參芪扶正湯對盆腔炎性疾病后遺癥小鼠上生殖道炎癥的影響*

劉小月，黃海濤，卜曉玲

北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078

盆腔炎性疾病后遺癥(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)是由于女性盆腔炎性疾病未得到及時診治或治療失誤而導致的[1]，其主要病理表現(xiàn)為組織破壞、粘連、增生、瘢痕生成等[2]，主要癥狀是反復下腹隱痛、久站及勞累后出現(xiàn)下腹墜脹感、腰骶酸痛及白帶異常等，遠期將引發(fā)不孕、異位妊娠、慢性盆腔痛，甚至SPID急性發(fā)作等嚴重疾病。按發(fā)病部位可將SPID歸為子宮內(nèi)膜炎、輸卵管慢性炎癥、輸卵管積水、輸卵管卵巢炎、卵巢囊腫、盆腔結締組織炎等[3]。目前，臨床診治中發(fā)現(xiàn)，SPID的慢性盆腔痛癥狀尤為突出，且有病情頑固、反復不愈、病程遷延的特點，發(fā)病率逐年增高[4]，嚴重影響廣大女性生活質(zhì)量和身心健康。SPID屬于無菌性炎癥，無明顯治療指征，若濫用抗生素易造成菌群失調(diào)甚至二重感染等嚴重后果，給臨床治療帶來嚴重不便。丹枝飲是北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院金哲教授的經(jīng)驗方，方中丹參、桑枝、川芎、續(xù)斷、連翹、延胡索、香附等中藥通過活血化瘀、驅邪以提高機體免疫力。研究顯示，丹枝飲可促進盆腔局部血液循環(huán)、改善盆腔炎癥微環(huán)境、提高機體免疫力[5-7]，臨床診治已取得確切療效。SPID反復發(fā)作、難愈成瘀，日久必定耗傷機體正氣，因此，在臨床治療中除化瘀外，還應重視扶正。參芪扶正湯是基于金哲教授的經(jīng)驗方丹枝飲加減而來，方中黃芪、黨參、白術等中藥健脾益氣、固護后天正氣，配合丹參、赤芍、當歸、雞血藤等中藥活血化瘀。氣為血之帥，血為氣之母，正氣存內(nèi)，邪不可干，正氣足，則活血化瘀效果更佳。本研究以SPID模型小鼠為研究對象，以炎癥因子IL-8、TNF-α、IL-4、IL-10的表達水平的檢測指標，探討參芪扶正湯對SPID小鼠上生殖道炎癥因子的影響。

1 材料

1.1 動物SPF級BALB/c雌性小鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-2011，動物合格證：11400700337244。實驗動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學生物安全II級動物房，室溫(25±1) ℃，濕度為50%～60%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。該研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院倫理委員會批準通過，倫理批號：BUCM-4-2018031201-1017。

1.2 藥物與試劑參芪扶正湯(黃芪15 g、黨參15 g、當歸10 g、白術15 g、丹參10 g、赤芍10 g、雞血藤10 g、桑枝10 g、延胡索9 g，北京康仁堂有限公司，批號：18000151、18002031、17027701、17024751、17023601、18000981、18001212、17016042、17027761)；阿司匹林腸溶片(阿斯利康制藥有限公司，規(guī)格：0.5 g·片-1，國藥準字：H32026199)。濃鹽酸(hydrochloric acid，HCL，國藥集團化學制劑有限公司，批號：20180306)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma公司，批號：12190801)；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC，天津市福晨化學試劑廠，批號：20140715)；孕馬血清促性腺素(pregant mare serum gonadotropin，PMSG，寧波第二激素廠商，批號：190723)；RIPA裂解液、30%制膠液(291)、1 mol·L-1Tris-HCL(pH 6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCL(pH 8.8)、4×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R0020、A1010、T1020、T1010、P1016)；預染蛋白marker(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：26616)；PVDF膜(0.45 μm，德國Merck Millipore公司，貨號：IPVH00010)；增強型ECL試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：E411-04)；GAPDH一抗(美國Bioworld Technology公司，貨號AP0063)；IL-4一抗、IL-8一抗、TNF-α一抗(英國Abcam公司，貨號：ab9728、ab110727、ab183218)；IL-10一抗(美國Genetex公司，貨號：GTX632359)；多克隆二抗(美國KPL公司，貨號：074-1506)。

