海參皂苷Holothurin A 和Echinoside A 對肥胖小鼠尿酸代謝的影響

巨盛楠，徐慧靜,2，王玉明,3，李兆杰，薛長湖,3，張?zhí)裉?*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.永嘉縣市場監(jiān)督管理局，浙江溫州 325100；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東青島 266237）

隨著膳食結(jié)構(gòu)和飲食生活習(xí)慣的變化，肥胖人群的比率呈逐年上升趨勢。除糖、脂代謝異常外，肥胖患者存在明顯的尿酸代謝紊亂[1?3]。尿酸代謝異常通常表現(xiàn)為體內(nèi)尿酸水平升高[4?6]，臨床治療困難，目前不能完全置治愈。因此，有必要篩選安全有效、天然來源的功能性食品成分預(yù)防肥胖引起的尿酸代謝異常。

尿酸代謝異常與肝臟尿酸合成增多及腎臟尿酸分泌減少密切相關(guān)[4]。皂苷是一類苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的糖苷。文獻(xiàn)報道皂苷具有改善腎臟損傷的作用，但并沒有深入研究皂苷對尿酸代謝的影響[7?8]。海參成分復(fù)雜，皂苷是海參的主要次級代謝產(chǎn)物[9]。海參皂苷結(jié)構(gòu)上具有明顯區(qū)別于陸地來源皂苷的硫酸酯化基團(tuán)。前期研究發(fā)現(xiàn)海參總皂苷可顯著降低高嘌呤飲食誘導(dǎo)的小鼠血尿酸水平[10?11]。Holothurin A（HA）和Echinoside A（EA）是海參總皂苷中含量較高的兩種單體[12?15]。二者結(jié)構(gòu)相似，均為海參烷型三萜皂苷，其母核的20 位C 原子上鏈有6 個碳原子的側(cè)鏈，但HA 側(cè)鏈上存在環(huán)氧結(jié)構(gòu)[15]。目前關(guān)于HA 與EA 在體內(nèi)調(diào)節(jié)尿酸代謝的構(gòu)效關(guān)系尚未報道。

db/db 小鼠是一種自發(fā)肥胖性代謝綜合征模型[16?17]，本研究比較海參皂苷單體HA 和EA 對db/db肥胖小鼠尿酸代謝的影響，為海參皂苷的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性C57/BL6 小鼠、db/db 小鼠體重（20±2）g 南京君科生物工程有限公司；海參皂苷單體HA 和EA 均由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類健康實驗室提供，純度為91%，結(jié)構(gòu)如圖1 所示；尿酸、尿素氮、肌酐、黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶試劑盒 南京建成生物科技有限公司；伊紅 上海試劑三廠；蘇木精 上海藍(lán)季科學(xué)發(fā)展有限公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega 公司；dNTP 大連寶生物工程有限公司；RNAase inhibitor 美國Roche 公司；EvaGreen 2X qPCR MasterMix 愛必夢生物科技有限公司；Random Primer 上海生工生物工程股份有限公司；其他的生化試劑 均為國產(chǎn)分析純。

圖1 海參皂苷Holothurin A 與Echinoside A 結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Holothurin A and Echinoside A

Spark 10M 型酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；UV-2550 型分光光度計 上海元析儀器有限公司；Neofuge 23R 型臺式離心機(jī) 上海力新儀器有限公司；BH–200 型光學(xué)顯微鏡 舜宇光學(xué)科技有限公司；H–7000 型透射電鏡 日本日立公司；IQ5 型Realtime PCR 儀 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及飼料配制 將雄性db/db 小鼠按體重隨機(jī)分成3 組，分別是模型組、海參皂苷HA 組（HA）、海參皂苷EA 組（EA），每組8 只，C57/BL6 小鼠為正常對照組。動物飼料配方以AIN-93 配方為基礎(chǔ)并加以調(diào)整，海參皂苷HA 和EA 組在模型組飼料的基礎(chǔ)上減少玉米淀粉的添加量，再分別添加0.07%的海參皂苷單體HA 和EA，飼料成分如表1所示。

