龍葵銀消浸膏灌胃給藥BALB/c小鼠14天的毒性評價*

朱聰聰，潘會君，喻 琴，連天雁，朱全剛，沈 敏

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443）

銀屑病，中國古籍常稱為“白疕”“白癬”等，臨床用藥常以清熱涼血解毒為主[1-2]。龍葵銀消片（滬藥制字Z05020300）是我院的特色中藥制劑，由龍葵、鳳尾草、紫草、白芷、山藥5味中藥組成，具有清熱解毒、涼血祛風(fēng)、匡扶正氣的功效，臨床用于治療尋常型銀屑病具有良好療效[3-4]，但尚未對該制劑進行安全性評價。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，君藥龍葵含有的龍葵素，過度攝入輕者會出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、瞳孔放大等，重者可喪失知覺、休克，搶救不及時會導(dǎo)致死亡[5]；龍葵堿具有胚胎毒性，并有致畸、致突變作用[6]。為了探究該制劑可能的潛在毒性，本研究開展龍葵銀消浸膏連續(xù)灌胃給藥BALB/c小鼠14 d的潛在毒性研究，從而為臨床用藥提供參考。

1 材 料

1.1 藥物 龍葵（批號：190802）、鳳尾草（批號：190704）、白芷（批號：190823）、山藥（批號：190903）（上海虹橋中藥飲片有限公司）；紫草（上海蔡同德堂中藥飲片有限公司，批號：19090202），經(jīng)上海市皮膚病醫(yī)院主任藥師朱全剛鑒定，龍葵藥材為茄科植物龍葵Solanum nigrum L.的全草；鳳尾草藥材為鳳尾蕨科植物鳳尾草Pteris multifida Poir.的全草；紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst.的干燥根；白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.的干燥根；山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb的干燥根莖。

1.2 試劑 生理鹽水（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：20190 42203）；10%福爾馬林中性組織固定液（南昌雨露實驗器材有限公司，批號：190908）；無水乙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：20200319）；鹽酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：20151105）；氨水（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：20161123）；中性樹膠（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司）；蘇木素-伊紅染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器JS6-01型大稱量電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；ZNHW型電熱套（上海予申儀器有限公司）；OSB-2100型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；載玻片（武漢賽維爾生物科技有限公司）；蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；JB-P5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JB-L5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）。

1.4 實驗動物6～8周齡SPF級BALB/c小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004。小鼠分籠飼養(yǎng)于動物房，5只/籠，自由攝食與飲水，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%。本實驗經(jīng)同濟大學(xué)機構(gòu)倫理委員會批準(zhǔn)，并按照機構(gòu)指南進行。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 稱取各中藥材飲片并置10倍溫水中浸泡30 min，第一次煎煮2 h，第二次8倍水煎煮1 h。合并濾液，低溫靜置過夜。取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮，將黏稠濃縮液放至-80℃預(yù)凍3～4 h，隨后利用真空冷凍干燥機進行干燥并打粉，形成龍葵銀消干浸膏粉。

2.2 劑量設(shè)計 參考藥物重復(fù)給藥毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則[7]，采用最大給藥量進行灌胃給藥。折算成每只小鼠一天給予量最多為0.375 g干浸膏粉，相當(dāng)于375倍成人臨床劑量。

2.3 動物分組及給藥 按參考文獻中方法[8-9]，將20只小鼠按體質(zhì)量隨機分為空白組和給藥組，雌雄各半，每組10只。取龍葵銀消干浸膏粉0.3 g，用0.4 mL純水溶解，得含干浸膏粉濃度為0.75 g/mL的龍葵銀消浸膏。給藥組每天給予龍葵銀消浸膏0.5 mL，空白組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 體質(zhì)量 每日記錄小鼠體質(zhì)量，觀察各組體質(zhì)量增長情況。

2.4.2 AST、ALT、BUN、CREA、UA血液生化學(xué)檢測 末次給藥后，利用摘眼球取血法采血，離心取血清，檢測血清肝腎功能生化指標(biāo)，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。腎臟功能指標(biāo)包括血尿素氮（BUN）、血肌酐（CREA）、尿酸（UA）。

