半夏及姜半夏用藥安全性初步研究*

張夢麒，李小輝，趙道強，鐘承志，吳德松

云南省藥物研究所/云南白藥創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖[1]，主產(chǎn)地為我國四川、湖南、河南、貴州等省，東北、華北等地區(qū)亦有分布[2]。半夏味辛性溫，有毒[3]，麻舌而刺喉[1]，對口腔和消化道黏膜有強烈的刺激性，可導(dǎo)致嘔吐、水瀉、喉頭水腫等不良反應(yīng)，而嚴重的喉頭水腫可致呼吸困難、窒息等癥狀，甚至引起死亡[4]。姜半夏為半夏藥材按照《中華人民共和國藥典》的規(guī)定經(jīng)煎煮炮制后得到的炮制品[1]。與半夏比較，姜半夏毒性降低[5]，因此，臨床上多采用半夏炮制品，如姜半夏、法半夏等代替半夏入藥。

目前，半夏的毒性研究主要涉及急性毒性[6-7]、刺激性[8-9]及胚胎毒性[10]，但未見姜半夏的毒性研究、半夏及姜半夏的安全性對比研究。因此，本文旨在對半夏及姜半夏安全性對比進行初步研究，為半夏及姜半夏臨床使用的安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與細胞SPF級ICR小鼠，雌性90只，雄性60只，體質(zhì)量18～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0004。30只SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCKX(京)2016-0011。SPF級日本大耳白兔24只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由昆明楚商科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)2018-0001。SPF級金黃地鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量120～140 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011。實驗動物自由飲水、進食。飼養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，相對濕度40%～70%。實驗動物飼養(yǎng)在云南白藥創(chuàng)新研發(fā)中心藥理實驗室，動物使用許可證：SYXK(滇)2017-0004。

小鼠胚胎干細胞(ES細胞)，購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號：20190329AOF2。

1.2 藥物與試劑半夏(購于云南省昆明市新螺螄灣國際商貿(mào)城中藥材市場，由云南白藥集團股份有限公司創(chuàng)新研發(fā)中心天然藥物化學(xué)研究室鑒別清洗后使用，批號：20190227)。食用淀粉(成都達恒毛實業(yè)有限公司，批號：20180728)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1803302722)；伊文思藍(上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10154249)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)、非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)、鼠重組白血病抑制因子(recombinant mouse leukemia inhibitory factor，LIF)(美國Gibco公司，批號：1891605、2044404、1697785、8118211、STBH3182、2027433、0913-200-33-E)；MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma公司，批號：MKBS4732V、BCBV2983)；青-鏈霉素(以色列Biological Industries公司，批號：1638751)。

1.3 儀器JJ-2000型電子天平[美國雙杰兄弟(集團)有限公司]；PL-203型電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；ELGA LA 613型超純水機[英國ELGA LabWater/VWS(UK)有限公司)；Multiskan Go型連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司]；DMIL-LED型熒光倒置相差顯微鏡(德國萊卡公司)；AC2-6S1型二級生物安全柜、CCL-170A-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；DW-86L486型超低溫冰箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；3H12RI型高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司，離心半徑：7.5 cm)。

2 方法

2.1 藥物制備及半夏與姜半夏的顯微鑒別半夏粉制備：稱取250.5 g半夏藥材，粉碎，過100目篩，得到半夏粉227.4 g。姜半夏粉制備：取半夏藥材，洗凈，大小分開，用水浸泡至內(nèi)無干心時，取出；另取生姜切片煎湯，加白礬與半夏共煮，取出，晾至半干，干燥；或切薄片，干燥。每100 kg半夏，加入生姜 25 kg、白礬12.5 kg炮制。稱取200 g姜半夏，粉碎，過100目篩，得姜半夏粉末130 g。對制備得到的半夏粉及姜半夏粉進行顯微觀察，比較二者的不同。

2.2 小鼠急性毒性實驗根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的2014 版《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》及文獻方法[11-12]，60只雌雄各半SPF級ICR小鼠按體質(zhì)量分為3組，即溶媒對照組、半夏粉組及姜半夏粉組，每組20只。給藥組以40 mL·kg-1的劑量給予 0.4 g·mL-1半夏或姜半夏溶液，24 h內(nèi)灌胃藥物3次，溶媒對照組灌胃等體積純水。每次給藥間隔5 h，給藥后立即喂水，末次給藥2 h后投喂飼料。給藥后觀察動物的臨床癥狀(如動物表觀、行為、飲食、對刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等)及死亡情況(死亡時間、瀕死前反應(yīng)等)，每天觀察1次，連續(xù)14 d。于給藥后第3天、第7天、第14天稱量小鼠體質(zhì)量。觀察期結(jié)束后處死小鼠，解剖后觀察小鼠臟器的體積、顏色、質(zhì)地等有無明顯異常。

