兩種扣囊復膜酵母在清香型麩曲白酒生產中的應用

馬美榮，劉小改，李洪媛，周林艷，單 群，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）屬于復膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae），復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），又名擬內孢霉，是一類能產生子囊孢子的二形態(tài)酵母[1]，其通過多極出芽、菌絲體形成來增殖，子囊為球狀，游離于體細胞或附著于菌絲尾部或壁上。每個子囊可形成兩個到四個帽狀子囊孢子，成熟時釋放[2]。扣囊復膜酵母可在各種淀粉基質中存活，是白酒酒曲[3?5]、黃酒酒藥[6]、甜酒曲[7]、韓國酒曲Nuruk[8?10]、泰國酒曲Loog-pang[11]、食醋大曲[12?13]等酒曲中的重要菌種。

麩曲酒是以麩曲為糖化劑，加酵母（釀酒干酵母）為發(fā)酵劑，或以麩曲為糖化發(fā)酵劑釀制而成的白酒[14]。清香型麩曲白酒是以黑曲霉制備的麩曲為糖化劑，釀酒酵母為發(fā)酵劑釀制而成。由于該麩曲白酒發(fā)酵菌種較為單一，酒體辛辣，欠醇厚綿柔，后味短，限制了一部分消費者對麩曲酒的喜愛?？勰覐湍そ湍改軌虍a生一定的香氣，能產生多種甜味物質，其應用于清香型麩曲白酒發(fā)酵，能夠改善麩曲酒的醇甜感，提升原酒的品質。

本文以優(yōu)選的兩株扣囊復膜酵母制備麩曲，對麩曲進行感官評價、風味成分分析，并對其產酸能力、糖化力、發(fā)酵力進行分析研究?？勰覐湍そ湍耕熐鷳糜谇逑阈望熐拙瓢l(fā)酵，研究其對清香型麩曲白酒出酒率、原酒品質的影響。通過酒樣風味成分的分析，為扣囊復膜酵母提升原酒品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扣囊復膜酵母T（Saccharomycopsis fibuligeraT，簡稱NT）、扣囊復膜酵母L（Saccharomycopsis fibuligeraL，簡稱NL）、釀酒酵母 HX006（Saccharomyces cerevisiaeHX006） 北京紅星股份有限公司分離保存；高粱、稻殼、釀酒麩曲 北京紅星股份有限公司釀造車間生產提供。

HP6890 氣相色譜儀 安捷倫公司；LA230S 電子天平 賽多利斯公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；DMA5000M 全自動密度儀 安東帕公司；ICS-3000 離子色譜儀 美國Dionex公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 扣囊復膜酵母種曲、淺盤麩曲培養(yǎng)基[15]：麩皮與水以1:1 比例拌勻，121 ℃滅菌30 min；扣囊復膜酵母發(fā)酵力培養(yǎng)基[16]：參考釀酒大曲發(fā)酵力分析方法，選用葡萄糖含量128 g/L 的玉米糖化液：1 kg 玉米面加入5 L 水，加入0.02%的液化酶在80 ℃保溫液化1 h，降溫至60 ℃加入0.3%的糖化酶保溫糖化2 h，棄去殘渣，清液121 ℃滅菌20 min；酵母液體種子培養(yǎng)基[17]：按照發(fā)酵力培養(yǎng)基制備方法制備玉米糖化液，根據(jù)原液的糖度降度到10oBrix，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 扣囊復膜酵母三角瓶種曲制備 根據(jù)1.2.1 配制扣囊復膜酵母種曲培養(yǎng)基，250 mL 三角瓶中裝入20 g 麩皮、20 mL 水，拌勻，121 ℃滅菌30 min。降溫至30 ℃左右，從扣囊復膜酵母斜面挑1～2 環(huán)菌接入培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d。

1.2.3 扣囊復膜酵母淺盤麩曲制備 根據(jù)1.2.1 配制扣囊復膜酵母淺盤麩曲培養(yǎng)基，取1 kg 麩皮、1 L水，拌勻，121 ℃滅菌30 min。降溫至35 ℃左右，接入6～10 g 種曲，拌勻后裝入淺盤，在曲室內培養(yǎng)，前期（0～24 h）品溫控制在32 ℃左右，后期（24～40 h）品溫控制在36 ℃左右。