2.4.3 臟器系數(shù) 末次給藥后對小鼠進行麻醉、解剖，取肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟組織進行稱量臟器質(zhì)量，計算各臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100。

2.4.4 病理組織學(xué)檢查 將小鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟組織用4%多聚甲醛固定24 h以上，進行石蠟包埋切片，片厚4 μm，進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（s）表示，對各組進行正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗，采用單因素方差分析。重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，數(shù)據(jù)經(jīng)Mauchly球?qū)ΨQ檢驗，若P＞0.05，則認(rèn)為該數(shù)據(jù)滿足球?qū)ΨQ假設(shè)；反之則不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)，則用Greenhouse-Geisser法對組內(nèi)效應(yīng)的F界值進行校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兩組小鼠不同時間點體質(zhì)量比較 給藥前后不同時間小鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.656，P＜0.001），即存在時間效應(yīng)，兩組均如此，說明空白組和給藥組小鼠的體質(zhì)量均隨時間的推移而發(fā)生明顯變化。兩組小鼠體質(zhì)量總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.610，P＜0.001），即存在分組效應(yīng)，說明不同組別對小鼠體質(zhì)量變化具有顯著性影響。第0、4天給藥組小鼠的體質(zhì)量低于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第8、12、14天給藥組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白組（P＜0.05）。時間和組別不存在交互效應(yīng)（F=3.281，P=0.068＞0.05），說明不同組別的小鼠體質(zhì)量雖然隨著時間的推移而發(fā)生變化，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（見圖1、表1）

表1 兩組小鼠在不同時間點的體質(zhì)量比較

表1 兩組小鼠在不同時間點的體質(zhì)量比較

注：F分組主效應(yīng)=36.610，P分組主效應(yīng)＜0.001；F時間主效應(yīng)=7.656，P時間主效應(yīng)＜0.001；F交互效應(yīng)=3.281，P交互效應(yīng)=0.068；與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 0 d 4 d 8 d 12 d 14 d F P空白組 10 21.76±0.67 20.16±0.86 21.05±0.98 22.36±1.49 22.13±1.50 5.577 0.001給藥組 10 21.45±1.32 19.05±1.55 19.73±1.26a 20.55±1.53a 19.00±1.39a 5.505 0.019 t 0.662 1.980 2.621 2.670 4.872 P 0.517 0.063 0.017 0.016 0.000

圖1 交互效應(yīng)輪廓圖

3.2 兩組小鼠血清肝腎功能生化指標(biāo)比較 給藥組小鼠血清CREA水平低于空白組（P＜0.05），血清BUN、UA、AST、ALT水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 兩組小鼠血清肝腎功能生化指標(biāo)比較

表2 兩組小鼠血清肝腎功能生化指標(biāo)比較

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 ALT（U/L）AST（U/L）BUN（mg/dl）CREA（umol/L）UA（umol/L）空白組106.5±15.1 145.9±28.2 24.2±2.1 78.0±7.1 181.5±48.4給藥組126.0±34.0 177.3±33.6a 23.3±2.7 66.3±14.0a 170.4±28.6 t -0.630 -1.352 0.523 2.176 0.550 P 0.536 0.192 0.607 0.042 0.589

3.3 兩組小鼠臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)比較 給藥組小鼠脾臟質(zhì)量及脾臟系數(shù)低于空白組（P＜0.05），心臟、肺臟、肝臟、腎臟質(zhì)量及臟器系數(shù)與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3～4）

表3 兩組小鼠臟器質(zhì)量比較

表3 兩組小鼠臟器質(zhì)量比較

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 心臟質(zhì)量 肝臟質(zhì)量 脾臟質(zhì)量 肺臟質(zhì)量 腎臟質(zhì)量空白組 10 0.14±0.02 0.93±0.10 0.09±0.01 0.17±0.02 0.35±0.05給藥組 10 0.14±0.02 0.91±0.32 0.08±0.01a 0.17±0.02 0.33±0.04 t-0.953 -0.335 -2.905 0.238 -1.369 P 0.353 0.741 0.010 0.815 0.188

