根皮素通過抑制ERK的激活發(fā)揮慢阻肺氣道的保護(hù)作用研究

陳 愷，鄧巧娟，賈 真，郝林端

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001）

慢性阻塞性肺疾?。ㄒ韵潞喎Q“慢阻肺”）為呼吸科常見慢性氣道炎癥疾病，以持續(xù)性進(jìn)展的氣流受限為主要特征，對我國居民具有巨大消極影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，慢阻肺中存在十分復(fù)雜的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)參與并擴大炎癥進(jìn)程。目前臨床上主要通過藥物治療來達(dá)到松弛氣道平滑肌、幫助患者打開肺部氣道并有效減輕氣道炎癥、減少黏液產(chǎn)生的目的[3]。根皮素是一種存在于蘋果、梨等多種水果與蔬菜汁液中的天然活性物質(zhì)，有極強的抗氧化活性和抗炎作用[4-5]。目前臨床上關(guān)于根皮素在炎癥相關(guān)疾病甚至腫瘤治療過程中發(fā)揮積極作用的研究較多，但關(guān)于其在慢阻肺方面的研究較為貧乏。因此，本研究將討論根皮素發(fā)揮慢阻肺氣道保護(hù)作用的機制，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器根皮素粉（根皮素含量≥98%，批號：1887240）自Sigma公司購入；IL-1β（貨號：69-30375）、TNF-α（貨號：69-30484）ELISA檢驗試劑盒自默沙克生物公司購入；HE染色試劑盒（貨號：E607318）自生工生物工程（上海）股份有限公司購入；黏蛋白5AC抗體（ab3649）、GAPDH(ab9485)抗體自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；ERK抗體（APR12683G）、p-ERK抗體（APR12831G）自Bioworld公司購入；山羊抗兔二抗（31430）、山羊抗小鼠二抗（31460）自賽默飛世爾科技（中國）有限公司購入；PCR所需試劑自日本TaTaRa公司購入；香煙為大前門牌香煙。

ABI 7500型實時熒光定量PCR儀、Multiskan FC酶標(biāo)儀自美國ThermoFisher Scientific公司購入；RC system小動物呼吸機自美國Buxco公司購入；RM2235型輪轉(zhuǎn)式組織切片機自德國徠卡公司購入；BX43光學(xué)顯微鏡購自日本olympus公司。

1.2 慢阻肺大鼠造模及分組

1.2.1 實驗動物 取清潔級SD成年雄性大鼠36只，體質(zhì)量195～272（231.14±19.65）g，均購自常州卡文斯生物科技發(fā)展有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2011-0003。本研究已經(jīng)本院倫理委員會審批（編號：2018-116）。

1.2.2 造模、分組 將36只SD大鼠隨機分為對照組、慢阻肺組、根皮素干預(yù)組，每組12只。大鼠分籠飼養(yǎng)，每日自由進(jìn)水，食顆粒飼料，保持大鼠籠具溫度在22～24℃，相對濕度維持在50.0%～70.0%，照明、造影、換氣等條件均控制在規(guī)定范圍內(nèi)，并每日定時清潔籠具衛(wèi)生，定時添加或者更換大鼠飲用水和飼料，隔天更換籠具。持續(xù)喂養(yǎng)2 d后開始建模。對照組大鼠持續(xù)上述自由喂養(yǎng)4周；慢阻肺組和根皮素干預(yù)組大鼠采用香煙煙熏（CS）+脂多糖（LPS）氣管內(nèi)滴注復(fù)合因素的方式造模。在造模第1天、第14天，將大鼠以10.0%水合氯醛按照0.3 mg/100 g進(jìn)行腹腔麻醉，然后將大鼠固定在鼠板上，完全暴露其喉頭，并用靜脈套管針替代導(dǎo)管，對大鼠進(jìn)行氣管插管，通過靜脈套向大鼠氣管內(nèi)滴注LPS 0.2mL，完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)15 s左右，確保LPS能夠均勻地分布在大鼠肺部。第2～13天，第15～28天，實驗人員每天在有機玻璃密閉箱內(nèi)持續(xù)輸入新鮮的香煙煙霧60 min，20支/d，1 h/d，造模28 d結(jié)束。以大鼠肺功能和肺組織病理學(xué)改變來作為判定造模成功依據(jù)。