培養(yǎng)好的麩曲置于陰涼、干燥、通風處貯存，貯存時間不超過2 個月。

1.2.4 扣囊復膜酵母在清香型麩曲白酒生產中的應用

按照糖化發(fā)酵劑組成分為三個方案進行發(fā)酵實驗，以不加扣囊復膜酵母麩曲為對照。

對照：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%；方案1：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%、NT 麩曲1%、NL 麩曲1%；方案2：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%、NT 麩曲2%；方案3：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%、NL 麩曲2%。

釀酒酵母斜面接種于裝有酵母液體種子培養(yǎng)基的液體試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好的液體試管種子液轉接于裝有酵母液體種子培養(yǎng)基的液體三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)20～24 h。

操作要點：將高粱粉碎成粉狀，酒糟、高粱粉按照4:1 的配比混合均勻，加入稻殼、水，稻殼添加量為高粱粉質量的25%，適當加水調節(jié)醅料水分至55%左右，拌勻后悶料30 min，然后100 ℃蒸糧40 min，蒸糧完成后物料經攤涼、降溫至30 ℃左右，按高粱粉質量50 kg 加入相應的麩曲、酵母，并再次翻拌均勻后入0.8 m3槽車發(fā)酵。自然發(fā)酵，發(fā)酵7 d。發(fā)酵完成后，將酒醅從槽車中取出，裝入甑鍋中蒸餾取酒，蒸酒后酒糟按20%比例作為丟糟棄用，剩余80%酒糟作為回糟再次配糧后進行后續(xù)發(fā)酵應用。蒸餾后的酒樣進行風味成分分析和感官評價。

1.2.5 扣囊復膜酵母麩曲感官評價 取培養(yǎng)成熟的麩曲，由8 位具有專業(yè)知識的技術人員（年齡20～50歲，5 男3 女，高級釀酒師5 人，釀酒師3 人）觀察成曲顏色、表面及斷面生長情況，并聞其香氣情況[18?19]。

成曲評價標準：顏色發(fā)白，表面及斷面皆有白點，結塊較密，無酸臭味、無雜菌感染現(xiàn)象。

1.2.6 氣相色譜分析風味成分

1.2.6.1 樣品前處理 取10 g 絕干的麩曲樣品置于磨口三角瓶中，加入200 mL 70%voL 的乙醇溶液，室溫浸泡24 h，取清液備用。白酒樣品不需前處理。

1.2.6.2 色譜條件 DB-WAX UI 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），檢測器溫度240 ℃；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min 升至100 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持13 min；載氣為氮氣（N2）；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1:30。載氣流速：氮氣36.5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。根據(jù)保留時間定性，采用內標法定量，內標物為叔戊醇（質量濃度198.27 mg/L）、乙酸正戊酯（質量濃度174.93 mg/L）和2-乙基丁酸（質量濃度198.20 mg/L）。

1.2.7 多元醇分析

1.2.7.1 樣品前處理 取樣品2.00 g 及30 mL 蒸餾水，置于50 mL 離心管中，2000 r/min，15 min，取上清液備用。

1.2.7.2 色譜條件 CarboPac MA1 型分離柱（250 mm×4 mm）；流動相：480 mmol/L NaOH 淋洗液；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：25 μL；電化學檢測器和Chromeleon 6.80 色譜工作站[20]。根據(jù)保留時間定性，外標法定量。

1.2.8 扣囊復膜酵母麩曲酸度測定 稱取試樣10 g（精確至0.01 g），于250 mL 燒杯中，準確加水100 mL，于室溫浸泡30 min（每隔10 min 攪拌1 次），用脫脂棉過濾后的清液進行酸度測定[21]。

酸度定義：每100 g 曲消耗1 mmol 氫氧化鈉為1 度酸度。

1.2.9 扣囊復膜酵母麩曲糖化力測定 稱取5 g 麩曲樣品，加入90 mL 水和10 mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻。35 ℃水浴1 h，用脫脂棉過濾，棄去最初5 mL，接收其余澄清濾液進行淀粉酶解糖測定，測定方法參照斐林定糖法[22]。

式中：V0表示加空白溶液后消耗標準葡萄糖溶液的體積（mL）；V 表示加麩曲糖化液后消耗標準葡萄糖溶液的體積（mL）；C 表示標準葡萄糖溶液濃度（g/mL）；糖化酶活力為U/g。

