脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111 對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠NLRP3 炎癥小體的影響

胡 煒，王 剛，王 沛，金海濤，劉建敏，呂建萌，黨星波

（陜西省人民醫(yī)院 急診外科，陜西 西安 710000）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brian injury，TBI）是神經(jīng)外科常見的創(chuàng)傷性疾病，占所有創(chuàng)傷死亡人數(shù)的60%［1］。TBI 可引起炎性巨噬細(xì)胞趨化及炎性因子的釋放，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能缺陷［2，3］。而NLRP3 炎癥小體是調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要多蛋白復(fù)合物［4-6］。已有研究證實(shí)，NLRP3 炎癥小體可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)在TBI［7，8］、缺血性腦中風(fēng)［9，10］、阿爾茨海默?。?1］等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。

BML-111 是一種被證明有效的脂氧素受體激動(dòng)劑［12］。研究發(fā)現(xiàn)，BML-111 可通過激活脂氧素受體產(chǎn)生抗炎作用［12］，因此對缺血性腦中風(fēng)［13］中的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。但是，BML-111 可否抑制TBI 后NLRP3 炎癥小體功能尚不清楚。因此，本研究擬探討脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111 對大鼠TBI后NLRP3 炎癥小體的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康清潔級雄性SD大鼠60只，體重280～340 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于22～24 ℃的溫房中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。本研究所有方案和操作手段已獲得陜西省人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。將其隨機(jī)分為4 組，包括假手術(shù)組（Sham組）、創(chuàng)傷性腦損傷組（TBI 組）、脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111 給藥組（BML-111 組）、脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組（BOC-2 組），每組各15 只。采用顱腦撞擊法建立TBI 模型［14］。用氯胺酮120 mg/kg 和甲苯噻嗪6 mg/kg 麻醉大鼠，將其俯臥位固定在立體定位儀上，于右側(cè)顱骨冠狀縫后尾側(cè)2.3 mm、矢狀縫旁開2.3 mm 處開一直徑5 mm 的骨窗。骨窗處硬腦膜上放一與骨窗大小吻合的墊片及直徑4 mm 的撞針，將20 g 重物從硬腦膜上方15 cm 處通過導(dǎo)管以自由落體撞擊撞針，造成大鼠右側(cè)大腦半球腦挫裂傷；Sham 組僅開骨窗但不給予撞擊。TBI組、BML-111 組和BOC-2 組大鼠建立TBI 模型；術(shù)前30 min，BOC-2 組 腹 腔 注 射50 μg/kg 的BOC-2［15，16］（溶 于0.2 mL 生 理 鹽 水），Sham 組、TBI 組 和BML-111 組腹腔注射0.2 mL 生理鹽水；腦創(chuàng)傷后即刻和腦創(chuàng)傷后24 h，BML-111 組和BOC-2 組腹腔注 射1 mg/kg 的BML-111［13］（溶 于0.2 mL 生 理 鹽水），Sham 組和TBI 組腹腔注射0.2 mL 生理鹽水。

1.2 主要試劑

BML-111 購自美國Sigma 公司，NLRP3 抗體購自美國Abcam 公司，活化Caspase-3 和總Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling 公司，β-actin 和Caspase-1-p20 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz 公 司，IL-1β 和IL-18 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自美國Roche 公司，BOC-2 購自Phoenix Pharmaceuticals 公司。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能評分 腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d 行腦創(chuàng)傷后神經(jīng)損傷評分（neurological severity score，NSS）［2］，其中包括反射實(shí)驗(yàn)、警覺性實(shí)驗(yàn)、協(xié)調(diào)性實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)，最大為18 分，分?jǐn)?shù)越高說明顱腦損傷越重。

1.3.2 Western blot 檢測及ELISA 檢測 腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，各組取5 只大鼠，腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉（80 mg/kg）處死，快速解剖并分離右側(cè)腦皮質(zhì)損傷中心周圍5 mm 區(qū)域。加入RIPA 裂解液充分勻漿，將其等分為兩份：一份用蛋白提取試劑盒提取蛋白檢測NLRP3、Caspase-1-p20、活化Caspase-3 的蛋白表達(dá)，一份用ELISA 試劑盒檢測IL-1β 和IL-18 的蛋白含量（ng/L）。用于Western blot檢測蛋白樣本變性后，聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至0.45 μm 孔徑的PVDF 膜上。5%的脫脂牛奶中室溫封閉后，加入一抗（NLRP3 抗體，1∶1 000；Caspase-1-p20 抗體，1∶400；活化Caspase-3 抗體，1∶400；β-actin抗體，1∶500；總Caspase-3抗體，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的生物二抗室溫反應(yīng)2 h，后行ECL 顯影并拍照。用Quantity One 軟件行圖像分析。NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白水平以目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示，活化Caspase-3 蛋白水平以目標(biāo)蛋白灰度值/總Caspase-3 灰度值表示。

