稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中Netrin-1、DCC、UNC5B和VEGF表達

黃鐘慧 韓秋峪

1.徐州醫(yī)科大學淮安婦幼臨床學院(223001)；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院

稽留流產(chǎn)(MA)出現(xiàn)在妊娠20周前，胎兒或胚胎已死亡但在宮腔滯留未自然排出[1]?？蓪е缕渖ο陆担{孕婦的生命安全[2]。近年來子宮胎盤血管循環(huán)障礙所致疾病在圍產(chǎn)醫(yī)學領(lǐng)域被重視，有學者對胎兒宮內(nèi)生長受限(FGR)、子癇前期子宮胎盤循環(huán)障礙的影響因子進行了研究[3]，但在早孕稽留流產(chǎn)方面的研究較少。研究證實，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管肽素(ANG)、纖維母細胞生長因子(FGF)等促血管生成因子皆與胎盤血管產(chǎn)生相關(guān)[4]。另有部分新的血管產(chǎn)生調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)軸突導向因子(Ntrin-1)及其受體結(jié)直腸癌缺失基因(DCC)、不協(xié)調(diào)同源基因5B(BUNC5B)被逐步發(fā)現(xiàn)。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)及免疫組織化學技術(shù)(IHC)檢測MA絨毛組織中Netrin-1及其受體DCC、UNC5B和VEGF的表達，分析各因子在稽留流產(chǎn)發(fā)生中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

2020年2月-2020年8月本院計劃生育科門診醫(yī)治并確診為稽留流產(chǎn)患者30例(稽留流產(chǎn)組)。納入條件：年齡20～34歲；孕8～12周。平素月經(jīng)規(guī)律，末次月經(jīng)時間準確；彩超檢查診斷：頭臀≥7mm，無胎心搏動現(xiàn)象；妊娠囊直徑均值≥20mm，無胚胎。宮腔內(nèi)妊娠無卵黃囊存在，經(jīng)過2周依然無胚胎與胎心搏動出現(xiàn)。宮腔內(nèi)妊娠有卵黃囊，經(jīng)過11d依然無胎心搏動現(xiàn)象[5]；無孕期服用激素類藥物經(jīng)歷，術(shù)前無米非司酮與米索前列醇藥物流產(chǎn)經(jīng)歷。同期非意愿妊娠待行終止妊娠手術(shù)的正常早孕女性30例為對照組。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究得到院倫理委員會同意。

1.2 標本的收集及處理

兩組對象術(shù)前均完善相關(guān)檢查，均在靜脈麻醉下經(jīng)腹部超聲引導行人工流產(chǎn)負壓吸宮術(shù)。將吸出絨毛組織快速分離成2份，明確標記后其中1份放入-80℃ 凍存?zhèn)湫蠵CR檢測，另1份4%福爾馬林中固定備行IHC。

1.3 實驗方法

1.3.1絨毛組織中Nterin-1 mRNA、DCC/UNC5B mRNA、VEGF mRNA的表達采用實時熒光定量PCR檢測。按總RNA提取試劑盒說明書步驟提取絨毛組織總mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴增。PCR反應條件：95℃預變性3min，95℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，取凝膠放入凝膠掃描成像儀，將GAPDH當做標準化內(nèi)參，定量選擇相對Ct法，利用2-△△Ct法求解Nterin-1、DCC/UNC5B、VEGF表達。基因引物序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

1.3.2絨毛組織中Netrin-1、DCC、UNC5B、VEGF的表達采用IHC檢測。取4%甲醛固定液固定的絨毛組織，制片、切片、脫水、浸蠟、包埋。采用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加Netrin-1(1:100)、DCC(1:200)、UNC5B(1:200)、VEGF(1:200)一抗，置4℃濕盒內(nèi)孵育15h，加酶標二抗，于37℃下孵育20min，加顯色劑，復染，脫水，封片；陰性對照，滴加物則由一抗換成PBS，鏡檢拍照。鏡下隨機選5個視野，圖像染色強度處理使用ImagePro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics,USA)分析，IHC染色強度以光密度(IOD)表示，OD值越大陽性反應越強烈。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組一般資料無差異 (P>0.05)。見表2。

2.2 mRNA相對表達量

稽留流產(chǎn)組Netrin-1 mRNA、DCC mRNA、VEGF mRNA的相對表達量低于對照組，UNC5B mRNA相對表達量高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 蛋白相對表達量

IHC檢測表明，兩組Netrin1、DCC、UNC5B、VEGF蛋白相對表達量均存在差異(P<0.05)。見表4、圖1～4(1540頁)。

表2 兩組一般資料比較

表3 兩組絨毛組織中各 mRNA相對表達量比較

表4 兩組絨毛組織蛋白表達情況比較

3 討論

近年來稽留流產(chǎn)發(fā)病機制的研究在遺傳學、免疫學、感染及環(huán)境方面有較大進展，而子宮胎盤循環(huán)障礙所致的不良妊娠結(jié)局引起了廣大學者關(guān)注。胎盤血管網(wǎng)的良好形成對胎兒宮內(nèi)發(fā)育起著極其重要作用[6]。如果胎盤血管發(fā)育不良、血流灌注不足、胎盤微循環(huán)障礙則可導致胎盤功能不全、胎盤植入障礙，母體氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、免疫因子等不能通過血管網(wǎng)進入胎兒體內(nèi)，造成胎兒生長所需物質(zhì)減少進而導致胚胎發(fā)育的停止或死胎等[7]。近年來Netrin-1及其受體DCC、UNC5B在胎盤循環(huán)中所起的作用引起較多關(guān)注。維持妊娠胎盤的各因子表達相互協(xié)調(diào)、互相影響，平衡被打破可導致胎盤血管生成不足，增加稽留流產(chǎn)的概率。