糖化酶活力單位：1.0 g 干曲在35 ℃、pH4.6 條件下，反應1 h，將可溶性淀粉分解為葡萄糖1 mg 所需的酶量稱為1 個酶活力單位，符號為U。

1.2.10 扣囊復膜酵母麩曲發(fā)酵力測定 以葡萄糖含量128 g/L 的玉米糖化液為發(fā)酵培養(yǎng)基，按照釀酒大曲發(fā)酵力測定方法測定[16]。

發(fā)酵力活力單位：在30 ℃，72 h 內0.5 g 麩曲利用可發(fā)酵糖類所產生的二氧化碳克數(shù)為一個單位，符號為U。

1.2.11 酒樣酒精度測定 樣品使用Anton Paar DMA 5000 M 全自動密度儀進行自動檢測[23]。

1.2.12 原料出酒量、出酒率的測定 蒸餾后的酒樣稱重，測定原酒酒樣的酒精度，計算出酒量、原料出酒率。

出酒量（kg）=原酒酒樣酒精度折算為65%voL原酒的換算系數(shù)×原酒產量

原料出酒率（%）=折算為65%vol 原酒產量/原料用量×100[17]。

1.2.13 酒樣感官評價 根據(jù)GB/T 33404-2016 白酒感官品評導則進行品評描述[24]。由10 位具有專業(yè)知識的技術人員（年齡20～40 歲，5 男5 女，國家品酒評委4 人，一級品酒師2 人，二級品酒師2 人，三級品酒師2 人）從原酒風味方面進行感官評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗結果均以平均數(shù)±標準差（Means 士SD）形式表示，n=5，以方差分析ANOVA 來檢測平均值之間的差異，以P<0.05 為差異顯著。統(tǒng)計分析使用SPSS23. 0 統(tǒng)計分析軟件。

2 結果與分析

2.1 扣囊復膜酵母麩曲品質和性質

2.1.1 扣囊復膜酵母麩曲感官評價 以優(yōu)選的兩株扣囊復膜酵母NL、NT 制備麩曲，從外觀上觀察兩種麩曲，兩者都呈白色，從顏色上無法區(qū)分，但聞香差別較大，NL 麩曲呈奶油香、花香，花香較明顯，NT 麩曲呈奶油香、曲香，曲香較明顯（表1），這應該與兩種麩曲在培養(yǎng)過程中產生的香味物質種類與含量存在差異有關。

表1 扣囊復膜酵母麩曲感官評價Table 1 Sensory evaluation of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.1.2 扣囊復膜酵母麩曲風味物質分析 扣囊復膜酵母麩曲70%vol 乙醇提取液的氣相色譜分析結果見表2，從兩種麩曲中共檢測到21 種物質，其中酯類化合物7 種，醛類化合物2 種，酮類化合物2 種，酸類化合物5 種，醇類化合物5 種，大部分物質呈現(xiàn)特殊的香氣，含量較高的物質有乙縮醛、戊酸乙酯、亞油酸乙酯、乙醛、乙酸等，其中乙縮醛、戊酸乙酯和乙酸是清香型白酒中重要的風味物質。麩曲中還含有可使酒具有甜感的2,3-丁二醇（左旋）、2,3-丁二醇（內消旋）等物質，但含量較低。NL 麩曲的酯類物質、酮類物質、酸類物質的含量比NT 麩曲分別高6.56%、16.59%、32.28%，但其醛類物質、醇類物質的含量比NT 麩曲分別低5.67%、2.67%。

表2 扣囊復膜酵母麩曲提取液氣相色譜分析結果Table 2 GC analysis results of Saccharomycopsis fibuligera fuqu extraction liquid

由表3 可知，兩種麩曲中含有丙三醇和阿拉伯糖醇，丙三醇的含量遠高于阿拉伯糖醇的含量。NT 麩曲多元醇的含量要高于NL 麩曲多元醇的含量，約高31.79%。多元醇是形成白酒中甜味的主要來源，甜度隨羥基數(shù)增多而增強。在酒精度較高的白酒中，微甜味能使酒體顯得綿柔醇厚[20]。

表3 扣囊復膜酵母麩曲多元醇分析結果Table 3 Polyhydric alcohols analysis results of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.1.3 扣囊復膜酵母麩曲理化性能研究 對制備的扣囊復膜酵母麩曲進行酸度、糖化力、發(fā)酵力測定，可見所應用的扣囊復膜酵母具有一定的產酸能力、糖化能力、發(fā)酵能力。NT 的發(fā)酵力要高于NL，約高19.74%，但其酸度、糖化力要低于NL，且其糖化力遠遠低于NL，糖化力約低30.34%，酸度約低8.85%（表4）。