1.2.3 給藥 根皮素干預(yù)組：將根皮素溶于1% DMSO溶液中，在造模開始的第15天開始灌胃，劑量為100 mg/kg，3 mL/次，1次/d，連續(xù)給藥2周。對照組和慢阻肺組大鼠均給予等體積的生理鹽水灌胃處理，在造模開始的第15天開始灌胃，1次/d，連續(xù)給藥2周。

1.3 各組大鼠肺功能指標(biāo)的檢測造模結(jié)束后，用10%水合氯醛3 mL/kg注射大鼠腹腔進(jìn)行麻醉，而后仰臥固定于操作臺上，在頸部皮膚位置縱向切開約2 cm切口，機械鈍性分離皮下組織，使氣管完全暴露，而后氣管插管兩端分別和流速、壓力傳感器相連，流速傳感器對應(yīng)端分別與流速、壓力傳感器連接，流速傳感器對應(yīng)端和小動物呼吸機（美國Buxco公司）連接。設(shè)置潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率60次/min。將流速、壓力傳感器分別連接Maclab數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)（美國Buxco公司），描記一段平靜呼吸后，在呼氣末用注射器經(jīng)三通管迅速以相當(dāng)于潮氣量5倍的氣量進(jìn)行充氣，而后立即脫開，連接-25 cm H2O負(fù)壓抽氣造成深呼氣，所引起的容積變化經(jīng)微機處理計算出第0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3）/FVC、氣道阻力以及動態(tài)肺順應(yīng)性。

1.4 各組大鼠炎性因子水平檢測各組大鼠眼球采血，3 000 r/min離心15 min，取上清，-20℃保存，采用ELISA法測定各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平。

1.5 HE染色大鼠處死后，沿大鼠肺門剪下大鼠右肺，PBS洗滌，將副葉、后葉置于4%中性甲醛中進(jìn)行固定，常規(guī)脫水處理，石蠟包埋后進(jìn)行HE染色。其中前葉、中葉放置于液氮中凍存，用于后續(xù)的Western blotting實驗。

肺組織蠟塊處理成5 μm厚的連續(xù)切片，放在60℃烤箱中烤片2 h以防止脫片。HE染色步驟：將切片依次用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；取蘇木精染色5～10 s，取出漂洗，用1%鹽酸乙醇分化5～10 s，漂洗，進(jìn)行伊紅染色1～2 min；繼續(xù)進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明處理；用中性樹脂進(jìn)行封片。在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測各組大鼠黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)取大鼠肺組織適量，用Trizol提取組織的總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在10 μL反應(yīng)體系中，加入2×SYBR熒光染料混合液5 μL，10 μmol的上下引物各1 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸餾水2 μL。反應(yīng)條件：95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、30 s，40個循環(huán)。黏蛋白5AC上游引物：5’-AATGGCTACCTGAACCTCCTCC-3’，下游引物為：5’-AAACTCGCTGGATTCTGGACTG-3’；IL-1β上游引物為：5’-TTAGGAAGACACGGATTCCAT-3’，下游引物為：5’-ATGGCAACTGTTCCTGAACTC-3’；以GAPDH為內(nèi)參，其上游引物為：5’-CAACGGGAAACCCATCACCA-3’，下游引物：5’-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。實驗結(jié)果采用2-△△Ct法由計算機自動計算并讀出定量結(jié)果，進(jìn)行相對定量分析。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組大鼠肺組織黏蛋白5AC、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)取適量肺組織，加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液，3 000 r/min離心10 min，留上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。在上清液樣品中加入等量的2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，待樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳分離，以200 mA恒定電流在冰上轉(zhuǎn)16 h，轉(zhuǎn)移目的蛋白至PVDF膜，并在Western洗滌液中漂洗5 min，加入封閉液，在搖床上緩慢搖動，而后在室溫下封閉2 h。接著往其中分別加入黏蛋白5AC、ERK、p-ERK和GAPDH一抗，在4℃溫度下緩慢搖動孵育24 h，用TBST洗滌液洗滌3次。加入用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗稀釋液，在室溫下封閉2 h，而后繼續(xù)用TBST洗滌3次；之后用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白水平，借助Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參為GAPDH。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，計量資料結(jié)果用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Tamhane T2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠造模后一般情況觀察對照組大鼠呼吸平穩(wěn)且無痰鳴音，大鼠毛發(fā)有光澤，食量、體質(zhì)量均勻增加，狀態(tài)活潑好動。慢阻肺組大鼠呼吸頻率加快，且大鼠出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏、痰鳴音、氣喘、鼻腔分泌物增多、毛發(fā)蓬松、甚至精神萎靡等情況，大鼠食量減小，大便質(zhì)稀，甚至部分大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低情況；隨著造模時間延長，上述癥狀加重。根皮素干預(yù)組大鼠的一般情況處于上述兩種狀態(tài)之間。