表1 動物實驗飼料的成分Table 1 Compositions of experimental diets

1.2.2 動物實驗 各組小鼠在環(huán)境溫度（23±2） ℃、相對濕度65%±15%的條件下自由地進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，每日記錄其體重及攝食量。干預(yù)2 周后稱重，眼球取血，致死，立即解剖并迅速地取出肝臟、腎臟，稱重后經(jīng)液氮速凍保存于?80 ℃冰箱備用。解剖過程中取2 份腎臟組織分別迅速投入10%中性甲醛和4%戊二醛溶液中固定，用于制備切片。

1.2.3 腎臟生化指標(biāo)測定 血液在室溫靜置30 min后，離心（2000×g，15 min）后得到血清，按照試劑盒說明分別測定血清尿酸水平、血清肌酐水平、血清尿素氮水平。

1.2.4 肝臟酶活測定 取小鼠肝臟勻漿取上清液，通過比色法測定肝臟黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）和腺苷脫氨酶（Adenosine Deaminase，ADA）的活性，按照試劑盒說明書測定。

1.2.5 腎臟切片光學(xué)顯微鏡觀察 將10%中性甲醛固定的腎皮質(zhì)由石蠟包埋制成4 μm 切片，經(jīng)蘇木精、伊紅染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.6 腎臟切片透射電鏡觀察 用4%戊二醛溶液固定的腎皮質(zhì)制備切片，于電鏡下觀察腎小球的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 腎臟尿酸代謝相關(guān)基因mRNA 測定

1.2.7.1 總RNA 提取 取0.1 g 腎臟，采用Trizol 法[18]，提取組織總RNA，測定260、280 nm 下吸光值A(chǔ)，計算A260與A280的比值在1.9～2 之間以保證RNA 的高純度，再通過1.2%瓊脂糖電泳結(jié)果驗證腎臟RNA 未被降解。

1.2.7.2 RT-qPCR 檢測基因表達(dá)量 取1 μg 腎臟總RNA，依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將得到的腎臟cDNA 稀釋到合適的濃度后，用realtime qPCR（RT-qPCR）方法進(jìn)行測定。PCR 條件為：總反應(yīng)體系為25 μL，各反應(yīng)物的用量，參照試劑盒（EvaGreen 2X qPCR MasterMix）說明書進(jìn)行操作。目的基因產(chǎn)物的專一性驗證通過PCR 擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。目的基因mRNA 表達(dá)量測定時以18s mRNA 表達(dá)量作為內(nèi)參，并且將對照組設(shè)為100%。

所使用引物序列均經(jīng)過 BLAST 驗證，并由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下表2所示。

表2 RT-qPCR 引物Table 2 Primers sequences used for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次，取平均值，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差示，采用oneway ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05 表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參皂苷HA 與EA 對小鼠生化指標(biāo)的影響

由圖2A 可知，相比對照組小鼠，模型組小鼠表現(xiàn)為血清尿酸含量顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，HA 組和EA 組均可顯著降低（P<0.05）小鼠血清尿酸水平，HA 組降低了12.7%，EA 組降低了18.1%，其中EA 組降低血尿酸水平更為顯著，而受試物組與對照組并無顯著差異（P>0.05）。文獻(xiàn)報道尿酸升高的同時肌酐及尿素氮水平也會升高[19?20]。由圖2B可知，模型組小鼠與對照組小鼠血清肌酐水平并沒有顯著差異（P>0.05）。相比對照組小鼠，模型組小鼠尿素氮水平顯著降低（P<0.05）（圖2C）。模型組血清肌酐及尿素氮的結(jié)果與文獻(xiàn)報道不一致[19?20]，可能是由于小鼠品系來源并非絕對嚴(yán)格對照。db/db 小鼠是由C57/BL KsJ 小鼠近親交配衍化而來，而對照小鼠選用的是C57/BL6小鼠。由圖2C 可知，HA 和EA 可顯著降低模型小鼠尿素氮水平（P<0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致[10?11]。

圖2 海參皂苷HA 和EA 對血清尿酸、肌酐及尿素氮水平的影響（n=8）Fig.2 Effects of HA and EA on serum uric acid, creatinine and blood urea nitrogen in mice（n=8）

2.2 海參皂苷HA 與EA 對肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）和腺苷脫氨酶（ADA）活性的影響