1.3.3 TUNEL法凋亡檢測 腦創(chuàng)傷后3 d和7 d，各組取5 只大鼠，腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉（80 mg/kg）處死，并用4 ℃4%多聚甲醛心內(nèi)灌注。將包含挫傷區(qū)域（Sham 組選取骨窗周圍區(qū)域）的冠狀切塊包埋在石蠟中，做5 μm 的連續(xù)切片。用0.1%Triton X-100 透化2 min，封閉30 min 后，根據(jù)廠商的說明書使用行TUNEL 染色，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）行核復(fù)染。熒光顯微鏡400×倍鏡下觀察損傷側(cè)大腦皮層并攝片，DAPI 染色細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，TUNEL 陽性細(xì)胞核呈綠色熒光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠腦創(chuàng)傷后腦含水率和NSS評分的比較

與Sham 組 比 較，TBI 組 腦 含 水 率 及NSS 評 分在腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d 均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TBI 組比較，BML-111 組腦含水率及NSS 評分在腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d 均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BML-111 組比較，BOC-2組腦含水率及NSS評分在腦創(chuàng)傷后3 d和7 d 均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠腦創(chuàng)傷后腦含水率和NSS評分的比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of brain water content and NSS scores of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表1 4組大鼠腦創(chuàng)傷后腦含水率和NSS評分的比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of brain water content and NSS scores of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：NSS：神經(jīng)損傷評分；Sham 組：假手術(shù)組；TBI 組：創(chuàng)傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組；與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別含水率（%）NSS 評分3 d 0 11.8±0.9a 9.3±0.5ab 11.9±1.1ac 288.2＜0.001 7 d 0 8.5±1.2a 5.4±0.3ab 9.7±1.0ac 149.9＜0.001 Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組F P 71.885±2.420 87.117±3.151a 79.199±5.520ab 85.446±2.246ac 18.65＜0.001

2.2 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層NLRP3和Caspase-1-p20 蛋白表達(dá)的比較

與Sham 組比較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，TBI 組腦皮層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達(dá)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TBI 組比較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，BML-111 組腦皮層NLRP3和Caspase-1-p20 蛋白表達(dá)均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BML-111 組比較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，BOC-2 組 腦 皮 層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達(dá)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2 和圖1。

圖1 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦NLRP3、Caspase-1-p20、活化Caspase-3 蛋白表達(dá)的比較Fig 1 Comparison of the protein expression of NLRP3，Caspase-1-p20，and activated Caspase-3 in the brain of the four groups at different time points after brain trauma

表2 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達(dá)的比較（n=5，±s）Tab 2 Comparison of the protein expression of NLRP3 and Caspase-1-p20 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表2 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達(dá)的比較（n=5，±s）Tab 2 Comparison of the protein expression of NLRP3 and Caspase-1-p20 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 組：假手術(shù)組；TBI 組：創(chuàng)傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組。與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組NLRP3 7 d 0.282±0.035 0.693±0.044a 0.382±0.045ab 0.634±0.097ac 63.29＜0.001 Caspase-1-p20 3 d 0.149±0.010 0.459±0.081a 0.259±0.023ab 0.405±0.071ac 38.73＜0.001 7 d 0.168±0.021 0.484±0.076a 0.218±0.027ab 0.455±0.052ac 64.65＜0.001 FP 3 d 0.296±0.044 0.664±0.088a 0.434±0.043ab 0.616±0.088ac 36.12＜0.001

2.3 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦IL-1β 和IL-18蛋白含量的比較

與Sham 組比較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，TBI 組腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TBI 組比較，腦創(chuàng)傷后3 d和7 d，BML-111 組 腦 皮 層IL-1β 和IL-18 蛋 白 含 量均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BML-111 組比 較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，BOC-2 組腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量的比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of the content of IL-1β and IL-18 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表3 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量的比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of the content of IL-1β and IL-18 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 組：假手術(shù)組；TBI 組：創(chuàng)傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組；與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別IL-1β IL-18 7 d 33.0±5.2 84.9±9.8a 43.4±7.5ab 82.4±9.1ac 65.01＜0.001 Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組F P 3 d 50.0±3.2 119.6±17.5a 71.4±10.9ab 110.5±13.6ac 41.76＜0.001 7 d 54.9±6.5 137.6±20.1a 75.0±10.6ab 141.1±18.5ac 51.08＜0.001 3 d 27.6±6.2 86.8±8.1a 43.8±7.3ab 81.5±15.7ac 49.43＜0.001

2.4 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和活化Caspase-3 蛋白表達(dá)的比較

與Sham 組比較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，TBI 組腦皮層TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)和活化Caspase-3 蛋白表達(dá)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TBI 組 比 較，腦 創(chuàng) 傷 后3 d 和7 d，BML-111 組 腦 皮層TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)和活化Caspase-3 蛋白表達(dá)均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與BML-111 組比 較，腦創(chuàng)傷后3 d 和7 d，BOC-2 組腦皮層TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)和活化Caspase-3 蛋白表達(dá)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4 和圖1、2。