2.2 各組大鼠肺組織病理情況HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠的呼吸道、肺泡上皮及支氣管壁結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列齊整，大鼠的氣管及各級支氣管僅見散在的杯狀細(xì)胞，并未出現(xiàn)腺體增生、管壁水腫或者明顯炎細(xì)胞浸潤的狀況。慢阻肺組大鼠的支氣管壁存在大量炎性細(xì)胞附著，并且有一些肺泡管、細(xì)支氣管擴張成不規(guī)則腔狀結(jié)構(gòu)，一些肺泡融合成肺大泡，氣管黏膜上皮壞死、脫落甚至雜亂狀，能看到明顯的杯狀細(xì)胞和腺體增生的情況。根皮素干預(yù)組大鼠的支氣管僅觀察到少量炎性細(xì)胞附著，且肺泡間隔破壞情況明顯較慢阻肺組大鼠輕，但依舊觀察到杯狀細(xì)胞增生及肺泡腔擴張的情況。（見圖1）

圖1 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理情況（×100）

2.3 各組大鼠肺功能比較慢阻肺組大鼠FEV0.3/FVC、動態(tài)肺順應(yīng)性明顯低于對照組（P＜0.05），氣道阻力顯著高于對照組（P＜0.05）；根皮素干預(yù)組大鼠FEV0.3/FVC、動態(tài)肺順應(yīng)性均明顯高于慢阻肺組（P＜0.05），氣道阻力低于慢阻肺組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肺功能比較（±s）

表1 各組大鼠肺功能比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05，與慢阻肺組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）FEV0.3/FVC（%）動態(tài)肺順應(yīng)性（mL/cmH2O）氣道阻力[cmH2O/（mL·s）]對照組 12 83.55±3.16 0.40±0.04 0.41±0.03慢阻肺組 12 59.51±3.61a 0.17±0.02a 0.62±0.06a根皮素干預(yù)組12 73.23±4.82b 0.32±0.02a b 0.47±0.03a b F 74.233 230.389 91.888 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較慢阻肺組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯高于對照組（P＜0.05）；根皮素干預(yù)組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明顯低于慢阻肺組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mg）

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mg）

注：與對照組比較，aP＜0.05，與慢阻肺組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） IL-1β TNF-α對照組 12 63.63±19.06 88.88±10.52慢阻肺組 12 132.18±23.22a 260.32±27.68a根皮素干預(yù)組 12 86.37±16.88a b 181.19±11.41a b F 36.963 263.137 P＜0.001 ＜0.001

