“落別”櫻桃果實不同發(fā)育期糖酸組分積累及軟化相關成分研究

齊 勇，韓秀梅，宋 莎，馮建文，張 敏，吳亞維

（貴州省果樹科學研究所，貴州貴陽 550006）

“落別”櫻桃是貴州省六盤水市六枝特區(qū)地方中國櫻桃（Cerasus pseudocerasusLindl.）品種。中國櫻桃屬于薔薇科李亞科櫻屬，因表皮鮮紅、汁多味甜、粒大、肉厚核小，一直深受消費者的喜愛[1?2]。櫻桃果實發(fā)育過程中會積累大量的可溶性糖、有機酸及揮發(fā)性物質，三者的組分及含量決定果實的品質和風味[3]。果實中的糖和有機酸是合成維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分的基礎物質，在果實的呼吸、光合作用以及酯類、酚類和氨基酸的合成中發(fā)揮重要作用[4]，能夠為果樹的生長發(fā)育提供能量和代謝中間產(chǎn)物，也是果樹基因表達過程中的重要調節(jié)因子[5]。

果實中有機酸組分很多，但大多數(shù)果實通常以1 種或2 種有機酸為主，其它僅以少量或微量存在。目前，已有研究表明中國櫻桃果實中有機酸以蘋果酸為主，甜櫻桃果實糖組分主要為葡萄糖和果糖，蔗糖含量較低，不積累淀粉和山梨醇[6]。糖類是果實的重要構成物質，并且糖酸代謝與果實的后熟軟化存在明顯的相關性[7?8]。在果實后熟軟化過程中，淀粉水解酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶能夠隨機催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖[9]。果實質地是影響果實品質的重要指標，質地變軟是大多數(shù)果實從成熟到衰老的必然生理過程，也是采后生理研究的重要領域，中國櫻桃采后迅速軟化是導致其不耐貯藏的主要原因之一[10?12]。中國櫻桃屬于非呼吸躍變型（non-climacteric fruits），該類果實的呼吸特征是呼吸強度低，無明顯后熟現(xiàn)象和呼吸上升現(xiàn)象[13]。相關研究發(fā)現(xiàn)核果類果實軟化主要是由中果皮薄壁細胞結構發(fā)生變化所引起[14]。果實軟化與細胞結構變化密切相關，細胞結構主要依靠細胞壁的支持，細胞壁物質發(fā)生降解，導致細胞胞間層結構改變，從而導致果實軟化[15?16]。胞間層由果膠多聚物構成，果膠由原果膠、果膠酸甲酯和果膠酸組成。伴隨著成熟軟化，原果膠降解為水溶性果膠，細胞結構隨之受損，水溶性果膠含量大幅上升，這在桃、草莓、甜櫻桃等果實軟化中均有所發(fā)現(xiàn)[17?19]。果膠物質發(fā)生降解，導致細胞間粘合力的下降主要是由果膠酶所引起的[20]。多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠裂解酶（PL）是研究最為廣泛的兩種細胞壁降解酶。多聚半乳糖醛酸酶能催化果膠分子中α-1,4-聚半乳糖醛酸的裂解，將多聚半乳糖醛酸降解為寡聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸[21]，導致果膠發(fā)生降解。果膠裂解酶能夠催化裂解去醋化的多聚半乳糖醛酸上第5 位的β-碳原子，導致α-1,4-糖苷鍵斷裂，造成細胞結構的破壞，進而導致果膠的降解[22]。

近年來，核果類果實的軟化機理研究大多側重于采后生理及貯藏方面，而本實驗更加注重果實品質形成，尤其是果實發(fā)育過程中糖酸積累及氨基酸變化，同時對果實發(fā)育過程中細胞壁物質降解有關的多種酶的變化進行研究，以期系統(tǒng)、深入地研究“落別”櫻桃果實發(fā)育過程中糖酸積累特點和果實軟化因素，為“落別”櫻桃品種選育、提高果實品質和采后貯藏品質等方面提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料 為貴州省六盤水市六枝特區(qū)地方品種“落別”櫻桃，采樣植株9 年生，位于六枝特區(qū)落別鄉(xiāng)抵耳村，選擇15 株生長勢比較一致的植株作為試驗株；壬酸甲酯、核糖醇 均為分析純，購自貴州省格瑞恩科技有限公司；直鏈淀粉、支鏈淀粉、原果膠、可溶性果膠、α-淀粉酶、β-淀粉酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶等試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司；甲醇、甲基叔丁基醚 均為色譜純，蘇州科銘生物技術有限公司。