表4 扣囊復膜酵母麩曲理化指標Table 4 Physicochemical indexes of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.2 扣囊復膜酵母麩曲在清香型麩曲白酒中應用

2.2.1 生產數(shù)據(jù)分析 從表5 可以看出，在不同實驗條件下，與對照相比，各方案的平均出酒率都高于對照，其中方案1 的平均出酒率最高，約比對照高2.10%，相對提高了4.62%。應用扣囊復膜酵母后，平均出酒率提高，這可能與菌種具有同化淀粉能力、發(fā)酵產乙醇能力有關。

表5 不同實驗方案的生產數(shù)據(jù)Table 5 The production data of different experimental schemes

2.2.2 實驗酒樣風味物質分析 通過氣相色譜分析，從酒樣中共檢測到41 種物質，其中酯類化合物13 種，醛類化合物5 種，醇類化合物14 種，酮類化合物2 種，酸類化合物7 種，含量較高的物質有乙酸乙酯、異戊醇、異丁醇、乙酸、正丙醇、活性戊醇、乙縮醛、乙醛等。在清香型麩曲白酒的酯類化合物中，乙酸乙酯作為主體香味物質，是產品標準的重要指標，幾個實驗方案的乙酸乙酯含量都高于對照，方案1 最高，比對照相對提高了14.40%。在含量較高的醛類化合物中，幾種實驗方案的乙醛、乙縮醛含量都比對照高，方案3 最高，其乙醛含量比對照提高了51.84%，其乙縮醛含量比對照提高了47.72%。在醇類化合物中，一般關注高級醇（正丙醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇）含量變化情況，幾種實驗方案的高級醇含量都高于對照，方案1 含量最高，約比對照提高了14.73%。幾種實驗方案的酮類化合物含量都比對照高，方案3 含量最高，約比對照提高了70.80%。在酸類化合物中，乙酸含量遠遠高于其他酸類，幾種實驗方案的乙酸含量都比對照高，方案2 含量最高，約比對照提高了20.56%。

從表6 可以看出，酒樣中含有可使酒具有甜感的2,3-丁二醇和1,2-丙二醇，幾種實驗方案的二醇物質含量要高于對照，方案1 最高，比對照提高了51.89%。由表7 可知，對照只檢測到丙三醇一種多元醇，幾個實驗方案均可檢測到丙三醇和赤蘚糖醇兩種多元醇，且方案1 的丙三醇含量高于對照，約提高了11.62%。

表6 實驗酒樣氣相色譜分析結果（mg/L）Table 6 GC analysis results of experimental baijiu samples(mg/L)

表7 實驗酒樣多元醇分析結果Table 7 Polyhydric alcohols analysis results of experimental baijiu samples

從酒樣風味物質分析來看，實驗組與對照組、以及各實驗組內之間風味成分的差異，一是與菌種本身特性有關，二是受發(fā)酵條件及微生物之間的相互作用影響。

2.2.3 實驗酒樣品評 如圖1、表8 所示，從酒樣品嘗結果來看，實驗酒樣均比對照酒樣增加了不同程度的綿甜感，改善了原酒的口感，提升了原酒品質。從香氣、口感、諧調性等多方面評價，方案1 酒樣的感官評價最好。從出酒率、理化指標、感官評價等方面綜合考慮，方案1（使用兩種扣囊復膜酵母麩曲）效果最好，具有推廣應用價值。

圖1 酒樣品評風味輪Fig.1 Baijiu sample tasting wheel

表8 酒樣感官品評結果Table 8 Results of sensory evaluation of baijiu samples

3 結論

扣囊復膜酵母T 和扣囊復膜酵母L 的麩曲都具有一定的產酸能力、糖化能力、發(fā)酵能力，兩種酵母具有產丙三醇和阿拉伯糖醇的能力?？勰覐湍そ湍笐糜谇逑阈望熐瓢l(fā)酵，能夠提高原料淀粉利用率，使麩曲酒的出酒率提高，增加風味物質的種類及含量，使得原酒的綿甜感有不同程度的增強，改善了原酒的口感，提升了原酒品質。

在今后的研究中，應加強對扣囊復膜酵母在白酒釀造生產中作用機理研究，優(yōu)選扣囊復膜酵母應用于釀造生產，為消費者提供飲后更舒適的美酒，滿足消費者對美好生活的向往。