海藻酸鈉裂解酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

王巧貞，潘信利，楊 玲，李 菲，李 喆，黃媛林，李翠梅，黃庶識(shí),*

（1.廣西科學(xué)院，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；2.廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西桂林 541004）

褐藻膠是巨藻、墨角藻、馬尾藻和海帶等褐藻細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中的一類水溶性酸性多糖物質(zhì)，也是褐藻中含量最多的多糖，其在地球上的含量僅次于纖維素，可作為潛在的生物質(zhì)能源原料。然而褐藻膠高粘、高凝膠、不易降解、難以被機(jī)體吸收利用的特點(diǎn)，限制了它的應(yīng)用[1]，褐藻膠的降解產(chǎn)物海藻酸寡糖在抗腫瘤、抗凝血、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)宿主免疫力、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、腸道消化吸收、植物的生長及保鮮等方面有良好的生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[2?5]。傳統(tǒng)制備褐藻膠寡糖的方法主要有物理降解法、化學(xué)降解法和生物酶解法[6]等，其中生物酶解法因其專一性高、反應(yīng)條件溫和、易控制、目標(biāo)產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。

褐藻膠裂解酶通過β-消除反應(yīng)將褐藻膠降解為一系列不飽和的海藻酸寡糖，根據(jù)底物專一性不同將褐藻膠裂解酶分為三類：轉(zhuǎn)移性裂解1,4-α-D-甘露糖醛酸片段的裂解酶（Aly；EC4.2.2.3），專一性裂解1,4-α-L-古羅糖醛酸片段的裂解酶（Aly；EC4.2.2.11）以及兩種片段都可裂解的雙功能裂解酶[7]。褐藻膠裂解酶來源廣泛，主要來源包括藻類、動(dòng)物內(nèi)臟和微生物等，其中海洋微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源之一，目前的研究表明來自于海洋動(dòng)物的微生物產(chǎn)生的裂解海藻酸鈉的酶多數(shù)為復(fù)合酶，很難分離純化，如假交替單胞菌Pseudoalteromonas elyakoviiIAM 14954 至少能產(chǎn)生五種不同的海藻酸鈉裂解酶，其中一個(gè)是胞外酶，四個(gè)是胞內(nèi)酶[8]?，F(xiàn)有大部分微生物來源的褐藻膠裂解酶依然存在著酶活力較低、作用位點(diǎn)單一等缺陷，造成酶解法制備海藻提取物的成本過高，且沒有統(tǒng)一的發(fā)酵工程菌及系統(tǒng)發(fā)酵條件，褐藻膠裂解酶穩(wěn)定性差，達(dá)不到工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)要求[9]，發(fā)展受限。不同來源的海藻酸鈉降解酶所獲得的產(chǎn)物聚合度也會(huì)有所不同，進(jìn)而對(duì)寡糖的生物活性產(chǎn)生影響。從不同的途徑尋找和生產(chǎn)具有高活性的海藻酸鈉裂解酶已成為研究焦點(diǎn)[10]。篩選高效降解褐藻膠菌株是開發(fā)褐藻資源的重要新途徑，目前鮮少有報(bào)道在50 g/L 高濃度海藻酸鈉培養(yǎng)基中仍保持酶活力較強(qiáng)的菌株，近年來多數(shù)報(bào)道的降解菌直接利用褐藻膠的濃度低于50 g/L[11?13]。

本研究從北海潿洲島采集的馬尾藻中篩選得到一株褐藻膠降解菌Vibrio ganglieiM0101，該菌株對(duì)海藻酸鈉具備很強(qiáng)的水解能力，通過對(duì)菌株M0101 的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，為后期該菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 篩選自廣西北海潿洲島（109°08′00″E，21°01′00″N）的馬尾藻；海藻酸鈉培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 15 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，海藻酸鈉6 g/L，pH7.5；（NH4）2SO4分析純，廣東光華科技股份有限公司；K2HPO4分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；NaCl分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；MgSO4·7H2O

分析純，天津博迪化工股份有限公司；3, 5-二硝基水楊酸 化學(xué)純，成都市科龍化工試劑廠；FeSO4·7H2O 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海藻酸鈉 分析純，阿拉丁；H2SO4分析純，廉江市廉化試劑有限公司。

HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TS-200B 恒溫?fù)u床 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；LHS-250SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；Tprofessional PCR 儀 德國biometra；1-14K 小型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 德國Sigma；Sherolock 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng) 美國MIDI（Microbial Identification）公司；HP6890 氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻酸鈉降解菌的分離 稱取0.2 g 馬尾藻，置于1.5 mL 的無菌離心管中，加入0.8 mL 無菌水，用電動(dòng)研磨棒研磨成勻漿液，取勻漿液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取0.1 mL 稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，將平板倒置于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，挑取生長好、形態(tài)和顏色不同的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選 挑取單菌落點(diǎn)接于海藻酸鈉培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，以10%（w/v）氯代十六烷基吡啶覆蓋平板染色（chlorhexadecyl pyridine，CPC）15 min，將顯示水解圈的菌株進(jìn)行褐藻膠裂解酶相對(duì)酶活力測定。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 生理生化特征檢測 在平板上挑取單菌落至液體分離培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng) 24 h，將菌液用無菌生理鹽水稀釋到適當(dāng)濃度，取 100 μL 涂布于初篩培養(yǎng)基中，30 ℃下倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌株形態(tài)，形態(tài)鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]，將菌體送至中國科學(xué)院微生物研究所，由其完成生理生化特征檢測和細(xì)胞脂肪酸組成測定。

1.2.3.2 細(xì)胞脂肪酸組成測定 使用Sherolock 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌體脂肪酸成分分析，采用HP6890 氣相色譜儀進(jìn)行色譜分析，配備分流/不分流進(jìn)樣口，氫火焰離子檢測器（FID）及HP 氣相色譜化學(xué)工作站（HP CHEMSTATION ver A 5.05）；色譜柱為UItra-2 柱，長25 m，內(nèi)徑0.2 mm，濾膜厚度0.33 μm；爐溫為二階程序升溫：起始溫度170 ℃，每分鐘5 ℃升至260 ℃，隨后以40 ℃/min 升至310 ℃，維持1.5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氫氣，流速0.5 mL/min，分流進(jìn)樣模式，分流比100:1，進(jìn)樣量2 μL；檢測器溫度300 ℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，補(bǔ)充氣（氮?dú)猓┝魉?0 mL/min。

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株DNA 的提取采用Chelex-100 法，用無菌牙簽挑取少量菌體于1.5 mL的離心管中，加入50 μL 10% 的Chelex-100 溶液，振蕩混勻，于100 ℃加熱10 min，冷卻至室溫后，12000 r/min 離心10 min，上清液即可用于后續(xù)的DNA 擴(kuò)增。采用 16S rRNA 通用引物 27F（5' GAG TTTGATCCTGGCTCAG 3'）、1492R（5'GGTTACCTT GTTACGACTT 3'）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI（National Center for Biotechnology Information）核苷酸數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST 分析，選取同源性高的 16S rRNA 序列，采用MEGA7.0（鄰接法，Neighbor-Joining）構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株產(chǎn)酶活力測定 待測菌株用海藻酸鈉液體培養(yǎng)基活化24 h 作為種子培養(yǎng)液，按接種量3%（v/v）接種于裝液量為50 mL 的150 mL 三角瓶中，置于搖床上，30 ℃，200 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)48 h 后，取發(fā)酵液于4 ℃，12000 r/min 離心5 min，上清作為粗酶液進(jìn)行產(chǎn)酶活力測定。采用 3，5-二硝基水楊酸法（DNS）進(jìn)行海藻酸鈉裂解酶活力測定[15]，方法略有改動(dòng)。取100 μL 發(fā)酵上清液和900 μL10 g/L 褐藻酸鈉溶液（pH7.5 的PBS 配制）混合，在30 ℃下水浴30 min 后，加入0.5 mL DNS 緩沖液沸水浴5 min 終止反應(yīng)，對(duì)照組不水浴直接添加0.5 mL DNS 試劑后沸水浴 5 min，冷卻后定容至5 mL，測定OD540nm。