DW-HL678 型超低溫冰箱 成都川弘科生物技術有限公司；Lyolab3000 冷凍干燥儀 深圳市鴻銘生物科技有限公司；YG16W 型臺式高速冷凍離心機四川蜀科儀器有限公司；移液槍 德國艾本德公司；DK-98-II 型雙列八孔電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；BSA224S 萬分之一天平 上海菲恰爾分析儀器有限公司；Multiskan FC 全自動酶標儀、QP 2010Plus 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）美國賽默飛世爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法 分別在果實坐穩(wěn)膨大前（盛花后32 d）、膨大期（盛花后40 d）、轉色期（盛花后45 d）、成熟期（盛花后50 d）取樣，在實驗植株樹冠中部外圍結果枝上取樣，每5 株作為一個重復，三個重復共計15 株，每株隨機采摘成熟度一致的果實30 顆，去掉種子后液氮速凍，然后于?80 ℃保存待檢測，樣品檢測前冷凍干燥。

1.2.2 可溶性糖、有機酸和氨基酸含量的測定 參照Sheng 等[23]的方法，將?80 ℃保存樣品通過冷凍干燥機進行冷凍干燥，準確稱取果肉干樣0.1 g，液氮中充分研磨成粉，用2.7 mL 甲醇萃取，再加入 300 μL 0.2 mg/mL 核糖醇（內標），劇烈振搖超聲處理 30 min后，將混合物放入恒溫水浴鍋中。70 ℃水浴15 min，5000 g 離心15 min，取100 μL 上清液進行真空濃縮。參考Zhao 等[24]的方法進行衍生代謝物分析，通過 GC-MS 分析樣品，得到總離子流譜圖，應用色譜峰面積歸一法測定各組分的相對含量。

1.2.3 淀粉和果膠含量及相關酶活性測定

1.2.3.1 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量測定 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測定按照直鏈淀粉試劑盒和支鏈淀粉試劑盒操作步驟進行。準確稱取果肉干樣0.1 g，液氮中充分研磨成粉，加入 1 mL 試劑一，充分勻漿后轉移到 EP 管中，80 ℃水浴提取30 min，25 ℃離心5 min，棄上清，留沉淀，加入 1 mL 試劑二（乙醚）振蕩5 min，25 ℃離心 5min，棄上清，留沉淀，加入 1 mL試劑三充分溶解，90 ℃水浴 10 min，冷卻后利用酶標儀進行測定。

1.2.3.2 原果膠、可溶性果膠含量測定 原果膠含量通過微量法100T/48S 測定。準確稱取果肉干樣0.1 g，按照樣品質量（g）和提取液一體積（mL）為 1:20 的比例，置于 90 ℃恒溫水浴鍋中浸提 30 min，取出冷卻后于 5000 g、25 ℃離心10 min，去掉上清，沉淀中再加入1 mL 提取液一重復操作一次，離心后去上清，沉淀中加入 1 mL 提取液二，置于 90 ℃恒溫水浴鍋中水解 1 h，取出冷卻后于 8000 g 25 ℃離心15 min，取上清液待測，按照原果膠試劑盒操作步驟進行。

可溶性果膠含量通過酶標法測定，取約 0.3 g 樣本，加入 1 mL 80%乙醇，室溫快速勻漿，95 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，4000 g 25 ℃離心 10 min，棄上清。沉淀加入 1.5 mL 80%乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩 2 min 左右，4000 g 25 ℃離心 10 min，棄上清即可），沉淀即為粗細胞壁，加入 1mL 試劑一（去除淀粉）浸泡 15 h，4000 g 25 ℃離心 10 min，棄上清，將沉淀干燥，稱重得細胞壁物質（CWM）。稱取烘干的 CWM 3 mg，加入 1 mL 試劑二，充分勻漿。8000 g 4 ℃離心10 min，取上清液待測，按照可溶性果膠試劑盒操作步驟進行。

1.2.3.3α-淀粉酶、β-淀粉酶含量測定 稱取 0.1 g樣本，加 1 mL 蒸餾水勻漿；將勻漿倒入離心管中，在室溫下放置提取 15 min，每隔 5 min 振蕩 1 次，使其充分提取；3000 g，25 ℃離心 10 min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至 10 mL，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 1 mL，加入 4 mL 蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測定。α-淀粉酶（α-amylase，α-AL）和β-淀粉酶（βamylase，β-AL）通過酶標法測定，按照α-淀粉酶試劑盒和β-淀粉酶試劑盒操作步驟進行。