2.5 各組大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)水平Western blotting檢測結(jié)果顯示，慢阻肺組大鼠肺組織黏蛋白5AC的蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05），根皮素干預(yù)組大鼠肺組織黏蛋白5AC的蛋白表達(dá)水平明顯低于慢阻肺組（P＜0.05）。經(jīng)RT-qPCR檢測，慢阻肺大鼠黏蛋白5AC mRNA和IL-1β mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05），根皮素干預(yù)組大鼠黏蛋白5AC mRNA和IL-1β mRNA的相對表達(dá)量明顯低于對照組（P＜0.05）。（見圖2、表3）

圖2 各組大鼠肺組織MUC5AC蛋白表達(dá)情況

表3 各組大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05，與慢阻肺組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）黏蛋白5AC蛋白 黏蛋白5AC mRNA IL-1β mRNA對照組 12 0.05±0.01 1.00±0.03 1.03±0.03慢阻肺組 12 2.99±0.35a 2.38±1.17a 2.21±0.40a根皮素干預(yù)組 12 0.96±0.06ab 1.43±0.33ab 1.37±0.40ab F 656.999 12.064 832.127 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組大鼠肺組織ERK蛋白水平比較3組大鼠ERK1/2本底蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）；而在磷酸化活性形態(tài)方面，與對照組比較，慢阻肺組大鼠氣道上皮P-ERK1/2表達(dá)明顯上升（P＜0.05）；與慢阻肺組大鼠比較，根皮素干預(yù)組大鼠氣道上皮P-ERK1/2表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。（見圖3、表4）

圖3 各組大鼠肺組織ERK蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠肺組織ERK蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織ERK蛋白水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05，與慢阻肺組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）ERK1/2 P-ERK1/2對照組 12 1.03±0.06 0.31±0.04慢阻肺組 12 1.02±0.05 1.55±0.16a根皮素干預(yù)組 12 1.00±0.07 0.51±0.04a b F 0.981 574.559 P 0.386 ＜0.001

3 討 論

氣道黏液高分泌癥狀作為慢阻肺的典型特征，是慢阻肺病情發(fā)展及預(yù)后的獨立危險因素，與多種炎癥因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞信號通路存在密切關(guān)系[6]。黏蛋白5AC蛋白為分泌性黏蛋白，主要在支氣管上皮杯狀細(xì)胞中表達(dá)[7]。在健康生理狀況下，黏蛋白5AC蛋白含量并不增加；但在慢阻肺者體內(nèi)，人類內(nèi)源性抗菌肽LL-37、TNF-α、IL-1β、IL-8、表皮生長因子（EGF）及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）等含量明顯增加，而這些因素會通過各種信號通路活化轉(zhuǎn)錄因子，并與相應(yīng)的調(diào)節(jié)位點結(jié)合，對支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生發(fā)揮促進(jìn)作用，因而直接導(dǎo)致黏蛋白5AC蛋白及其mRNA在慢阻肺者體內(nèi)表現(xiàn)為高表達(dá)狀態(tài)[8-10]。

慢阻肺對人體損害極大，最終會造成勞動力喪失甚至死亡。因而，如何防治慢阻肺的發(fā)生、延緩其發(fā)展在目前臨床上關(guān)注度較高。中藥單體在慢阻肺治療方面得到越來越多的關(guān)注，且目前臨床上對中藥在慢阻肺中的治療作用的研究越來越多。余歡等[11]研究發(fā)現(xiàn)魚腥草提取物能有效減緩慢阻肺大鼠肺組織損傷，可能是通過抑制ACE2、p38MARK通路發(fā)揮肺組織保護(hù)作用。劉靈等[12]通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，體外培育牛黃能顯著減輕慢阻肺大鼠炎癥反應(yīng)，并對大鼠肥胖上皮細(xì)胞凋亡有一定積極意義。李玉屏等[13]研究表明，白藜蘆醇能有效減輕慢阻肺大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。既往研究表明[14]，根皮素能減輕γ-干擾素誘導(dǎo)的肺部纖維細(xì)胞炎癥及CS誘導(dǎo)的氣道炎癥。意味著根皮素可能在慢阻肺疾病中同樣具有一定的保護(hù)作用。閔捷[15]研究發(fā)現(xiàn)，根皮素能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖與遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但目前臨床上關(guān)于根皮素在慢阻肺方面的研究比較少見。

