通管丸含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥模型磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白表達(dá)的影響*

龔 倩，匡繼林，張 翼

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

輸卵管炎性阻塞性不孕（salping obstruent infertility，SOI）是指各種致病菌如生殖道支原體、沙眼衣原體和淋病奈瑟菌等作用于輸卵管，使輸卵管黏膜破壞，或傘端黏連，引起管腔變形、瘢痕形成，甚者與周圍組織器官形成粘連，從而使精卵細(xì)胞的結(jié)合或受精卵運(yùn)送至宮腔受阻導(dǎo)致的女性不孕[1]。近年來，性傳播疾病和宮腔手術(shù)逐年增加，患有SOI的女性越來越多，嚴(yán)重影響患者身心健康及其家庭關(guān)系[2]。

通管丸是在謝劍南教授治療SOI的經(jīng)驗(yàn)方——通管方的基礎(chǔ)上所制成。本課題組前期證實(shí)通管方對(duì)改善輸卵管炎性阻塞性不孕有顯著療效[3]。后逐漸開展了通管方治療輸卵管炎性阻塞性不孕的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究、藥理研究，證實(shí)通管方能降低模型大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量[4-5]，并通過降低或抑制輸卵管上皮EGFR、ICAM-1、BAX表達(dá)而達(dá)到治療SOI的目的[6-7]。但通管丸治療SOI的具體機(jī)制尚不明確，因此本課題通過檢測通管丸含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥模型中磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白表達(dá)水平的影響，探討通管丸對(duì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)TLR2/MyD888/NF-κB信號(hào)通路的影響，從蛋白質(zhì)分子水平對(duì)通管丸治療SOI的作用機(jī)制進(jìn)行闡明，為中醫(yī)藥防治SOI提供切實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8～12周健康SPF級(jí)Wistar雌性大鼠10只，體質(zhì)量（191.84±7.73）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度22～26℃，相對(duì)濕度30%～70%，保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境安靜，通風(fēng)干燥。實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠3 d。

1.2主要藥物及試劑 通管丸藥物組成：穿破石20 g，黨參15 g，茺蔚子10 g，白術(shù)15 g，當(dāng)歸10 g，薤白10 g，丹參10 g，赤芍10 g，澤蘭10 g，乳香10 g，香附10 g，沒藥10 g，王不留行10 g，路路通10 g，甘草5 g，三七5 g，穿山甲7 g。以上所述中藥均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院的中草藥房提供。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)通管丸混懸液高劑量組對(duì)SOI的炎癥抑制最顯著[7]，根據(jù)“人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比率表”折算出大鼠的給藥高劑量為18.9 g/kg；兔多抗P-IRAK4（60 KDa）（Affinity，批號(hào)：DF7567）；兔多抗P-IKK（85KDa）（Affinity，批號(hào)：AF3013）。

1.3 主要儀器JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（BIORAD）；電泳儀（芬蘭雷勃）；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；微型高速離心機(jī)（美國Labnet）；醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Motic 6.0）等。

1.4 血清的制備將10只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。用蒸餾水配置通管丸浸膏高劑量混懸液（1.26 g/mL），實(shí)驗(yàn)組大鼠予通管丸高劑量混懸液（18.9 g/kg）灌胃，對(duì)照組大鼠予等量生理鹽水，2次/d，連續(xù)3 d。在最后一次給藥1 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠四肢固定，解剖，腹主動(dòng)脈采血4 mL，離心后取上血清，56℃水浴30 min滅活，-20℃低溫冷藏備用。

1.5 最佳含藥血清濃度檢測將武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司所贈(zèng)RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為9組，正常培養(yǎng)組、無藥血清組（5%、10%、20%、40%）和含藥血清組（5%、10%、20%、40%），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常培養(yǎng)組添加10%胎牛血清；無藥血清各組分別添加5%、10%、20%、40%濃度的無藥血清，含藥血清各組分別添加5%、10%、20%、40%濃度的含藥血清，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，CCK8法檢測最佳含藥血清濃度[8]。

1.6 RAW264.7細(xì)胞炎癥模型制備參考文獻(xiàn)[9]方法，將RAW 264.7細(xì)胞隨機(jī)分為造模組和非造模組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。造模組的培養(yǎng)基中添加100 ng/mL的LPS，非造模組培養(yǎng)基中添加等量的PBS溶液。誘導(dǎo)24 h后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。將各組離心后取上清液，采用ELISA方法檢測兩組上清液中TNF-α、IL-1β的含量，確定100 ng/mL的LPS是否能夠成功制造巨噬細(xì)胞體外炎癥模型。