酶活力單位（U/mL）定義為: 在 30 ℃ 條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生 1 μg 還原糖（以葡萄糖計(jì)）需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

相對(duì)酶活力測定: 將試驗(yàn)組的最高酶活力定義為 100%，將其他條件下的酶活力與最高酶活力的比值定義為相對(duì)酶活力。

1.2.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 以海藻酸鈉培養(yǎng)基（如1.1 所列）進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，在（NH4）2SO4濃度為5 g/L，NaCl 濃度為 15 g/L，初始pH 為7.5，培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為 200 r/min 的條件下考察海藻酸鈉濃度（18、20、22、24、26、28、32、40、50 g/L）對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響；并依次考察氮源濃度（0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 g/L）；溫度（25、30、35、40、45 ℃）、轉(zhuǎn)速（100、150、200、250、300 r/min）、初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9、9.5、10.0）及NaCl 濃度（0、20、30、40、60、80、100、120、140、160 g/L）對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響，以確定一個(gè)因素的最適條件為基準(zhǔn)，依次對(duì)其余因素進(jìn)行優(yōu)化，確定菌株的產(chǎn)酶優(yōu)化方案。

1.2.6 菌株生物量的測定 生物量通過OD600的大小來反映，以8 g/L 的海藻酸鈉液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，按一定倍數(shù)稀釋菌液，應(yīng)用TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì)進(jìn)行OD600值測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用軟件Origin8.5 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)和繪圖。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選與鑒定

在以褐藻膠為唯一碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩，經(jīng)10%（w/v）氯代十六烷基吡啶（Chlorhexadecyl pyridine，CPC）染色后，獲得6 株產(chǎn)酶菌株。將獲得的6 株產(chǎn)酶菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定其相對(duì)酶活力，發(fā)現(xiàn)菌株M0101 的相對(duì)酶活力最高（結(jié)果見圖1、圖2），后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)M0101 的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 不同產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶菌株CPC（chlorhexadecyl pyridine）染色結(jié)果Fig.1 CPC straining of different alginate lyases-producing bacterial strains

圖2 不同產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶菌株相對(duì)酶活力Fig.2 Relative enzyme activity of different alginate lyases-producing bacterial strains

菌株M0101 在篩選培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d，菌落呈圓形，邊緣整齊，淡黃色，表面光滑（圖3）。該菌株在葡萄糖、甘露醇、甘露糖、甘油、乙酰氨基葡糖、麥芽糖中均可生長，其基因組DNA 的G+C 含量為41.1mol%，與弧菌屬中相關(guān)菌種的生理生化特性的比較見表1。M0101 中主要脂肪酸成分及含量為C12:0（9.38%）, C14:0（4.24%）, C16:0（15.61%）, C18:1ω7c（14.69%）, C18:1ω9c（1.95%）, C14:03OH/C16:1iso 1（9.09%）, C16:1w7c/C16:1w6c（45.06%），與弧菌屬相關(guān)菌種的脂肪酸成分比較如表2 所示，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所檢測鑒定，菌株M0101 為弧菌Vibriosp.。

表1 菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strains

表2 不同菌株脂肪酸組成（%）Table 2 Fatty acids composition of different strains (%)

圖3 M0101 菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain M0101

對(duì)菌株的16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測序后，經(jīng)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株M0101 與Vibrio ganglieiSZDIS-1 序列的相似性達(dá)100%，該菌株與其近源菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，結(jié)合形態(tài)與生理生化特征分析，該菌株與弧菌Vibrio ganglieiSZDIS-1 相似性很高，將其命名為Vibrio ganglieiM0101。

圖4 菌株M0101 的16S rDNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the 16S rRNA sequence of strain M0101

