響應(yīng)面法優(yōu)化金槍魚(yú)蒸煮液發(fā)酵制備海鮮調(diào)味基料工藝

王新宇，谷 秀，位正鵬，王 鵬，李銀平，閆鳴艷，劉瑞志,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；3.海洋功能食品國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東榮成 264309；4.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042）

我國(guó)是水產(chǎn)品捕撈和加工大國(guó)，每年都有數(shù)以萬(wàn)噸的水產(chǎn)品出口海外，2019 年我國(guó)水產(chǎn)品出口額占農(nóng)產(chǎn)品出口總額比重達(dá)30%，其中金槍魚(yú)出口又占據(jù)了重要的地位，因?yàn)轸~(yú)肉罐頭受到各國(guó)人民的喜愛(ài)，在國(guó)外十分暢銷。蒸煮液是金槍魚(yú)罐頭加工過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物，富含大量蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)[1]。由于加工技術(shù)的限制導(dǎo)致蒸煮液大量流失，不僅造成了極大的資源浪費(fèi)，而且給企業(yè)污水處理增加了成本[2]。因此，對(duì)金槍魚(yú)蒸煮液的高值化利用是金槍魚(yú)加工企業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)金槍魚(yú)蒸煮液在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究不多。楊小克等[3]、何鍵東等[4]采用酶解法從金槍魚(yú)蒸煮液中提取魚(yú)油；陳啟航等[5]采用酶解蒸煮液法制備風(fēng)味海鮮調(diào)味汁；李可欣等[6]以金槍魚(yú)蒸煮汁為原料研制金槍魚(yú)風(fēng)味沙拉醬。然而研究發(fā)現(xiàn)酶解法不易消除其固有的腥味[7?8]，酵母是一種天然發(fā)酵劑[9]，具有較好的脫腥效果[10?11]和重金屬離子吸附作用[12]，目前已有一些研究將活性干酵母應(yīng)用到海鱸魚(yú)片、草魚(yú)、牡蠣酶解液、鱘魚(yú)肉等脫腥工藝上[13?16]。本文以金槍魚(yú)蒸煮液為原料，加入酵母進(jìn)行發(fā)酵制備海鮮調(diào)味品基料，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定最佳發(fā)酵工藝，對(duì)最優(yōu)條件下的發(fā)酵液進(jìn)行氨基酸組成分析，以期為金槍魚(yú)蒸煮液的深度加工利用以及調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚(yú)蒸煮液 浙江省舟山市某金槍魚(yú)罐頭加工企業(yè)；無(wú)水乙醇、乙酸、無(wú)水乙酸鈉、甲醇、乙酰丙酮等 均為分析純；活性干酵母：黃酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、復(fù)合功能菌酵母 安琪酵母股份有限公司；面包酵母 樂(lè)斯福有限公司；71B 酵母 曼森商貿(mào)有限公司。

AR224CN 電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；CT14RDⅡ高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；智能恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津歐諾儀器股份有限公司；PEN 3 型電子鼻 德國(guó)Airsense公司；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)選用感官評(píng)定、電子鼻分析、氨基酸態(tài)氮含量三項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)估酵母種類、酵母添加量、時(shí)間、鹽度對(duì)發(fā)酵的影響。感官評(píng)定可以較為直觀地反映人對(duì)不同條件發(fā)酵液的接受程度[17]，電子鼻主要通過(guò)氣味指紋信息對(duì)氣體或揮發(fā)性成分做定性或定量的檢測(cè)[18?19]，可對(duì)感官評(píng)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，氨基酸態(tài)氮含量的高低表示游離氨基酸的豐富程度，也可在一定程度上反應(yīng)物質(zhì)風(fēng)味特點(diǎn)[20?21]。

1.2.1.1 酵母種類 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發(fā)酵液，按2‰的添加量加入黃酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、71B 酵母、面包酵母、復(fù)合功能菌酵母，置于35 ℃條件下反應(yīng)12 h，隨后進(jìn)行感官評(píng)定、氨基酸態(tài)氮測(cè)定、電子鼻分析。

1.2.1.2 酵母添加量 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發(fā)酵液，按不同的添加量（w/v，2‰、4‰、6‰、8‰）加入71B 酵母，置于35 ℃條件下反應(yīng)12 h，隨后進(jìn)行感官評(píng)定、氨基酸態(tài)氮測(cè)定、電子鼻分析。

1.2.1.3 發(fā)酵時(shí)間 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發(fā)酵液，按4‰的添加量加入71B 酵母，置于35 ℃條件下分別發(fā)酵6、12、18 h（預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵24 h 和36 h 后，發(fā)酵液呈現(xiàn)明顯的硫化氫臭味，故未對(duì)該時(shí)間發(fā)酵液進(jìn)行其他指標(biāo)測(cè)定），隨后進(jìn)行感官評(píng)定、氨基酸態(tài)氮測(cè)定、電子鼻分析。