本研究對絨毛組織檢測顯示，與對照組比，稽留流產(chǎn)組Netrin1、DCC、VEGF蛋白及mRNA的表達均降低，UNC5B蛋白及mRNA的表達均增高。Netrins幾乎在全部物種的神經(jīng)系統(tǒng)中都有高度表達。研究表明，Netrins與細胞外基質(zhì)蛋白層粘連蛋白存在極大的相似性特征[8]。Netrin-1屬于Netrins家族成員之一，存在典型的雙重導向，當神經(jīng)細胞軸突生長錐體現(xiàn)受體不同時便能予以激活。從結(jié)構(gòu)劃分可將Netrin-1 受體列為兩種：第1種為DCC[9]：第2種為UNC5同源物(UNC5H)。有研究推測可能有許多相同的信號因子共同參與了血管機體的神經(jīng)分布和血管化[10]。胎盤部位并沒有神經(jīng)，不過胎盤絨毛發(fā)育期間會形成似神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，已研究有證實，Netrin-1/Neogenin 軸對細胞的生長發(fā)育有一定作用。另外胎盤的三級絨毛血管內(nèi)皮細胞中有 Netrin-1，對細胞生長起一定作用[11]。有學者對FGR、子癇前期子宮胎盤循環(huán)障礙的影響因子Netrin-1及其受體DCC、UNC5B進行了研究，結(jié)果顯示，Netrin-1及其受體DCC在上述病變的胎盤組織中呈低表達，UNC5B呈高表達，胎盤局部的Netrin -1影響胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的生長可能性較大，會導致胎盤血管面積過小，胎盤供血不能維持胎兒生長導致疾病發(fā)生。王君等[12]分析稽留流產(chǎn)絨毛和蛻膜組織，結(jié)果提示Netrin-1及其受體DCC的表達受限，而UNC5B高表達，這就意味著Netrin-1及其受體DCC可以作為胎盤血管生長的正性調(diào)節(jié)因子的概率較大，兩者成正相關(guān)關(guān)系，維持良好的胎盤循環(huán)，維持正常妊娠。低表達說明阻止了正常的胎盤循環(huán)，可能會造成稽留流產(chǎn)。UNC5B在稽留流產(chǎn)中高表達，說明其可能為負性調(diào)節(jié)因子，高表達可能抑制了胎盤血管的生長發(fā)育，可能會造成稽留流產(chǎn)。VEGF屬糖蛋白，對血管內(nèi)皮細胞有顯著影響，是缺氧誘導因子(HIF-1α)靶點?；騐EGF在血管形成過程中主要是通過促進內(nèi)皮細胞的功能來調(diào)控血管發(fā)生和生成。VEGF家族是已知的調(diào)節(jié)胎盤血管生成的重要因素[13]。

Netrin-1、DCC、VEGF屬于正性調(diào)節(jié)因子，能夠使胎盤血管內(nèi)皮細胞發(fā)生變化、遷移，維持正常妊娠，其低表達可能導致胎盤血管內(nèi)皮細胞的增生、遷移受阻，胎盤絨毛血管無法發(fā)育完全，導致胎盤血管面積變小，胎盤供血不能維持胎兒正常發(fā)育，胎盤血液循環(huán)發(fā)生障礙，母一胎營養(yǎng)與氣體交換無法良性運轉(zhuǎn)，進而可能出現(xiàn)稽留流產(chǎn)。UNC5B為負性調(diào)節(jié)因子，高表達可以導致血管增生、遷移、侵襲受抑制，胎盤血管循環(huán)障礙，導致稽留流產(chǎn)發(fā)生。這4個因子均在胎盤血管的形成及發(fā)育、胎盤血管重塑方面起一定作用，維持穩(wěn)定的胎盤血管循環(huán)。

本研究也存在不足，僅檢測了稽留流產(chǎn)絨毛組織中Netrin-1、DCC、UNC5B和VEGF蛋白及mRNA表達。下一步研究有必要考察稽留流產(chǎn)患者血清中上述因子的表達，如果血清中也存在類似變化趨勢，是否可以根據(jù)血清內(nèi)各個因子的表達水平前瞻性地補充因子，以阻止或緩解胎盤循環(huán)障礙，預防和治療稽留流產(chǎn)。上述假說仍有必要開展系統(tǒng)的研究進行驗證。

綜上所述，稽留流產(chǎn)絨毛組織中Netrin-1、DCC、VEGF蛋白及mRNA表達低于正常孕婦，UNC5B蛋白及mRNA的表達高于正常孕婦，這種異常表達與稽留流產(chǎn)絨毛血管的生成障礙可能有關(guān)。