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.2.1 碳源、氮源濃度優(yōu)化 培養(yǎng)基成分中海藻酸鈉（C 源）、硫酸銨（N 源）對(duì)菌株M0101 生長和相對(duì)酶活力影響的結(jié)果如圖5 所示。在18～50 g/L 海藻酸鈉濃度范圍內(nèi)，隨著海藻酸鈉濃度的升高，菌株的海藻酸鈉裂解酶的相對(duì)酶活力和生物量呈上升的趨勢（圖5A）。盡管海藻酸鈉添加量為50 g/L 的培養(yǎng)基在接入M0101 種子液前呈現(xiàn)極為濃稠的膠狀，但接種發(fā)酵20 h 后，濃稠膠狀的培養(yǎng)基被水解成有較大流動(dòng)性的溶液狀態(tài)，細(xì)菌在培養(yǎng)基中分布均勻，可直接稀釋一定倍數(shù)測定OD600反映其生物量。結(jié)果表明菌株M0101 具備水解高濃度海藻酸鈉的能力，其生物量和相對(duì)酶活力均在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)達(dá)到最大值（圖5A）。在更高的海藻酸鈉濃度條件下，菌株M0101 可能具有更高的水解酶活力，這有待進(jìn)一步作深入研究，本文沒有繼續(xù)探討其水解海藻酸鈉的能力極限與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系，故選擇海藻酸鈉添加量為50 g/L 為基準(zhǔn)作后續(xù)優(yōu)化。

在0.5～8 g/L 的濃度范圍內(nèi)，（NH4）2SO4對(duì)M0101生物量和相對(duì)酶活力的影響見圖5B。當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量濃度在0.5～2 g/L 時(shí)，隨著氮源濃度增加，菌株生物量和相對(duì)酶活力均隨之增加，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量濃度為2 g/L 時(shí)，菌株的相對(duì)酶活力達(dá)到最大值，之后隨著氮源濃度的繼續(xù)增加，生物量處于穩(wěn)定的狀態(tài)，而相對(duì)酶活力有所波動(dòng)，綜合考慮生物量、相對(duì)酶活力因素及用料成本，選擇（NH4）2SO4的添加量為2 g/L，以此為基準(zhǔn)作后續(xù)優(yōu)化。

圖5 不同碳源、氮源濃度對(duì)菌株M0101 產(chǎn)酶和生長的影響Fig.5 The effect of different concentration of carbon source and nitrogen source on enzyme production and growth of strain M0101

2.2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化 不同溫度、轉(zhuǎn)速和初始pH 發(fā)酵條件對(duì)菌株M0101 產(chǎn)酶和生長影響結(jié)果如圖6所示。隨著發(fā)酵溫度升高，菌株的生長和相對(duì)酶活力增加，相對(duì)酶活30 ℃時(shí)達(dá)到最大值，35 ℃時(shí)相對(duì)酶活力持平，隨后隨著溫度增加而逐步下降。生物量在35 ℃后下降明顯，相對(duì)酶活力受溫度影響相對(duì)較低。當(dāng)45 ℃時(shí)，菌株仍能生長，但生物量只有高峰值的三分之一，相對(duì)酶活力達(dá)到高峰值的80%左右（圖6A）；故本研究以較溫和的溫度30 ℃為基準(zhǔn)作后續(xù)優(yōu)化。

轉(zhuǎn)速對(duì)菌株相對(duì)酶活力影響不大，但對(duì)菌株的生長具有一定的影響（圖6B），隨著轉(zhuǎn)速的增加，相對(duì)酶活力呈較平穩(wěn)狀態(tài)，而菌株的生長呈上升的趨勢，轉(zhuǎn)速低于200 r/min 時(shí)，菌株的生長受抑制，可能與轉(zhuǎn)速影響培養(yǎng)基中的容氧量相關(guān)。轉(zhuǎn)速在200～300 r/min 的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力有所波動(dòng)，但轉(zhuǎn)速分別為200 r/min 和300 r/min 時(shí)，相對(duì)酶活力沒有顯著性差異（P=0.065>0.05），故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的轉(zhuǎn)速為200 r/min，以此為基準(zhǔn)作進(jìn)一步優(yōu)化。