1.7 Western blotting檢測磷酸化IRAK4、磷酸化IKKS蛋白相對(duì)表達(dá)量將培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組、NF-κB阻斷劑組、PPAR-γ激動(dòng)劑組、無藥血清組、含藥血清組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組：正常RAW264.7細(xì)胞+10%胎牛血清；NF-κB阻斷劑組：造模后的RAW264.7細(xì)胞+20 μmol/L NF-κB阻斷劑SN50；PPAR-γ激動(dòng)劑組：造模后的RAW264.7細(xì)胞+20 μmol/L吡格列酮；無藥血清組：造模后的RAW264.7細(xì)胞+10%無藥血清；含藥血清組：造模后的RAW264.7細(xì)胞+10%含藥血清；將各組放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，Western blotting檢測磷酸化IRAK4、磷酸化IKKS蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)24 h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見貼壁細(xì)胞胞體較小，呈圓形或橢圓形，少量細(xì)胞可見偽足或突起，單核，呈明顯的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)。（見圖1）

圖1 正常RAW264.7細(xì)胞形態(tài)

2.2 不同濃度含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力影響的比較與正常培養(yǎng)組比較，10%無藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組和20%含藥血清組細(xì)胞活力明顯增加，而40%無藥血清組、40%含藥血清組RAW264.7細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）；5%無藥血清組、20%無藥血清組細(xì)胞活力與正常培養(yǎng)組比較無明顯變化（P＞0.05）。與10%含藥血清組比較，5%含藥血清組、20%含藥血清組和40%含藥血清組的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）。因此濃度為10%的血清為最佳濃度含藥血清。（見表1、圖2）

表1 各組RAW 264.7細(xì)胞活力比較（±s，%）

表1 各組RAW 264.7細(xì)胞活力比較（±s，%）

注：與正常培養(yǎng)組比較，aP＞0.05，bP＜0.05；與10%含藥血清組比較，cP＜0.05

組別 n 細(xì)胞活力正常培養(yǎng)組 3 100 5%無藥血清組 3 98.75±3.07a 10%無藥血清組 3 108.31±2.13b 20%無藥血清組 3 103.09±2.51a 40%無藥血清組 3 94.52±3.37b 5%含藥血清組 3 106.87±2.91b c 10%含藥血清組 3 118.30±0.41b 20%含藥血清組 3 109.69±4.94b c 40%含藥血清組 3 78.12±5.37b c

圖2 各組RAW 264.7細(xì)胞活力比較

2.3 RAW264.7細(xì)胞形態(tài)變化誘導(dǎo)24 h后鏡下觀察，非造模組RAW264.7細(xì)胞無明顯變化，造模組RAW264.7細(xì)胞呈梭形或長梭形改變，大量細(xì)胞呈現(xiàn)偽足或突起，胞體內(nèi)可見吞噬小泡呈炎癥反應(yīng)變化。（見圖3）

圖3 各組RAW264.7細(xì)胞形態(tài)變化（×100）

2.4 各組RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白含量比較與非造模組比較，造模組TNF-α、IL-1β含量明顯增加（P＜0.05），結(jié)合鏡下RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，由此表明巨噬細(xì)胞體外炎癥模型造模成功。（見表2）

表2 各組RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

組別 n TNF-α IL-1β非造模組 8 15.096±1.186 8.178±0.285造模組 8 67.371±1.602 24.589±0.184

2.5 各組RAW264.7細(xì)胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與空白對(duì)照組比較，無藥血清組、NF-κB阻斷劑組、PPAR-γ激動(dòng)劑組、含藥血清組中磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白含量明顯升高（P＜0.05）；與無藥血清組比較，NF-κB阻斷劑組、PPAR-γ激動(dòng)劑組、含藥血清組RAW264.7細(xì)胞中磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白含量均降低（P＜0.05）。（見圖4、表3）

表3 各組RAW264.7細(xì)胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組RAW264.7細(xì)胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與無藥血清組比較，bP＜0.05