1.2.1.4 鹽度 分別取30 mL 不同鹽度（0.15、0.25、0.35、0.45 mol/L）的待發(fā)酵液，按4‰的添加量加入71B 酵母，置于35 ℃條件下反應(yīng)12 h，隨后進(jìn)行感官評(píng)定、氨基酸態(tài)氮測(cè)定、電子鼻分析。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取酵母添加量、發(fā)酵時(shí)間、鹽度3 個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Response surface design

1.2.3 感官評(píng)定 參考靳艷芬等[22]對(duì)鮑復(fù)合調(diào)味品的感官評(píng)定方法，由10 位評(píng)價(jià)人員組成評(píng)價(jià)小組對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)定采用1～10 分制，取10 名評(píng)價(jià)人員的平均分?jǐn)?shù)為最終結(jié)果。感官評(píng)分參照調(diào)味料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以總體可接受度為最終評(píng)價(jià)結(jié)果，從產(chǎn)品色澤、香氣、滋味（權(quán)重比為3:4:3）進(jìn)行感官評(píng)定，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards

1.2.4 電子鼻分析 參考吳靖娜[23]的方法并做適當(dāng)修改，電子鼻傳感器陣列由10 個(gè)金屬氧化物傳感器組成：1 號(hào)傳感器W1C 對(duì)芳香成分靈敏；2 號(hào)傳感器W5S 對(duì)氮氧化合物很靈敏；3 號(hào)傳感器W3C 對(duì)氨水、芳香成分靈敏；4 號(hào)傳感器W6S 對(duì)氫氣有選擇性；5 號(hào)傳感器W5C 對(duì)烷烴芳香成分靈敏；6 號(hào)傳感器W1S 對(duì)甲烷靈敏；7 號(hào)傳感器W1W 對(duì)硫化物靈敏；8 號(hào)傳感器W2S 對(duì)乙醇靈敏；9 號(hào)傳感器W2W 對(duì)芳香成分、有機(jī)硫化物靈敏；10 號(hào)傳感器W3S 對(duì)烷烴靈敏。

測(cè)定條件為：傳感器清洗時(shí)間100 s，歸零時(shí)間10 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，樣品測(cè)試時(shí)間150 s，內(nèi)部流量300 mL/min。選取測(cè)定過(guò)程中144～146 s 的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.2.5 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定 氨基酸態(tài)氮含量參考GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[24]第二法測(cè)定。

氨基酸態(tài)氮增量采用式（1）計(jì)算：

其中，Y 為氨基酸態(tài)氮增量，A1為發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量，A0為發(fā)酵液初始氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.6 氨基酸組成分析 氨基酸組成參考GB/T 5009.124-2016《食物中氨基酸的測(cè)定》[25]，使用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3 次。采用Excel 和Design Expert 8 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酵母種類對(duì)發(fā)酵的影響 由圖1A 可知，71B 酵母發(fā)酵后體系感官評(píng)分最高，結(jié)合電子鼻分析可知，71B 酵母對(duì)傳感器2、6 的響應(yīng)值較小，說(shuō)明經(jīng)71B 酵母發(fā)酵后，發(fā)酵液中氮氧化合物和甲烷含量較低，從而呈現(xiàn)較好的風(fēng)味。雖然黃酒酵母和啤酒酵母發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量較高，但在發(fā)酵過(guò)程中也產(chǎn)生了乙醇，使得感官評(píng)分較低。因此，選擇71B 酵母用于后續(xù)發(fā)酵，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 酵母種類對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 The effect of yeast type on fermentation

2.1.2 酵母添加量對(duì)發(fā)酵的影響 由圖2A 可知，酵母添加量為4‰時(shí)，感官評(píng)分最高，添加量超過(guò)4‰后，感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能因?yàn)榻湍笣舛鹊脑黾樱鹞⑸锏母?jìng)爭(zhēng)性抑制，減緩了腥味物質(zhì)的分解[11]。結(jié)合圖2B，酵母添加量為4‰的發(fā)酵液對(duì)傳感器2、7、9 的響應(yīng)值均最小，說(shuō)明發(fā)酵液中氮氧化物、硫化物最少。氨基酸態(tài)氮含量的變化與感官評(píng)分一致，在4‰時(shí)最高。

圖2 酵母添加量對(duì)發(fā)酵的影響Fig.2 The effect of added yeast on fermentation

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響 由圖3A 可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，體系感官評(píng)分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，結(jié)合電子鼻分析（圖3B）可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，體系中氮、硫化物含量非常高，呈現(xiàn)不愉悅的氣味。由圖3C 可知，發(fā)酵時(shí)間為12 h 時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高。發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)逐漸被降解成肽、氨基酸和其他小分子，但發(fā)酵后期隨著降解的進(jìn)行，部分小分子肽、氨基酸被繼續(xù)分解成氮氧化物，從而導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮的含量減少，感官評(píng)分降低[26]。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇12 h 作為最優(yōu)條件。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of fermentation time on fermentation