1.2.3.4 多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶含量測定準確稱取果肉干樣0.1 g，液氮中充分研磨成粉，按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為 1:10 的比例，進行冰浴勻漿。16000 g 4 ℃離心 10 min，取上清，置冰上待測。多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase, PG）活性測定按照多聚半乳糖醛酸酶試劑盒進行。

準確稱取果肉干樣0.1 g，液氮中充分研磨成粉，按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為 1:10 的比例，進行冰浴勻漿。10000 g，4 ℃離心 10 min，取上清，置冰上待測。果膠裂解酶（pectinatelyases，PL）活性測定按照多聚半乳糖醛酸酶試劑盒和果膠裂解酶試劑盒說明書操作測定。

1.3 揮發(fā)性物質成分測定

參考Zhang 等[25]的方法檢測櫻桃果樹揮發(fā)性物質，稱取0.2 g 樣品置于2 mL 離心管中，加入500 μL超純水后渦旋混勻，再添加500 μL 壬酸甲酯的MTBE 后渦旋混勻，混合液置于超聲中40 ℃條件下超聲萃取1 h，然后在4 ℃ 12000 g 離心l0 min，用1 mL 注射器吸取上清液用0.22 μm 濾膜過濾進2 mL進樣瓶中，待測。利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GCMS）QP 2010Plus 分析檢測到的揮發(fā)性化合物質譜圖經(jīng)計算機檢索并與 NIST14 質譜庫進行匹配檢索分析，結合保留時間和匹配度以及相關文獻進行譜圖解析，對檢出物質各組分進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用 SPSS 16.0 軟件處理，應用最小顯著性差異法（LSD） 進行單因素方差分析，Duncan 多重對比分析，顯著性水平為P<0.05，使用Excel 2007 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 櫻桃果實不同發(fā)育時期可溶性糖組分及含量變化

由圖1 可知，“落別”櫻桃果實發(fā)育不同時期可溶性糖主要包含果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、β-D-別吡喃糖、山梨糖醇以及肌醇。果糖和葡萄糖是2 種主要糖組分，占總糖含量的79.17%～88.23%（圖1A、B、H），其次是山梨糖醇和蔗糖，分別占總糖含量的9.52%和4.68%（圖1E、G、H）。果糖、葡萄糖和山梨糖醇在“落別”櫻桃四個發(fā)育時期含量呈S 型曲線升高，尤其是在果實膨大期到轉色期含量顯著增加（P<0.05）。其中，果糖在穩(wěn)果期、膨大期、轉色期和成熟期含量分別為85.80、107.30、355.33 mg/g 和433.83 mg/g，占可溶性糖總量的38.97%、38.14%、51.21%和52.41%；葡萄糖在穩(wěn)果期、膨大期、轉色期和成熟期含量達到87.76、119.77、256.91 mg/g和295.20 mg/g，分別占可溶性糖總量的40.20%、42.58%、37.02%和35.66%。蔗糖含量在穩(wěn)果期和膨大期含量變化不顯著（P>0.05），分別為20.79、20.68 mg/g，到轉色期含量顯著下降（P<0.05），相比穩(wěn)果期降低了57.77%（圖1G）。β-D-別吡喃糖在果實成熟期含量最高，為14.81 mg/g（圖1D）。木糖和肌醇含量較低，在果實膨大期含量達到最高，分別為2.86 mg/g 和2.48 mg/g，顯著高于其他三個發(fā)育時期（圖1C、F）（P<0.05）。

圖1 櫻桃果實不同發(fā)育時期可溶性糖含量變化Fig.1 Changes in the soluble sugar content of cherry fruits at different developmental stages

2.2 櫻桃果實不同發(fā)育時期有機酸組分及含量變化

圖2 可知，“落別”櫻桃果實有機酸的種類很多，隨著果實發(fā)育時期的進行，總體呈降低的趨勢。其中，蘋果酸含量最高，在穩(wěn)果期、膨大期、轉色期和成熟期含量逐漸降低，分別為201.87、160.14、177.43 mg/g 和109.53 mg/g，占總酸含量的98%以上，為典型的蘋果酸型水果?？鼘幩岷筒菟岬淖兓厔菀恢拢壬吆蠼档?，在膨大期達到最高值，分別為0.49 mg/g 和0.19 mg/g。琥珀酸、氨基丁酸和草酸含量最低，四個發(fā)育時期無顯著性變化（P>0.05）。檸檬酸和延胡索酸在穩(wěn)果期含量最高，為0.71 mg/g和0.18 mg/g，隨著果實的發(fā)育顯著降低（P<0.05），在成熟期完全降解。

圖2 櫻桃果實不同發(fā)育時期有機酸含量變化Fig.2 Changes in the content of organic acids in cherry fruits at different developmental stages