酶活實驗結(jié)果表明（圖3），海參皂苷HA 與EA 干預(yù)2 周對db/db 肥胖小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶和腺苷脫氨酶的活性均無顯著影響(P>0.05)，而眾多研究證明XOD 和ADA 是尿酸合成過程的關(guān)鍵酶，抑制XOD 與ADA 的活性可以有效降低血清尿酸水平[21?22]。前期研究發(fā)現(xiàn)海參中的活性成分如海參多糖、海參皂苷均可以通過抑制XOD 及ADA活性降低高嘌呤飲食誘導(dǎo)的小鼠血尿酸水平[10?11]。

圖3 海參皂苷HA 和EA 對肝臟XOD 和ADA 活性的影響（n=8）Fig.3 Effects of HA and EA on hepatic XOD and ADA activity in mice（n=8）

2.3 海參皂苷HA 與EA 對小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

2.3.1 小鼠腎臟組織光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 腎臟是尿酸排泄的重要場所之一，人體的2/3 尿酸經(jīng)腎臟排出[23]。由圖4 可知，在400 倍的光鏡下，對照組正常小鼠腎小球邊界清晰、腎小囊體積均勻（圖4-A）；模型組小鼠腎小球整體體積脹大，膜擴(kuò)張，邊界模糊，腎小囊體積明顯變小，腎小球內(nèi)的毛細(xì)血管膨脹，并與腎小囊粘連（圖4-B），這與Kosugi 等[24]的研究結(jié)果相似；HA 組與EA 組的小鼠，腎小球體積均一、邊界清晰，HA 組與EA 組腎小囊均一且毛細(xì)血管有所恢復(fù)（圖4-C、4-D），相較模型組病理變化得到改善，與Strippoli 等[25]的研究中腎臟病理改善情況一致。

圖4 HE 染色下小鼠腎臟切片光學(xué)顯微鏡觀察（400×）Fig.4 Optical microscope of HE staining renal cortex（400×）

2.3.2 小鼠腎臟組織電鏡觀察結(jié)果 在10000 倍電鏡下，觀察小鼠腎小球結(jié)構(gòu)，正常小鼠的腎小球基底膜厚度均勻，足突分布均勻（圖5-A）；模型組小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞三層細(xì)微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)部分消失，足突出現(xiàn)了融合現(xiàn)象，孔窗結(jié)構(gòu)模糊（圖5-B）。海參皂苷HA 和EA 組對足突融合均有所改善，其中HA 組足突均勻分布，孔窗結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，但足突融合情況仍存在（圖5-C）；EA 組孔窗結(jié)構(gòu)恢復(fù)清晰，足突融合情況得到很大程度地改善（圖5-D）。電鏡觀察結(jié)果表明肥胖小鼠的腎小球結(jié)構(gòu)，在喂食海參皂苷HA 和EA 后，針對足突融合現(xiàn)象均有不同程度的改善，且EA 效果優(yōu)于HA。

圖5 小鼠腎小球電鏡觀察（10000×）Fig.5 Electron microscopic of glomerular in mice（10000×）

2.4 海參皂苷HA 和EA 對腎臟尿酸代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA 表達(dá)的影響

2.4.1 海參皂苷HA 和EA 對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT9 mRNA 表達(dá)的影響 由圖6 可知，與對照組比較，模型組小鼠腎臟GLUT9 mRNA 表達(dá)略有下降，但無顯著性變化(P>0.05)；與模型組比較，HA 與EA 均可顯著上調(diào)小鼠腎臟GLUT9 mRNA 表達(dá)，且EA 組與HA組相比更為顯著（P<0.05）。目前許多研究發(fā)現(xiàn)尿酸代謝與尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)，尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白包括尿酸重吸收相關(guān)蛋白與尿酸分泌相關(guān)蛋白[26]。其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT9）是主要的尿酸鹽重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[27?28]，分布在近端腎小管，對尿酸穩(wěn)態(tài)有重要作用[29]。研究發(fā)現(xiàn)敲除GLUT9 基因的小鼠，體內(nèi)尿酸水平明顯升高[30]。此結(jié)果表明海參皂苷HA 和EA 在促進(jìn)腎臟對尿酸的重吸收方面有顯著作用，且EA 顯著優(yōu)于HA。

圖6 海參皂苷HA 和EA 對腎臟GLUT9 mRNA 表達(dá)的影響（n=8）Fig.6 Effects of HA and EA on kidney GLUT9 mRNA level in mice（n=8）