2.3 日本大耳白兔眼部刺激實驗參照文獻[13-16]方法，選取SPF級雌雄各半的日本大耳白兔24只，按體質(zhì)量分為4組，即溶媒對照組、淀粉(陰性對照)組、半夏粉組及姜半夏粉組，每組6只，溶媒對照組給予生理鹽水，其余各組采用生理鹽水將淀粉、半夏粉及姜半夏粉配制成濃度為0.1 g·mL-1的藥液。將日本大耳白兔固定，用手將兔左側(cè)眼睛的上下眼瞼輕輕撩起，在眼部結(jié)膜囊處滴入0.2 mL相應(yīng)藥物混懸液，使兔眼部上下眼瞼被動閉合10 s，使藥物與眼部充分接觸，右側(cè)眼部滴入等量的生理鹽水作為自身對照。刺激5 min后立即使用大量生理鹽水沖洗至眼中無任何異物。隨后觀察3 h內(nèi)大耳白兔眼部情況，根據(jù)刺激性評分標(biāo)準(表1及表2)進行打分，評定眼刺激強度，并對大耳白兔眼部刺激的反應(yīng)情況進行拍照記錄。

表1 大耳白兔眼部刺激性評分標(biāo)準

表2 大耳白兔眼部刺激性評價標(biāo)準

2.4 金黃地鼠口腔黏膜刺激性實驗參照文獻[17-19]方法，將SPF級雌雄各半的金黃地鼠按體質(zhì)量分為溶媒對照組、半夏粉組及姜半夏粉組。實驗前，對金黃地鼠右側(cè)口腔頰黏膜進行檢查，確定無異常后，將藥物混懸液(藥物配置同2.3)滴在直徑約為5 mm的滅菌脫脂棉球上，并將棉球放入動物右側(cè)頰囊處，動物頸部帶上皮筋以避免動物將棉球吐出，溶媒對照組給予生理鹽水刺激，每日刺激1次，每次15 min，連續(xù)7 d。每日給藥前、給藥1 h后、給藥4 h后觀察并記錄與藥物接觸的黏膜有無紅斑、糜爛和水腫等情況，按表3進行評分。末次觀察結(jié)束后，處死動物，觀察與藥物接觸部位及周圍頰黏膜、氣管有無刺激反應(yīng)。

表3 金黃地鼠口腔黏膜刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準

2.5 小鼠生殖毒性實驗參照文獻[20-23]方法，將SPF級ICR雄性小鼠按體質(zhì)量隨機分為3組，每組10只；SPF級ICR雌性小鼠按體質(zhì)量隨機分為3組，每組20只，分別為溶媒對照組、半夏粉組及姜半夏粉組。將雌雄鼠按21比例合籠交配，于發(fā)現(xiàn)陰栓日定為妊娠0 d。所有雌鼠均于妊娠1 d開始給藥，給藥組以20 mL·kg-1的劑量灌胃給予1.85 mg·kg-1相應(yīng)藥液，溶媒對照組灌胃等體積純水，每天1次，連續(xù)19 d。妊娠期第20天(即停藥24 h后)，將雌鼠放血處死，解剖，觀察仔鼠形態(tài)，并稱質(zhì)量。詳細記錄仔鼠總數(shù)、活胎數(shù)、發(fā)育正常數(shù)、死胎數(shù)、畸形數(shù)(包括頭部、四肢及軀干畸形)。

2.6 含藥血清對小鼠胚胎干細胞體外增殖影響的實驗參照文獻[24-28]，將SPF級雄性Wistar大鼠按體質(zhì)量隨機分為溶媒對照組、半夏粉組及姜半夏粉組，每組10只。給藥組按10 mL·kg-1的劑量灌胃1.05 mg·kg-1的相應(yīng)藥物，溶媒對照組灌胃等容積純水，每天1次，連續(xù)5 d，末次灌胃1 h后腹主動脈取血，靜置后3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，并進行滅活濾菌，制備半夏粉、姜半夏粉的含藥血清及溶媒血清，保存?zhèn)溆谩?/p>