2.3 櫻桃果實不同發(fā)育時期氨基酸組成及含量

由表1 可知，“落別”櫻桃果實中共鑒定出7 種氨基酸，其中人體必需氨基酸2 種，非必需氨基酸5 種；藥用氨基酸、鮮味氨基酸和甜味氨基酸各2 種。氨基酸組分中含量最高的是谷氨酸，在穩(wěn)果期和膨大期分別達到0.533 mg/g 和0.459 mg/g，占氨基酸的37.64%和40.19%。其次是天門冬氨酸，在穩(wěn)果期和膨大期分別達到0.444 mg/g 和0.173 mg/g，占氨基酸的31.36%和15.15%。丙氨酸在果實膨大期含量最高，達到0.204 mg/g，顯著高于其他三個發(fā)育時期（P<0.05）。在果實四個發(fā)育時期中，氨基酸種類和含量隨著果實發(fā)育不斷減少，在轉色期和成熟期僅存在蘇氨酸和丙氨酸2 種氨基酸?？偘被岷匡@著性降低（P<0.05），成熟期總氨基酸含量相比穩(wěn)果期降低了91.67%。

表1 櫻桃果實不同發(fā)育時期氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition and content of cherry fruits at different developmental stages

2.4 櫻桃果實發(fā)育過程中淀粉和果膠組分及相關酶活性分析

由圖3A、B 可知，在“落別”櫻桃果實發(fā)育過程中原果膠含量和可溶性果膠含量呈負相關。隨著果實的發(fā)育原果膠含量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，分別為17.35、13.84、11.79、8.99 mg/g FW。與此相反，可溶性果膠含量在果實的穩(wěn)果期、膨大期和轉色期則顯著升高(P<0.05)，在果實轉色期含量達到35.18 mg/g DW，相比膨大期，轉色期含量升高了88.48%。果膠裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶活性變化一致，在果實發(fā)育過程中都先升高后逐漸降低。果膠裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶活性在果實膨大期達到最高值，分別為66.96、60.90 U/mg，而后在轉色期活性發(fā)生顯著降低(P<0.05)，相比膨大期降低了77.81%、57.78%。在果實發(fā)育的4 個時期，直鏈淀粉和支鏈淀粉含量總體呈下降趨勢，其中，支鏈淀粉含量顯著高于直鏈淀粉（P<0.05）。支鏈淀粉含量由穩(wěn)果期的80.76 mg/g DW 下降到成熟期的40.57 mg/g DW，直鏈淀粉含量由19.12 mg/g DW 下降到11.67 mg/g DW。α淀粉酶和β淀粉酶活性呈先升高再降低的趨勢，在果實膨大期達到最高，分別為0.13 U/mg 和0.83 U/mg，在果實成熟期含量降到最低，為0.02 U/mg 和0.12 U/mg。α淀粉酶和β淀粉酶在果實膨大期的快速升高，使得淀粉含量逐漸降低，說明α淀粉酶和β淀粉酶對淀粉的分解有一定促進作用。

圖3 櫻桃果實不同發(fā)育時期果膠和淀粉組分含量及相關酶活性變化Fig.3 Changes of pectin and starch components and related enzyme activities in different developmental stages of cherry fruit

2.5 櫻桃果實發(fā)育過程中香氣成分的分析

由圖4 可知，從“落別”櫻桃果實發(fā)育各時期共檢測到6 種芳香物質分別為3-己醛、（E）-2-己醛、3-己烯-1-醇、（E）-2-己烯-1-醇、2-己醛和苯甲醛。其中，醛類化合物是櫻桃果實香氣成分中是最主要的一類物質，主要包括 C6醛類和芳香醛類。C6醛類化合物包括3-己醛、（E）-2-己醛和2-己醛。在果實的不同發(fā)育階段，香味含量存在差異，其中含量較豐富的為3-己醛。在穩(wěn)果期，櫻桃果實3-己醛豐富度最高，隨著果實發(fā)育時期的進行豐富度不斷降低。壬酸甲酯在果實膨大期豐富度達到最高。芳香醛類化合物苯甲醛在果實轉色期豐富度達到最高，在穩(wěn)果期最低。

圖4 櫻桃果實不同發(fā)育時期香氣成分熱圖Fig.4 Heat map of aroma components of cherry fruits at different developmental stages