2.4.2 海參皂苷HA 和EA 對有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（OAT1）mRNA 表達(dá)的影響 由圖7 可知，模型組小鼠腎臟OAT1 mRNA 表達(dá)較對照組顯著降低47.4%（P<0.05）；干預(yù)海參皂苷HA 和EA 后，均可顯著（P<0.05）上調(diào)模型小鼠腎臟OAT1 mRNA 表達(dá)，與模型組相比分別上調(diào)了20.1%和127.6%，表明EA 組在調(diào)節(jié)OAT1 mRNA 表達(dá)方面優(yōu)于HA 組。OAT1 屬于尿酸鹽有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OAT）家族，是與尿酸分泌和排泄密切相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陰離子[12,31]。有研究表明，高尿酸血癥大鼠模型OAT1蛋白表達(dá)顯著下降[32]，與本文模型組小鼠結(jié)果一致。該結(jié)果表明HA 與EA 可以促進(jìn)腎臟對尿酸的排泄，且EA 效果顯著優(yōu)于HA。

圖7 海參皂苷HA 和EA 對腎臟OAT1 mRNA 表達(dá)的影響（n=8）Fig.7 Effects of HA and EA on kidney OAT1 mRNA level in mice（n=8）

2.4.3 海參皂苷HA 和EA 對有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCTs）和肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCTNs）mRNA 表達(dá)的影響 由圖8A、8B 可知，模型組小鼠相較對照組OCT1、OCT2 mRNA 表達(dá)均顯著性下降（P<0.05），HA 和EA 均可顯著上調(diào)模型小鼠腎臟OCT1、OCT2 mRNA 表達(dá)（P<0.05），其中HA 組與EA 組無顯著性差異(P>0.05)。由圖8C、8D 可知，與對照組相比，模型組小鼠OCTN1 與OCTN2 mRNA 并無顯著差異(P>0.05)，EA組可顯著上調(diào)模型小鼠腎臟OCTN1與OCTN2 mRNA 表達(dá)量(P<0.05)，而HA 對模型小鼠并無顯著上調(diào)作用(P>0.05)。有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCT）家族與肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCTN）家族也是影響尿酸代謝的一個重要因素。研究表明，慢性腎功能衰竭的大鼠體內(nèi)OCT2 及OCTN2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量下降，從而引起腎臟有機(jī)陽離子重吸收和分泌受損[33?34]。EA 可同時上調(diào)OCTs 及OCTNs mRNA的表達(dá)，而HA 僅顯著上調(diào)OCTs 的mRNA 表達(dá)，表明EA 可以通過調(diào)控OCT 尿酸鹽有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體及OCTN 肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)尿酸代謝。

圖8 海參皂苷HA 和EA 對腎臟OCTs 和OCTNs mRNA 表達(dá)的影響（n=8）Fig.8 Effects of HA and EA on kidney OCTs and OCTNs mRNA levels in mice（n=8）

3 結(jié)論

本研究對海參皂苷單體HA 與EA 在體內(nèi)調(diào)節(jié)尿酸代謝的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了較為系統(tǒng)的評價。補(bǔ)充海參皂苷HA 與EA 后，db/db 肥胖小鼠血尿酸水平分別降低12.7%和18.1%；腎臟腎小球組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化有了明顯改善；海參皂苷對肥胖小鼠肝臟中XOD 及ADA 酶活無顯著影響(P>0.05)，但顯著上調(diào)腎臟尿酸代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的mRNA 表達(dá)水平(P<0.05)。海參皂苷單體HA 與EA 可能通過同時調(diào)控尿酸代謝重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9 與分泌相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1、OCTs、OCTNs 等改善肥胖小鼠尿酸代謝異常，并顯著改善腎臟組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化，其中EA 改善效果優(yōu)于HA。由于本研究選用db/db 肥胖小鼠，其具有嚴(yán)重的糖尿病癥狀，高血糖可以通過影響腎臟的微循環(huán)來間接影響腎功能。因此，海參皂苷直接影響尿酸代謝，還是通過影響糖代謝進(jìn)而改善尿酸代謝，需進(jìn)一步開展實驗加以驗證。本研究成果將為膳食海參皂苷預(yù)防尿酸代謝異常提供理論依據(jù)。