取ES細胞株進行培養(yǎng)，采用DMEM完全培養(yǎng)液[100 mL DMEM完全培養(yǎng)液內(nèi)含20 mL FBS、1 mL β-ME、1 mL 1%的NEAA、0.1 mL LIF(10 mg·L-1)、1 mL青-鏈霉素(10 000 U·mL-1)和76.9 mL DEME高糖培養(yǎng)基]進行常規(guī)培養(yǎng)。消化ES細胞，用DMEM實驗培養(yǎng)液[100 mL DMEM實驗培養(yǎng)液內(nèi)含20 mL FBS、1 mL青-鏈霉素(10 000 U·mL-1)和79 mL DEME高糖培養(yǎng)基]配成單細胞懸液，以每孔500個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，分為溶媒對照組、半夏粉組及姜半夏粉組，分別加入含有20%相應(yīng)血清的DMEM實驗培養(yǎng)液，終體積為 100 μL，每組設(shè)6個平行孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，于濕度95%、5%CO2、37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心后吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min顯色。待沉淀完全溶解后，于630 nm波長[24]處測定吸光度值(optical density，OD)。

3 結(jié)果

3.1 半夏及姜半夏的顯微特征顯微鏡下對半夏粉及姜半夏粉進行鑒定觀察，發(fā)現(xiàn)半夏粉具有針型結(jié)構(gòu)；經(jīng)過炮制的姜半夏粉中未發(fā)現(xiàn)針型結(jié)構(gòu)。提示：半夏經(jīng)過炮制后，化學(xué)成分發(fā)生變化。見圖1。

注：A：半夏粉；B：姜半夏粉圖1 半夏粉、姜半夏粉顯微特征觀察(×100)

3.2 小鼠急性毒性實驗結(jié)果半夏粉組、姜半夏粉組部分小鼠出現(xiàn)豎毛狀態(tài)，半夏粉組小鼠豎毛出現(xiàn)最早時間為給藥6 h 58 min后，而姜半夏粉組動物豎毛出現(xiàn)最早時間為給藥6 h 44 min后，未見其他異常表現(xiàn)。給藥2 d后，小鼠恢復(fù)正常，未見其他異常表現(xiàn)。14 d內(nèi)無動物死亡。對各組小鼠的體質(zhì)量進行比較發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的體質(zhì)量均持續(xù)增長；與溶媒對照組比較，給藥后第3天、第7天和第14天，給藥組雄性小鼠的體質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后第3天、第7天和第14天，半夏粉組雌性小鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.001、P<0.001、P<0.01)；給藥后第3天，姜半夏粉組雌性小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。小鼠處死后進行解剖觀察發(fā)現(xiàn)，各組小鼠臟器均未見明顯異常。見表4，表5。

表4 急性毒性實驗中小鼠豎毛情況結(jié)果比較 只)

表5 急性毒性實驗中小鼠體質(zhì)量變化情況比較

3.3 日本大耳白兔眼部刺激實驗結(jié)果與溶媒對照組比較，半夏粉組兔眼部刺激評分顯著升高(P<0.001)，姜半夏粉組兔眼部刺激評分無明顯變化。提示，半夏粉對兔眼部具有刺激性，而姜半夏粉無刺激性。見表6，圖2。

圖2 各組各時間點兔眼部刺激結(jié)果圖片

表6 各組日本大耳白兔眼部刺激評分比較 分)

3.4 金黃地鼠口腔黏膜刺激性實驗結(jié)果與溶媒對照組比較，半夏粉組金黃地鼠口腔黏膜刺激評分顯著升高(P<0.001)，而姜半夏粉組金黃地鼠口腔黏膜刺激評分無明顯變化。提示，半夏粉對金黃地鼠口腔黏膜具有刺激性，姜半夏粉無刺激性。見表7，表8。

表7 給藥3 d內(nèi)各組金黃地鼠口腔黏膜刺激反應(yīng)評分結(jié)果比較 分)

表8 給藥4～7 d內(nèi)各組金黃地鼠口腔黏膜刺激反應(yīng)評分結(jié)果比較 分)

3.5 小鼠生殖毒性實驗結(jié)果與溶媒對照組比較，半夏粉組及姜半夏粉組孕鼠體質(zhì)量、懷孕數(shù)、仔鼠總數(shù)、發(fā)育正常數(shù)、平均子宮連胎質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。見表9，表10。

表9 各組孕鼠體質(zhì)量的比較

表10 各組小鼠生殖毒性結(jié)果比較

3.6 含藥血清對小鼠胚胎干細胞體外增殖的影響與溶媒對照組比較，在波長為630 nm處，各組細胞的吸光度均未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。提示，半夏粉、姜半夏粉含藥血清對小鼠胚胎干細胞體外增殖均無影響。見表11。