3 討論

櫻桃果實中可溶性糖、有機酸、氨基酸及揮發(fā)性香氣組分及含量是決定果實風味和品質的重要因子，作為一種非呼吸躍變型水果，櫻桃果實在其發(fā)育過程中會發(fā)生一系列的變化，而這種動態(tài)變化是果實品質形成的重要基礎[26?28]。本文對供試品種“落別”櫻桃可溶性糖、有機酸、氨基酸和香氣物質成分進行分析，從生理水平揭示“落別”櫻桃果實風味的形成，發(fā)現(xiàn)“落別”櫻桃果實發(fā)育不同時期糖分積累以葡萄糖和果糖兩種還原糖為主，占總糖含量的80%以上，屬于典型的己糖積累型，與李航[29]在中國櫻桃上的研究結果一致。

在“落別”櫻桃果實4 個發(fā)育期，葡萄糖和果糖含量最高，且隨著發(fā)育時期的進行含量顯著升高。果實風味取決于糖酸組分、含量和比例[30]。按照成熟果實中所積累的主要有機酸種類，大體可將果實分為蘋果酸型、檸檬酸型和酒石酸型三種類型。果實中的有機酸有許多種，但大多以1 種或2 種為主，其它以少量或微量存在。杏[31]和桃[32]果實中的有機酸主要為檸檬酸和蘋果酸，葡萄[33]和荔枝[34]果實中的有機酸主要為蘋果酸和酒石酸?！奥鋭e”櫻桃果實中蘋果酸占總酸含量的98%以上，為典型的蘋果酸型水果。

對“落別”櫻桃果實不同發(fā)育時期淀粉含量變化分析發(fā)現(xiàn)，果實發(fā)育過程中淀粉含量發(fā)生顯著降低（P<0.05），淀粉酶活性先升高后隨著淀粉含量的降低也逐漸下降，這與王婷等[35]在甜櫻桃上的研究結果一致?！奥鋭e”櫻桃成熟快，果實硬度下降迅速，果膠含量的變化與果肉硬度下降密切相關，原果膠和水溶性果膠分別與果肉硬度呈顯著正相關和負相關[36]。在本實驗中，“落別”櫻桃果實中原果膠含量呈顯著下降趨勢，而可溶性果膠含量在果實的穩(wěn)果期、膨大期和轉色期發(fā)生顯著升高,與薛炳燁等[37]在桃上的研究結果相似。多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠裂解酶（PL）是參與果膠降解的關鍵酶活，能夠將原果膠分解為可溶性果膠，從而使得果實硬度下降[20]?！奥鋭e”櫻桃發(fā)育過程中，PG 和PL 在穩(wěn)果期含量低，而在果實膨大期快速升高，從而促進了原果膠分解以及可溶性果膠含量的顯著增加。

此外，果實中氨基酸和揮發(fā)性物質組分含量也同樣影響果實風味和品質。Mattheis 與Girard[10,38]研究認為己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、苯甲醛是甜櫻桃果實最重要的香氣成分。本實驗通過GC-MS 共檢測出6 種主要揮發(fā)性物質，包括 C6醛類和芳香醛類?！奥鋭e”櫻桃果實中C6醛類化合物包括3-己醛、（E）-2-己醛和2-己醛，在不同發(fā)育階段，香味含量存在差異，其中含量較豐富的為3-己醛，隨著果實發(fā)育時期的進行豐富度不斷降低，芳香醛類化合物苯甲醛在果實轉色期豐富度達到最高。本文的研究結果也發(fā)現(xiàn)己醛是“落別”櫻桃主要的揮發(fā)性物質，與前人在甜櫻桃上的研究結果一致，但具體的己醛類別存在差異，而且檢測的揮發(fā)性物質比較少，可能是樣品差異和檢測方法不同所致。氨基酸不僅是果實主要的營養(yǎng)物質，也在果實風味構成中發(fā)揮重要作用。天門冬氨酸和谷氨酸是“落別”櫻桃果實發(fā)育前期主要的氨基酸組分，而這兩種氨基酸均屬于鮮味類氨基酸，可能在櫻桃果實的風味形成中發(fā)揮了重要作用。

4 結論

“落別”櫻桃果實可溶性糖積累分別以葡萄糖和果糖為主，是典型的己糖積累型果實。果實有機酸以蘋果酸為主，檸檬酸和戊二酸含量次之，其中蘋果酸質量分數(shù)遠高于其他有機酸，且發(fā)育期內呈逐漸降低的變化趨勢。原果膠的分解，使得可溶性果膠含量快速增加，從而導致果實軟化。PG、PL 和淀粉水解酶在果實成熟和品質形成中發(fā)揮了重要作用。以上研究結果可為“落別”櫻桃的品種改良、果實貯藏保鮮和提高果實品質等方面提供一定理論依據(jù)。