1.3 儀器BSA124S型電子天平(德國Sartorius公司)；DW-60W151EU型-80 ℃低溫冰箱、BCD-225SDCW型4 ℃低溫冰箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；AF10型制冰機(美國Scotsman公司)；PL5121型去離子水儀(美國Purelab Plus公司)；X-OMAT BT型醫(yī)用X射線膠片(美國柯達公司)；5417R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司，離心半徑：4cm)；TS-2型轉移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)；DYCZ-24DN型垂直電泳儀、DYCZ-40DN型轉印電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 藥物制備取參芪扶正湯組方顆粒劑，加10倍量蒸餾水充分溶解，以常壓蒸發(fā)濃縮至濃度為0.85 kg·L-1，灌封備用。阿司匹林腸溶片溶于100 mL 37 ℃蒸餾水中，玻璃棒攪拌均勻，使其濃度為10 g·L-1，置于4 ℃冰箱備用。

2.2 分組造模與給藥60只雌性BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組、阿司匹林(陽性對照藥)組、參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌腸組及參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組，每組10只。適應性喂養(yǎng)后，每只小鼠皮下注射7.5 IU的PMSG，每天1次，連續(xù) 2 d。PMSG注射完成24 h后開始造模，除正常組外，每只小鼠以10 mL·kg-1的劑量宮頸內(nèi)注入1 mol·L-1HCL，然后宮頸注射50 mg·kg-1LPS，每次 100 μL，每2 h注射1次，共注射4次，建立SPID小鼠模型[8]。根據(jù)前期實驗研究，選用阿司匹林腸溶片作為陽性對照藥。造模后第6周開始給藥，正常組、模型組給予5‰CMC溶液20 mL·kg-1灌胃；阿司匹林組灌胃20 mL·kg-1阿司匹林腸溶片溶液；參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌腸組分別灌胃、灌腸20 mL·kg-1參芪扶正湯溶液；參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組灌胃(20 mL·kg-1)及灌腸(20 mL·kg-1)參芪扶正湯溶液，每天1次，連續(xù)15 d。

2.3 小鼠臉譜疼痛評分(mouse grimace score，MGS)末次給藥后第2天考察小鼠臉譜疼痛評分。單手固定小鼠使其懸空仰伸，取兩側髂前上棘的連線做3等分，在2個等分點上用棉簽深壓腹部，維持10 s，觀察小鼠面部表情變化。依據(jù)參考文獻進行評分[9]，具體如下：①眼眶收緊：0分(無反應)、1分(輕微)、2分(明顯)；②聳鼻尖：0分(無反應)、1分(輕微)、2分(明顯)；③鼓起兩腮：0分(無反應)、1分(輕微)、2分(明顯)；④耳朵位置：0分(無反應)、1分(直立)、2分(后抻)；⑤胡須擺動：0分(無反應)、1分(輕微)、2分(明顯)。取兩側評分相加后的總分進行統(tǒng)計學分析，通過MGS間接反應小鼠盆腔疼痛程度。

2.4 SPID小鼠上生殖道組織中IL-4、IL-10、IL-8、TNF-α蛋白表達水平的檢測小鼠于臉譜疼痛評分測試后處死，無菌條件下進行解剖，快速取小鼠上生殖道組織(子宮、雙側輸卵管及雙側卵巢)，-80 ℃ 低溫冰箱保存。取上生殖道組織進行總蛋白提取、含量測定、蛋白樣品變性、SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、一抗孵育(11 000)、TBST洗滌、HRP標記的二抗孵育(15 000)、TBST洗滌、顯影，最后進行結果分析。