組別 P-IKKs/β-actin P-IRAK4/β-actin空白對(duì)照組 0.093±0.018 0.135±0.039無藥血清組 0.453±0.036a 0.608±0.012a NF-κB阻斷劑組 0.342±0.03a b 0.452±0.048a b PPAR-γ激動(dòng)劑組 0.259±0.026a b 0.316±0.030a b含藥血清組 0.236±0.025a b 0.420±0.033a b

圖4 各組RAW264.7細(xì)胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白表達(dá)

3 討 論

SOI屬中醫(yī)“斷緒”“無子”“痛經(jīng)”及“癥瘕”的范疇，其發(fā)病以氣滯血瘀為核心病機(jī)，氣血運(yùn)行不暢，氣滯則血瘀，沖任、胞脈不通，精卵不能交融而致不孕。因此治療本病重在“活血化瘀通絡(luò)”，通過改善輸卵管血液循環(huán)，促進(jìn)輸卵管的炎癥吸收，達(dá)到治療SOI的目的。

通管方中穿破石有活血化瘀、通絡(luò)止痛、解毒消腫之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)穿破石具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用，并且穿破石能夠抑制輸卵管組織的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病變輸卵管上皮細(xì)胞的增生修復(fù)[11]。穿山甲氣腥而竄，貫穿經(jīng)絡(luò)，通滯散結(jié)。二者共為君藥，能夠加強(qiáng)活血化瘀、消癥散結(jié)之功效。當(dāng)歸養(yǎng)血活血調(diào)經(jīng)；丹參活血祛瘀，理氣調(diào)經(jīng)，涼血消癰；茺蔚子調(diào)經(jīng)明目；三七通脈行瘀定痛。四藥共為臣藥，意在疏通血脈，流動(dòng)氣血，使氣血調(diào)和，經(jīng)自通也。香附疏肝理氣；赤芍散瘀止痛，涼血消腫。薤白行氣導(dǎo)滯，通陽散結(jié)；乳香活血，沒藥散血，皆能定痛消腫生??；路路通和血通竅；澤蘭活血祛瘀行水。黨參、白術(shù)補(bǔ)氣健脾。諸藥共為佐藥，加強(qiáng)君藥、臣藥之效，并且使其化瘀而不傷正。甘草為使藥，起到調(diào)和諸藥之效。諸藥合用化瘀消癥，通經(jīng)活絡(luò)，能夠攻邪不傷正，扶正不留邪，使輸卵管復(fù)通，沖任得以調(diào)達(dá)而攝精受孕。

研究表明TLR2/MyD88/NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在輸卵管炎性病變發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的過程中，發(fā)揮了重要的作用[12]。TLR2與配體結(jié)合后，向MyD88蛋白傳導(dǎo)信號(hào)，MyD88進(jìn)一步募集IRAKs家族，其中IRAK4是依賴于MyD88激活的關(guān)鍵蛋白分子，磷酸化的IRAK4與TRAF6形成復(fù)合物，使TRAF6產(chǎn)生低聚作用，進(jìn)一步通過銜接蛋白TAB激活TGF-β與NIK，活化的NIK進(jìn)而磷酸化IKKs，磷酸化的IKKs催化IκB蛋白磷酸化，隨后IκB蛋白被降解，使NF-κB從IkB/NF-κB復(fù)合物中被釋放出來，從而NF-κB得以激活，活化的NF-κB引起促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使大量的炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)積聚浸潤于炎癥部位，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)和放大[13]。IRAK4和IKKs在TLR2/MyD88/NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路中有著承上啟下的作用。研究發(fā)現(xiàn)在R848、LPS及IL-1的作用下，IRAK4激酶失活的模型組小鼠的巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的趨化因子和炎性因子的mRNA穩(wěn)定性明顯降低[14]。研究發(fā)現(xiàn)IKKs催化亞基IKKα和IKKβ的基礎(chǔ)活化質(zhì)粒表達(dá)本身即可誘導(dǎo)NF-κB活化，而失活質(zhì)粒的表達(dá)則顯著抑制NF-κB的活化[15]。

本課題前期實(shí)驗(yàn)研究表明通管方能降低SOI模型大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量，并通過降低或抑制輸卵管上皮EGFR、ICAM-1、BAX表達(dá)而達(dá)到治療SOI的目的。本研究發(fā)現(xiàn)給予通管丸含藥血清后，磷酸化IRAK4和磷酸化IKKs蛋白的表達(dá)明顯降低，因此推斷通管丸可能通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中“關(guān)鍵元件”磷酸化IRAK4和磷酸化IKKs蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的目的。