本研究建立了慢阻肺大鼠模型，從各組大鼠一般情況及組織病理形態(tài)可以看出，慢阻肺造模大鼠出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏、痰鳴音、氣喘、鼻腔分泌物增多等臨床癥狀，且HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢阻肺模型大鼠的支氣管壁存在大量炎性細(xì)胞附著，還存在明顯的杯狀細(xì)胞和腺體增生的情況，與慢阻肺的主要病理特征相似，證明本研究模型制備成功。此外，從HE染色組織病理結(jié)果可以看出，根皮素干預(yù)組大鼠肺組織形態(tài)等各方面均較慢阻肺組大鼠明顯改善。提示根皮素可能在慢阻肺的治療過程中具有積極的意義。本研究采用根皮素干預(yù)慢阻肺大鼠后發(fā)現(xiàn)，根皮素干預(yù)組大鼠FEV0.3/FVC、動態(tài)肺順應(yīng)性以及氣道阻力均明顯較慢阻肺組大鼠改善；根皮素干預(yù)組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯低于慢阻肺組。說明根皮素能夠有效改善慢阻肺炎癥反應(yīng)，改善肺功能，并能有效降低慢阻肺肺組織的病理損害。

本研究通過Western blotting、RT-qPCR法檢測了黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根皮素干預(yù)組大鼠黏蛋白5AC蛋白及黏蛋白5AC mRNA、IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯低于慢阻肺組；提示根皮素能夠進(jìn)一步降低黏蛋白5AC蛋白及炎癥因子的表達(dá)，對慢阻肺氣道黏液高分泌及炎癥情況具有積極的治療意義。此外，眾多研究表明[16-18]，MAPK通路的磷酸化（包括P38激酶，ERK和JNK）被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，在基因表達(dá)調(diào)控及多種疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。ERK信號通路被認(rèn)為在生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化過程中發(fā)揮著重要作用[15]。而抑制ERK磷酸化，能夠有效降低氣道黏液高分泌。LI C L等[19]研究表明，在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展過程中，ERK激活產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6），加重氣道炎癥并破壞正常肺泡結(jié)構(gòu)；采用調(diào)理肺湯處理可以下調(diào)p-ERK蛋白的表達(dá)，抑制ERK信號可以有效地抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。LIM H S等[20]研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚可通過下調(diào)p38 MAPK/ERK信號通路抑制LPS誘導(dǎo)小鼠海馬和皮質(zhì)組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，根皮素干預(yù)組大鼠ERK1/2本底蛋白表達(dá)與其他各組無明顯差異，P-ERK1/2蛋白明顯低于慢阻肺組，說明根皮素能夠抑制P-ERK1/2表達(dá)。提示根皮素可能通過抑制磷酸化活性形式的P-ERK1/2的表達(dá)來達(dá)到降低氣道黏液分泌的目的，進(jìn)而減輕肺組織炎癥反應(yīng)，有效修復(fù)肺組織，改善病情。

綜上所述，經(jīng)CS+LPS因素造模后，大鼠出現(xiàn)典型慢阻肺癥狀，且大鼠肺功能降低，炎癥因子、黏蛋白5AC蛋白、ERK蛋白等分泌增加；經(jīng)根皮素干預(yù)后，慢阻肺大鼠肺功能明顯改善，炎性因子、黏蛋白5AC蛋白分泌減少，其作用機制可能與抑制ERK磷酸化有關(guān)。但由于中藥普遍存在多靶點治療的情況，可能還存在其他作用機制有待進(jìn)行深入探討。