表4 兩組小鼠臟器系數(shù)比較

表4 兩組小鼠臟器系數(shù)比較

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）心臟系數(shù) 肝臟系數(shù) 脾臟系數(shù) 肺臟系數(shù) 腎臟系數(shù)空白組 10 0.65±0.07 4.22±0.34 0.41±0.04 0.77±0.09 1.58±0.19給藥組 10 0.68±0.09 4.58±1.54 0.39±0.06a 0.86±0.13 1.64±0.19 t 0.872 0.492 -8.579 2.082 0.596 P 0.395 0.629 0.000 0.052 0.558

3.4 病理學(xué)檢查結(jié)果 病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)龍葵銀消浸膏連續(xù)給藥14 d后，給藥組心臟組織染色均勻，心肌纖維排列整齊，脾臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，肺組織細(xì)支氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常，與空白組比較，未顯示出明顯的心臟、脾臟、肺臟毒性。但是對肝臟、腎臟病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組肝臟、腎臟局部出現(xiàn)病理組織學(xué)改變，主要表現(xiàn)為肝臟存在炎癥細(xì)胞浸潤，腎臟存在輕微腎間質(zhì)輕微淤血等現(xiàn)象（箭頭所示）。（見圖2）

圖2 兩組小鼠各臟器組織病理切片圖（HE,×200）

4 討 論

毒性試驗是評價藥物安全性的重要環(huán)節(jié)。本研究采用BALB/c小鼠，連續(xù)14 d灌胃給予龍葵銀消浸膏，考察了小鼠對龍葵銀消浸膏的毒性反應(yīng)。第0、4天給藥組小鼠的體質(zhì)量低于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第8、12、14天給藥組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白組（P＜0.05）。對臟器系數(shù)考察中發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠脾臟質(zhì)量、脾臟系數(shù)低于空白組（P＜0.05）。對各臟器進行組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟出現(xiàn)病理組織學(xué)改變，肝臟局部有炎癥反應(yīng)，腎臟則表現(xiàn)為腎間質(zhì)輕微淤血。為了進一步探究龍葵銀消浸膏對小鼠肝腎功能的影響，筆者對小鼠血清進行了肝腎功能生化學(xué)檢測。AST、ALT是臨床常見的肝功能檢查指標(biāo)，結(jié)果顯示給藥組小鼠血清CREA水平低于空白組（P＜0.05），血清AST、ALT BUN、UA水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

肝臟、腎臟是藥物排泄的主要器官，發(fā)生毒性反應(yīng)的概率要大于其他臟器。因此藥物毒性研究中比較重視肝腎的毒性研究[10]。目前國內(nèi)外關(guān)于龍葵和紫草不良反應(yīng)尤其是肝腎損傷的報道日益增多。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿是龍葵的有效成分，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理作用[11-12]。有研究顯示，龍葵堿具有肝毒性，與影響肝臟中CYP450基因表達有關(guān)[13]。新紫草作為方中臣藥，具有清熱涼血、解毒透疹的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明紫草具有抗炎、抗腫瘤作用，臨床常用來治療銀屑病[14]。但紫草含有的吡咯里西啶生物堿具有肝毒性，口服能引起大鼠尿中?；撬帷⒀趸装芳岸谆拾彼岷康某掷m(xù)增高[15-17]。另外，紫草有效成分紫草素、乙酰紫草素等萘醌色素類及提取物均顯示毒性[18-20]。由于君藥臣藥均含有肝腎毒性成分，可能是導(dǎo)致肝臟及腎臟病理變化的原因。因此本研究提示臨床使用過程中勿過量服用，長期服用時應(yīng)注意藥物對肝臟、腎臟可能存在的潛在影響。由于本研究針對龍葵銀消浸膏對小鼠毒性只基于病理學(xué)及血液生化學(xué)研究，該藥物的肝腎損傷仍需進一步深入機理研究。