(shù)密切相關(guān)。由于男性精原細(xì)胞在發(fā)育成為精子前要經(jīng)過 多次分離，且分裂次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于女性卵原細(xì)胞分裂的 次數(shù)，因而 DNA 復(fù)制發(fā)生滑動錯配的機(jī)會就增多，突 變概率相應(yīng)增加。除此之外，年齡等因素的影響也會 導(dǎo)致男性 DNA 突變率高于女性 [4]。

總之，常染色體20個STR基因座 檢測結(jié)果中 D6S1043 基因座存在一步突變，其他 STR 基因座均符合遺傳規(guī)律，雖然累計親權(quán)指數(shù)大于 10 000 時，支持被檢測男子（或被檢測女子）是孩子 生物學(xué)父親（或母親），如果只有 1～2 個基因座不符合遺傳規(guī) 律，累計親權(quán)指數(shù)大于 10 000 時，應(yīng)增加其他高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的 STR 基因座的檢測，以避免 由于 STR 基因座突變導(dǎo)致錯誤地排除親權(quán)關(guān)系。必須增加 STR 位點檢測，計算累計親權(quán)指數(shù)， 正確判斷親權(quán)關(guān)系。

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河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 河事緣法醫(yī)物證司法鑒定所 河南鄭州 450003