2.1.4 鹽度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響 由于不同批次不同廠家的蒸煮液中含鹽量（以NaCl 計(jì)）存在差異，且鈉鹽的濃度會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的降解[27?28]。因此，研究蒸煮液鹽度對(duì)發(fā)酵脫腥工藝的影響十分重要。由圖4 可知，鹽度為0.25 mol/L時(shí)，樣品的感官評(píng)分和氨基酸態(tài)氮增量最高，發(fā)酵效果最好。且在此條件下，體系對(duì)傳感器2、7、9 的響應(yīng)值較小。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)蒸煮液鹽度為0.3 mol/L 和0.25 mol/L 時(shí)，其發(fā)酵液感官評(píng)分差距較小，而蒸煮液實(shí)際鹽度為0.3 mol/L，因此響應(yīng)面試驗(yàn)的鹽度以0.3 mol/L 為中心點(diǎn)。

圖4 鹽度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.4 The effect of salinity on fermentation products

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)可知，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分結(jié)果具有一定的相關(guān)性，且不同鹽度的初始氨基酸態(tài)氮含量不同，在響應(yīng)面不同設(shè)計(jì)組中不易表征，因此以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇酵母添加量、發(fā)酵時(shí)間、鹽度三因素三水平，進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，以確定海鮮調(diào)味基料的最佳制備工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The test results of response surface

2.2.2 方差分析 由表4 可知，P=0.0014 可知模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)P=0.1256，差異不顯著（P>0.05），決定系數(shù)R2=0.9428。各因素對(duì)感官評(píng)分的影響依次為B（發(fā)酵時(shí)間）>C（鹽度）>A（酵母添加量）。其中，模型的極顯著因子項(xiàng)（P<0.01）有B、AC、B2和C2，顯著的因子項(xiàng)（P<0.05）為C，可知感官評(píng)分受發(fā)酵時(shí)間的影響最大。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The ANOVA results

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖是回歸方程的圖形表述，從響應(yīng)面圖中可快速找到最佳參數(shù)[29]。由圖5可知，各因素對(duì)響應(yīng)面的陡峭程度影響由大到小依次為：發(fā)酵時(shí)間>鹽度>酵母添加量，這與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)酵母添加量固定不變時(shí)（圖5A），隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；當(dāng)鹽度固定不變時(shí)（圖5B），酵母添加量小于4.5‰時(shí)，感官評(píng)分上升，添加量超過(guò)4.5‰時(shí)，感官評(píng)分隨即下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間固定不變時(shí)（圖5C），隨著鹽度的增加，發(fā)酵液感官評(píng)分也是先上升后下降。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of the interaction of various factors

2.2.4 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 由Design-Expert 8.0 軟件預(yù)測(cè)得出發(fā)酵制備海鮮調(diào)味基料最優(yōu)工藝條件為：酵母添加量4.5‰，發(fā)酵時(shí)間6 h，鹽度0.26 mol/L，感官評(píng)分9.45。在修正條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，感官評(píng)分9.31±0.32。與理論預(yù)測(cè)值相符，說(shuō)明該優(yōu)化結(jié)果可靠，可進(jìn)一步利用開(kāi)發(fā)為新型調(diào)味品。

2.3 氨基酸組成分析

蒸煮液經(jīng)酵母發(fā)酵后，其中一部分蛋白質(zhì)可水解為低分子肽類和氨基酸[30]。氨基酸是一種重要的呈味物質(zhì)，氨基酸組成與滋味的形成關(guān)系密切。根據(jù)氨基酸的味覺(jué)強(qiáng)度可大致分為鮮味、甜味、苦味和無(wú)味四大類[31]。同時(shí)氨基酸還可作為美拉德反應(yīng)的前體物質(zhì)，與糖作用生成特殊的香味物質(zhì)[32]。因此，游離氨基酸是衡量發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的一個(gè)重要指標(biāo)。

上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)71B 酵母發(fā)酵后發(fā)酵液的感官評(píng)分最高，這與其呈味氨基酸的變化密切相關(guān)。如表5所示，發(fā)酵后溶液中天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）等幾種呈味氨基酸的含量均有明顯上升，其中Gly 和Glu 的含量相對(duì)較高，使發(fā)酵液呈現(xiàn)柔和的甜味和較強(qiáng)的鮮味。此外，纈氨酸（Val）、組氨酸（His）的含量明顯下降，可能是微生物生長(zhǎng)繁殖利用，或是與發(fā)酵體系中的還原糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致其含量降低。由于Val 和His是苦味氨基酸，所以其含量的降低也有利于發(fā)酵液呈現(xiàn)較好的風(fēng)味。

表5 發(fā)酵液中的氨基酸組成Table 5 The amino acid composition of fermentation products

3 結(jié)論

金槍魚(yú)蒸煮液發(fā)酵制備海鮮調(diào)味品基料的最佳工藝條件為：酵母71B，酵母添加量4.5‰，發(fā)酵時(shí)間6 h，鹽度0.26 mol/L，最優(yōu)條件下，感官評(píng)分9.31±0.32，與理論預(yù)測(cè)值相符。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行氨基酸組成分析，發(fā)現(xiàn)其天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量明顯上升，纈氨酸、組氨酸含量明顯下降。研究結(jié)果表明蒸煮液經(jīng)酵母發(fā)酵后可用于制備海鮮調(diào)味品基料，并且該發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，適合在產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用，從而提升金槍魚(yú)蒸煮液的附加值。