表11 含藥血清對ES細胞體外增殖的影響

4 討論

中藥炮制是按要求將中藥材進行加工，可降低或消除藥材的毒副作用，改變藥材的性味、功效和臨床療效等[29]。本研究采用最大給藥量法進行急性毒性實驗，小鼠灌胃半夏及姜半夏后，均出現(xiàn)豎毛、體質(zhì)量增長緩慢的毒性反應(yīng)。根據(jù)《毒理學(xué)教程》(第三版)提示，半夏粉及姜半夏粉的毒性可能涉及動物的自主神經(jīng)，導(dǎo)致動物出現(xiàn)一系列毒性作用。但與半夏粉組比較，姜半夏粉組動物體質(zhì)量恢復(fù)較快，說明經(jīng)炮制后，姜半夏毒性降低。但急性毒性實驗結(jié)果僅作為參考，并不能對半夏、姜半夏的毒性作用進行完整的闡釋，因此需結(jié)合其他毒性實驗進行研究。兔眼部刺激性實驗與金黃地鼠口腔黏膜刺激性實驗結(jié)果顯示，半夏對兔眼部及金黃地鼠口腔黏膜均有明顯的刺激性，而姜半夏卻沒有，這一結(jié)果進一步證實，炮制以后姜半夏的毒性有所降低。對半夏和姜半夏的粉末進行顯微鑒別發(fā)現(xiàn)，半夏粉中出現(xiàn)了大量針晶結(jié)構(gòu)，而姜半夏粉中未發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)，與已有研究結(jié)果一致[30]，推測半夏的刺激性主要是針晶結(jié)構(gòu)的化合物導(dǎo)致的，但半夏針晶結(jié)構(gòu)化合物導(dǎo)致刺激性的原因還不清楚，后續(xù)將對此進行深入研究。

國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(the International council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use，ICH)推薦的生殖毒性動物實驗是對整體動物進行的毒理實驗，即三段實驗，包括一般生殖毒性實驗(Ⅰ)、圍產(chǎn)期生殖毒性實驗(Ⅱ)、致畸敏感期生殖毒性實驗(Ⅲ)。三段實驗需大量動物且實驗周期長、費用高，難以迅速對大量物質(zhì)進行毒性評價，亦不符合減少(reduction)、替代(replacement)和優(yōu)化(refinement)的“3R”原則。本研究中采用小鼠生殖毒性實驗，與三段實驗比較，花費少，操作簡單，能觀察到胚體-胎體毒性(致畸實驗)，評價重點均為胚胎毒性，但對生育力和早期胚胎發(fā)育毒性及圍產(chǎn)期毒性無法覆蓋。20世紀90年代末，歐洲替代方法研究中心(European centre for the validation of alternative methods，ECVAM)所推薦的胚胎干細胞實驗(embryonic stem cell，EST)、胚胎細胞微團培養(yǎng)實驗(embryonic cell micromass culture，MM)及體外全胚胎培養(yǎng)實驗(whole embryo culture，WEC)可作為體外胚胎發(fā)育毒性篩選實驗的替代方法[31]。因此，本研究采用小鼠生殖毒性實驗及含藥血清對小鼠胚胎干細胞的體外增殖實驗進行初步生殖毒性研究，結(jié)果顯示，半夏及姜半夏均不具有生殖毒性，與其他研究者結(jié)果不一致[32]，可能是由于半夏及姜半夏的劑量不同所致，且本研究中采用的初步生殖毒性研究內(nèi)容較少，無法全面覆蓋生殖及遺傳毒性研究。因此，后續(xù)需采用生殖毒性三段實驗、遺傳毒性實驗及胚胎干細胞實驗、胚胎細胞微團培養(yǎng)實驗及體外全胚胎培養(yǎng)實驗對生半夏及姜半夏的安全性進行進一步研究。

綜上所述，在本實驗條件及所設(shè)計的劑量下，半夏粉對兔眼部黏膜、金黃地鼠口腔黏膜均具有刺激性，但不具生殖毒性，而姜半夏無刺激性亦無生殖毒性，說明半夏經(jīng)炮制后毒副作用降低或消除。后續(xù)將對半夏及姜半夏的毒理、毒性進行進一步研究，并對其藥理學(xué)作用進行對比研究，進一步探討炮制的增效減毒作用，為半夏及其炮制品臨床使用的安全性、有效性提供科學(xué)依據(jù)。