3 結果

3.1 參芪扶正湯對SPID小鼠MGS的影響與正常組比較，模型組MGS顯著升高(P<0.05)，提示該造模方法有效可行，SPID可導致小鼠慢性盆腔疼痛。與模型組比較，參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌腸組及參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組MGS均降低，其中參芪扶正湯灌腸組、參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組MGS顯著降低(P<0.05)。提示，參芪扶正湯可緩解小鼠的盆腔疼痛。見表1。

表1 參芪扶正湯對SPID小鼠MGS的影響 分)

3.2 參芪扶正湯對SPID小鼠上生殖道組織炎癥因子蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組小鼠上生殖道組織IL-10、IL-8、TNF-α的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，而IL-4的蛋白表達水平有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌腸組、參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組小鼠上生殖道組織中抗炎因子IL-4、IL-10的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；促炎因子IL-8和TNF-α的蛋白表達水平呈現(xiàn)不同程度的降低，其中，參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組小鼠上生殖道組織中 IL-8、TNF-α的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。提示，參芪扶正湯可明顯提高SPID小鼠上生殖道組織中抗炎因子的表達水平，明顯降低促炎因子的表達水平。見表2，圖1。

表2 參芪扶正湯對SPID小鼠上生殖道炎癥因子蛋白表達水平的影響

注：1：正常組；2：模型組；3：阿司匹林組；4：參芪扶正湯灌胃組；5：參芪扶正湯灌腸組；6：參芪扶正湯灌胃灌腸聯(lián)合組圖1 Western Blot檢測SIPD小鼠上生殖道炎癥因子蛋白表達水平

4 討論

SPID發(fā)生時，主要表現(xiàn)為繼發(fā)于細菌感染后的免疫反應及盆腔組織血運微環(huán)境障礙[10]。由于少量浸潤的炎癥細胞、異常分泌的炎性因子、趨化因子及受體等持續(xù)存在，構成SPID盆腔炎癥微環(huán)境[11]，造成繼發(fā)病變組織損傷進行性加重，表現(xiàn)為瘢痕、增生、粘連等，最終形成“冰凍”盆腔，導致異位妊娠、不孕、慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)、SPID的急性發(fā)作或亞急性發(fā)作等并發(fā)癥的出現(xiàn)。病理觀察顯示，除淋巴細胞浸潤外，可見大量巨噬細胞浸潤，且吞噬活性明顯增加，激活繼細菌感染后的免疫反應，從而引發(fā)SPID亞急性或急性發(fā)作[12]。研究表明，炎癥因子在慢性炎癥反應過程中扮演著雙重作用，促炎因子可促進炎癥反應的發(fā)生發(fā)展，而抗炎因子則可抑制炎癥反應的過度激活。抗炎因子和促炎因子的協(xié)調(diào)平衡，決定了機體炎癥反應的表現(xiàn)和轉歸[13]。

當機體受到外界炎癥入侵時，促炎因子分泌增多，激發(fā)機體自我保護的防御機制，促使抗炎因子分泌增多，抵抗體內(nèi)促炎因子對機體的損傷，使機體內(nèi)促炎與抗炎平衡，維持免疫穩(wěn)態(tài)。但外界刺激的持續(xù)進行，機體促炎因子水平持續(xù)升高，導致過度的炎癥反應，對細胞本身的功能產(chǎn)生不利影響[14]。盆腔炎性疾病后遺癥屬于促炎因子與抗炎因子失衡引起的一系列機體不良反應。研究證實，中藥可以通過干預機體免疫反應調(diào)整炎癥因子水平[15]，促使機體抗炎因子與促炎因子的平衡，從而抑制炎癥反應，達到治愈疾病的效果。中藥灌腸能夠有效降低慢性盆腔炎患者TNF-α等促炎因子水平，提高 IL-10 等抗炎因子水平，顯著改善炎性因子水平[16]。臨床診療中，與SPID相關的炎癥指標較多，其中關系密切的抗炎因子有IL-4、IL-10，促炎因子有IL-8、TNF-α等[17]。IL-8、TNF-α可通過促進中性粒細胞及漿細胞的趨化和血管損傷，進而導致結締組織炎癥性損傷；還可通過趨化作用促使中性粒細胞、漿細胞等向炎癥部位聚集，促進炎性反應的發(fā)生發(fā)展[18]。IL-4、IL-10可抑制中性粒細胞的趨化作用，降低促炎因子IL-8等的表達，減輕組織損傷程度，抑制炎癥發(fā)展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠上生殖道IL-10、IL-8、TNF-α的蛋白表達水平顯著升高，表明炎癥反應初期，機體的自我防御機制激活，抗炎因子與促炎因子分泌均增多，促使機體免疫平衡；與模型組比較，各給藥組 IL-4、IL-10的蛋白表達水平升高，促炎因子 IL-8、TNF-α表達水平顯著降低，提示，參芪扶正湯可顯著改善小鼠體內(nèi)炎癥因子水平。