初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)酶和生長影響結(jié)果如圖6C所示，在pH5.5～9.5 范圍內(nèi)，其相對(duì)酶活力和菌株生長隨pH 升高而呈上升趨勢，pH 為9.5 時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到最大值，且與pH 為9.0 時(shí)比較，相對(duì)酶活力相差不大，沒有顯著性差異（P=0.605>0.05）；當(dāng)pH大于9.5 時(shí)，菌株的相對(duì)酶活力和生長能力急劇下降。綜合考慮生物量、相對(duì)酶活力因素及未來可能的實(shí)際應(yīng)用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的最適宜的酸堿度為pH9.0，以此為基準(zhǔn)進(jìn)一步優(yōu)化NaCl 濃度。

圖6 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株M0101 產(chǎn)酶和生長的影響Fig.6 The effect of different culture conditions on enzyme production and growth of strain M0101

2.2.3 NaCl 濃度優(yōu)化 菌株M0101 分離自腐爛的馬尾藻，其生長和產(chǎn)酶需要一定的鹽度，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl 對(duì)菌株M0101 的生長和產(chǎn)酶影響很大。由圖7 可知，M0101 的生長和產(chǎn)酶能力與NaCl 的濃度密切相關(guān)，當(dāng)NaCl 濃度為100 g/L時(shí)，菌株的生物量和相對(duì)酶活力均達(dá)到最高值，尤其是生物量明顯高于其他條件，說明其能適應(yīng)高濃度NaCl 環(huán)境，與其同源性很高的菌株Vibrio ganglieiSZDIS-1 能在NaCl 濃度高達(dá)14%（140 g/L）的環(huán)境中生長[19]，表明兩者同為耐鹽菌；M0101 具有耐鹽性推測與菌株生長的海洋環(huán)境相關(guān)；當(dāng)NaCl 濃度繼續(xù)增加，菌株的生長和相對(duì)酶活力急劇下降，NaCl 濃度大于140 g/L 時(shí)，不利于菌株的生長和產(chǎn)酶。綜上所述，選擇NaCl 的濃度為100 g/L。

圖7 不同NaCl 濃度對(duì)菌株M0101 產(chǎn)酶和生長的影響Fig.7 The effect of different concentration of NaCl on enzyme production and growth of strain M0101

2.2.4 優(yōu)化前后菌株M0101 生長和產(chǎn)酶能力 根據(jù)上文優(yōu)化結(jié)果，產(chǎn)酶優(yōu)化方案確定為：海藻酸鈉50 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 100 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，初始pH9.0，30 ℃，200 r/min。菌株M0101 發(fā)酵條件優(yōu)化前后的生長及產(chǎn)酶能力如圖8 所示，優(yōu)化前，菌株M0101 發(fā)酵過程中延滯期較短，24 h 以前已達(dá)到穩(wěn)定期（見圖8A），酶活力也處于平穩(wěn)狀態(tài)（圖8B），酶活力較低。優(yōu)化后，菌株M0101 對(duì)海藻酸鈉有較強(qiáng)的利用能力，培養(yǎng)基中碳源濃度高，粘稠，菌株發(fā)酵過程中延滯期延后，24 h 以前處于延滯期，經(jīng)24 h 發(fā)酵后，濃稠狀態(tài)的培養(yǎng)基（含50 g/L 海藻酸鈉的培養(yǎng)基呈濃稠狀態(tài)）才被水解為流動(dòng)的溶液狀態(tài)，菌體在培養(yǎng)基中均勻分布，此時(shí)可利用紫外可見光分光光度計(jì)測定600 nm 處的吸光度值，以此反映發(fā)酵菌株的生物量。32 h 后菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期（圖8A），是海藻酸鈉裂解酶迅速積累期，發(fā)酵32 h 酶活力達(dá)到最大值221.90 U/mL（圖8B），48 h 后菌株的生長到達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)酶活力已開始逐漸降低。相較于發(fā)酵條件優(yōu)化前最大酶活36.32 U/mL，優(yōu)化后酶活力是優(yōu)化前的6.11 倍。

圖8 菌株M010 發(fā)酵條件優(yōu)化前后生長及產(chǎn)酶曲線Fig.8 Growth and enzyme production curve of strain M0101 before and after optimization of fermentation conditions