表4 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)和活化Caspase-3 蛋白表達(dá)的比較（n=5，±s）Tab 4 Comparison of the number of TUNEL-positive cells and the protein expression of active Caspase-3 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表4 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮層TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)和活化Caspase-3 蛋白表達(dá)的比較（n=5，±s）Tab 4 Comparison of the number of TUNEL-positive cells and the protein expression of active Caspase-3 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 組：假手術(shù)組；TBI 組：創(chuàng)傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組；與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別TUNEL 陽性細(xì)胞（/mm2）3 d 58±21 563±77a 318±43ab 620±80ac 91.06＜0.001 7 d 79±28 653±98a 324±26ab 700±124ac 69.77＜0.001活化Caspase-3 3 d 0.124±0.015 0.623±0.053a 0.232±0.024ab 0.503±0.085abc 99.60＜0.001 7 d 0.114±0.021 0.608±0.121a 0.318±0.058ab 0.627±0.067ac 52.83＜0.001 Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組FP

圖2 4 組大鼠腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦TUNEL 陽性凋亡細(xì)胞數(shù)的比較Fig 2 Comparison of the number of TUNEL-positive cells in the brain of the four groups at different time after brain trauma

3 討論

TBI 是由機(jī)械性腦組織損傷（原發(fā)性損傷）和繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的［1，17］。原發(fā)性損傷一旦發(fā)生就具有不可逆性，尚缺乏有效的治療手段。而繼發(fā)性損傷具有延遲性，被認(rèn)為是由多種因素共同引起的，其中包括炎癥反應(yīng)惡化及隨后的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［2，18］。因此，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是治療或緩解TBI 的有效手段。

脂氧素是花生四烯酸在脂氧合酶作用下生成的抗炎分子［13］。脂氧素可與其特異性受體（FPR2）結(jié)合，起到限制中性粒細(xì)胞募集、增加抗炎因子生成及促進(jìn)炎性碎片清除的作用［13，19］。該受體可在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等多種炎癥相關(guān)細(xì)胞中表達(dá)［19-21］。已有研究［13］顯示，靜脈注射1 mg/kg 的脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111 可緩解大鼠缺血再灌注損傷所致的炎癥反應(yīng)。因此，參照該文獻(xiàn)，本研究于TBI 后即刻和24 h 腹腔注射1 mg/kg 的BML-111。結(jié)果顯示，該BML-111 治療可顯著減少大鼠腦含水率，降低腦創(chuàng)傷后3 d和7 d 的NSS 評分。此外，本研究結(jié)果還顯示，BML-111 治療可減輕TBI 后腦皮層TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)和凋亡標(biāo)記物Caspase-3 的表達(dá)。這些結(jié)果都說明BML-111 治療可緩解急性腦創(chuàng)傷所致的腦水腫、神經(jīng)功能損傷及細(xì)胞凋亡。

NLRP3 炎癥小體是目前研究最多的炎癥小體［4］。當(dāng)細(xì)胞暴露于外源性或內(nèi)源性病原分子時(shí)，NLRP3 將發(fā)生激活，促使Caspase-1 前體自動(dòng)切割成Caspase-1 活性片段（Caspase-1-p20）［22］?；罨腃aspase-1 可 促 使 活 性IL-1β 和IL-18 分 子 生 成 并 釋放。IL-1β 和IL-18 的產(chǎn)生會進(jìn)一步與其它促炎因子（如TNF-α）產(chǎn)生協(xié)調(diào)作用，加劇腦外傷后的繼發(fā)性損傷。因此，本研究檢測了TBI 后大鼠腦NLRP3、Caspase-1-p20（NLRP3 炎癥小體激活標(biāo)記物）及NLRP3 炎癥小體激活產(chǎn)物（IL-1β 和IL-18）的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，BML-111 治療可抑制TBI 后腦皮層NLRP3、Caspase-1-p20、IL-1β 和IL-18 的生成，說明BML-111 治療具有抗NLRP3 炎癥小體生成的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證脂氧素受體于這種作用的相 關(guān)性，于TBI 前30 min 給予大鼠50 μg/kg 的脂氧素 受 體 拮 抗 劑BOC-2［15，16］。結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，BOC-2 可 逆轉(zhuǎn)BML-111 的抗NLRP3 炎癥小體生成作用。這就提示，BML-111 的抗NLRP3 炎癥小體生成作用主要是通過激活脂氧素受體所產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究證實(shí)了BML-111 可通過抑制NLRP3 炎癥小體激活以緩解大鼠TBI 繼發(fā)性腦損傷，預(yù)示了激活脂氧素受體可能是臨床上治療TBI的新策略和新思路。

作者貢獻(xiàn)度說明：

胡煒：文章撰寫和動(dòng)物模型構(gòu)建；王剛：ELISA 實(shí)驗(yàn)；王沛：免疫熒光實(shí)驗(yàn)；金海濤：Western blot 實(shí)驗(yàn)；劉建敏：動(dòng)物飼養(yǎng)；呂建萌：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及材料收集；黨星波：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及文章校稿。