SPID的病程較長、反復發(fā)作，單純的活血化瘀療法無法從根本上解決問題。在金哲教授自創(chuàng)方“丹枝飲”基礎上，添加益氣扶正中藥，組成參芪扶正湯。其中黃芪、黨參、白術等益氣扶正中藥，效仿清代醫(yī)家張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》理沖湯，發(fā)揮健脾益氣、扶正培元的功效，更好地扶正驅邪治療SPID[20]。黃芪健補中氣，黨參平補脾氣以生氣血，白術燥濕益氣健脾，三藥共為君藥，奏“正氣存內(nèi)，邪不可干”之效?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可以調(diào)節(jié)巨噬細胞核轉錄因子，抑制促炎因子的產(chǎn)生，發(fā)揮體內(nèi)和體外免疫調(diào)節(jié)作用及抗炎作用[21]；白術不僅具有提高細胞免疫功能的作用，還具有抗菌、抗凝血等藥物作用[22-23]；黨參具有增強機體免疫功能的作用[24]，三者合用可以很好地發(fā)揮益氣扶正作用。丹參可活血祛瘀止痛，丹參中的丹參酮能擴張外周血管，降低血液黏度，抑制血小板聚集，改善血液循環(huán)，且對金黃色葡萄球菌、鉤端螺旋體等有明顯的抑制作用[25]；當歸活血止痛，走而不守，又入血分，有明顯抗血栓作用[26]；桑枝可祛風濕、利關節(jié)，具有抗炎鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)作用[27]，三者共為臣藥，發(fā)揮活血散結消癥的功效，從而改善盆腔血瘀狀態(tài)。延胡索、雞血藤、赤芍具有活血行氣、通絡止痛的功效。研究表明，活血化瘀類中藥不僅能夠改變血液流變性，改善微循環(huán)，還可促進組織修復和再生[28-30]。雞血藤總黃酮為雞血藤的主要成分，具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抗氧化等作用[31]。諸藥合用，共奏補益正氣、養(yǎng)血化瘀、通絡止痛之功效。

SPID為一組感染性疾病，是育齡婦女最常見的生殖器官炎性反應[32]。中醫(yī)藥尤其是中藥灌腸療法在治療SPID中應用廣泛，且行之有效[33-34]。因此，本研究設置灌腸組旨在評價灌胃、灌腸以及兩者聯(lián)合的療效及差異比較。結果顯示，藥物干預后，小鼠上生殖道組織中抗炎因子IL-4、IL-10的蛋白表達水平顯著升高，促炎因子IL-8、TNF-α的蛋白表達水平顯著降低，MGS評分顯著降低；三個組別之間比較，雖無統(tǒng)計學差異，但灌胃灌腸聯(lián)合治療的作用趨勢更為顯著。

綜上所述，參芪扶正湯可通過扶正益氣聯(lián)合祛瘀通絡達到抗炎鎮(zhèn)痛、提高機體免疫力、改善機體炎癥因子水平而治療SPID的作用。