3 討論與結(jié)論

褐藻膠裂解酶酶活的高低是微生物吸收利用褐藻膠的關(guān)鍵，其作為一種用途廣泛的工具酶，在制備低分子質(zhì)量的褐藻膠寡糖時(shí)，因反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、得率高而逐漸成為制備褐藻膠寡糖的主要方式[20?21]。近年來，從細(xì)菌中分離出了許多褐藻膠裂解酶，產(chǎn)酶菌屬主要包括Vibrio[22?23]、Flavobacterium[24?25]、Pseudomonas[26?27]、Microbulbifer[28?29]等。本研究中產(chǎn)酶菌株是從北海潿洲島采集的馬尾藻中分離出來的一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株，根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA 基因序列分析，鑒定為弧菌屬Vibrio，命名為Vibrio ganglieiM0101?；【鷮賰?nèi)不同菌株的褐藻膠裂解酶活力存在較大差異，李云濤等[30]對(duì)Vibriosp.SS-1 通過響應(yīng)面法優(yōu)化后，酶活力最大可達(dá)191.8 U/mL，傅曉妍等[31]篩選到的弧菌Vibriosp.QY102 優(yōu)化培養(yǎng)120 h 后，產(chǎn)酶達(dá)10.2 U/mL，與本文中Vibrio ganglieiM0101 發(fā)酵優(yōu)化后，產(chǎn)酶活性達(dá)221.90 U/mL 比較，均存在差異，推測與褐藻膠裂解酶相關(guān)基因的差異有關(guān)。培養(yǎng)基的成分在微生物發(fā)酵過程中對(duì)細(xì)菌的產(chǎn)酶活力具有決定性作用，合適的碳、氮、金屬離子能夠促進(jìn)菌株的生長和產(chǎn)酶[32]。菌株M0101 能夠高效利用高濃度海藻酸鈉，隨著海藻酸鈉濃度的升高，菌株的褐藻膠裂解酶活力和生物量呈上升的趨勢，具備高效水解高濃度海藻酸鈉（50 g/L）的能力。NaCl通常起著維持菌體內(nèi)外滲透壓、維持細(xì)胞內(nèi)外電勢差、參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖饔?，在以褐藻膠為碳源的微生物培養(yǎng)基中，還起著運(yùn)送褐藻膠大分子進(jìn)入細(xì)胞膜的作用，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl 質(zhì)量濃度高達(dá)100 g/L 時(shí)，菌株 M0101 仍能正常生長，符合海洋細(xì)菌嗜鹽的特點(diǎn)，與其他同類型產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的嗜鹽菌株相比，該菌株的鹽耐受性較強(qiáng)[33]；同時(shí)，NaCl 還能影響海藻酸鈉裂解酶的活性，Xu 等[34]報(bào)道的PL7 家族海藻酸鈉裂解酶AlyC3 是一種新型的耐低溫、鹽活化酶，NaCl 濃度為0.5 mol/L（29.25 g/L）時(shí)酶活力最強(qiáng)，且濃度為3 mol/L（175.5 g/L）時(shí)酶活力仍高于沒有NaCl 存在時(shí)。Huang 等[35]發(fā)現(xiàn)V. weizhoudaoensisM0101（Vibrio ganglieiM0101）中的algM4 基因編碼的AlgM4 酶是一種新型的鹽活化的雙功能酶，經(jīng)克隆、表達(dá)、純化該雙功能酶，發(fā)現(xiàn)其最適的NaCl濃度為1 mol/L（58.5 g/L），NaCl 不僅改變了該酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的組成，同時(shí)也提高了該酶的熱穩(wěn)定性；該酶的最適NaCl 濃度與其菌體產(chǎn)酶的最適濃度（100 g/L）差異大，對(duì)M0101 基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)M0101 具有5 種海藻酸鈉裂解酶編碼基因，推測這種差異與M0101 能同時(shí)表達(dá)多種褐藻酸鈉裂解酶有關(guān)。

對(duì)培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，確定菌株M0101 最佳產(chǎn)酶條件為海藻酸鈉50 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 100 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，初始pH9.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，在此條件下可獲得最大酶活為221.90 U/mL，是優(yōu)化前的6.11 倍。這為高活性褐藻膠裂解酶工業(yè)制備和褐藻膠寡糖生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。