大孔樹脂富集天麻酚類成分的工藝研究*

瞿曉梅，李紫嫣，劉 芳，趙 婷，劉玉璇，國大亮

（天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

天麻為蘭科天麻屬植物天麻Gastrodia elata Bl.的根莖，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效[1]，是名貴中藥材。研究發(fā)現(xiàn)，天麻酚類化合物是天麻已知化學成分中總占比最多的成分類群，占天麻已知物質的52%，包括31%的酚類化合物和21%的檸檬酸酯類[2]。天麻素、4-羥基苯甲醇、香草醇、香草醛和巴利森苷等為研究較深入的藥效成分。這些酚類活性成分可改善學習記憶力，可能與調節(jié)多種神經遞質、細胞生長因子及相關受體功能的表達有關[3-10]，對阿爾茲海默病[11-12]、帕金森病[13-15]等中樞神經系統(tǒng)疾病有潛在治療作用。

通過檢索天麻純化相關文獻，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有研究多集中于天麻多糖[16-18]、天麻復方[19-20]或天麻素單體[21-22]的純化工藝，對天麻酚類這一主要活性組分的純化鮮有研究。本實驗擬通過大孔樹脂純化富集天麻酚類成分，以天麻總酚、天麻素（gastrotin，GAS）和4-羥基苯甲醇（4-hydroxybenzenyl alcohol，HBA）三者為綜合考察指標，篩選對天麻酚類成分吸附、解吸性能較好的大孔樹脂型號，在此基礎上優(yōu)選出最佳純化條件，為天麻酚類成分的開發(fā)、利用提供基礎。

1 材料與儀器

1.1 試藥 天麻由河北大中藥業(yè)有限公司提供，經天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院劉玉璇教授鑒定為四川冬天麻。

1.2 試劑 沒食子酸對照品（批號：110831-201906，純度：≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；天麻素對照品（批號：CFN99549，純度：≥98%）、4-羥基苯甲醇對照品（批號：CFN97071，純度：≥98%）（ChemFaces公司）；福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）；乙腈（色譜純，Sigma-Aldrich公司）；大孔吸附樹脂HPD100、ADS-17、AB-8、D301、X-5（北京索萊寶科技有限公司），具體參數(shù)見表1；無水碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純。

表1 不同型號大孔樹脂的相關性質

1.3 主要儀器HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；UV-2540型紫外分光光度計（日本島津）；LC2000高效液相色譜儀（上海天普分析儀器有限公司）；SQP電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；HY-2型調速多用振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

2 方 法

2.1 天麻酚類成分的提取 將天麻粉碎過60目篩得天麻粉末。精密稱定一定量天麻粉，置于具塞三角瓶中，加入10倍量59%乙醇，在54℃的水浴鍋內熱浸提取89 min，過濾得天麻酚類成分提取液。將提取液置于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至無乙醇旋出，得濃縮液。將濃縮液置于容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即得供試品溶液。

2.2 含量測定方法

2.2.1 天麻總酚的含量測定 采用福林酚比色法檢測天麻總酚的含量。福林酚試劑中的鎢鉬酸可將酚類化合物定量氧化，自身還原成藍色化合物，藍色的深淺程度與含酚基團的數(shù)目成正比。沒食子酸由于性質穩(wěn)定，有3個酚羥基，常作為評估化合物中酚類含量的參照物。分別移取沒食子酸對照品供試品溶液0.4 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，加福林酚試劑0.6 mL，混勻，加20%碳酸鈉溶液1.0 mL，用水稀釋至10 mL，搖勻后于40℃水浴加熱至40 min，取出，放置10 min待溶液恢復至室溫，于765nm下檢測溶液吸光度。

2.2.2 天麻素和4-羥基苯甲醇的含量測定 色譜柱為Diamonsil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為220 nm；進樣量為20 μL。

2.3 天麻酚類純化工藝考察

2.3.1 大孔樹脂的預處理 將不同型號大孔樹脂分別用95%乙醇浸泡24 h，使樹脂充分溶脹。用95%乙醇淋洗至流出液與水混合（1∶3）不呈白色混濁為止，然后以大量蒸餾水洗至無醇味。以5%HCl浸泡4 h，濾過，用蒸餾水洗至中性；再以5%NaOH浸泡4 h，濾過，用蒸餾水洗至中性，備用。

2.3.2 大孔樹脂型號的篩選 選擇HPD100、ADS-17、AB-8、D301、X-5 5種大孔樹脂，以天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的吸附率和解吸率為指標，采用靜態(tài)吸附實驗篩選最優(yōu)大孔樹脂類型。

分別精密稱取5種大孔樹脂HPD100、ADS-17、AB-8、D301、X-5各2 g分別裝于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入供試品溶液20 mL，于25℃下100 r/min振蕩24 h，使樹脂充分吸附后濾過；測定上清液中剩余天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量，計算5種型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附量和靜態(tài)吸附率。

C0：吸附前天麻總酚質量濃度；C：吸附平衡后天麻總酚質量濃度；V：上樣溶液體積；m：樹脂質量

將上述吸附飽和的樹脂取出，用蒸餾水沖洗去表面殘留的液體，用濾紙吸干樹脂表面的液體，置于干燥的具塞錐形瓶中，加70%乙醇30 mL，于25℃下以100 r/min振蕩24 h使其充分解吸，解吸液濾過；測定洗脫液中天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量，計算5種型號大孔樹脂的靜態(tài)解吸率。

CV：洗脫液中天麻總酚質量濃度；V2：洗脫液體積；C0：吸附前天麻總酚質量濃度；C：吸附平衡后天麻總酚質量濃度；V：上樣溶液體積

通過比較5種型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能進行篩選。

2.3.3 上樣條件考察

2.3.3.1 上樣液pH值考察 精密稱取5份處理好的HPD100樹脂2 g，分別置于150 mL具塞錐形瓶中。各取5份15 mL的樣品溶液（0.15 g生藥/mL），用稀磷酸和碳酸鈉溶液調節(jié)pH值至3、4、5、6、7，倒入錐形瓶內，于25℃下100 r/min振蕩24 h，使樹脂充分吸附后濾過，測定吸附前后樣品中剩余天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量，比較5種pH值下大孔樹脂吸附天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的吸附率。

2.3.3.2 上樣液濃度考察 精密稱取5份處理好的HPD100樹脂2 g，分別置于150 mL具塞錐形瓶中，分別加入15 mL不同質量濃度的樣品（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g生藥/mL），于25℃下100 r/min振蕩24 h，使樹脂充分吸附后濾過，測定吸附前后樣品中剩余天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量，比較5種質量濃度下大孔樹脂吸附天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的吸附率。

2.3.3.3 上樣液流速考察 取處理好的HPD100大孔樹脂100g，濕法裝入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（裝柱高度20 cm），另取0.15 g生藥/mL的供試品溶液100 mL，以不同流速0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 BV/h上樣，收集流出液，測定流出液中天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的濃度，計算動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率。2.3.3.4上樣量考察 取預處理后的大孔樹脂100 g濕法裝入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（裝柱高度20 cm），取0.15 g生藥/mL的供試品溶液300 mL，以1.5 BV/h流速上樣，分段收集流出液，每份10 mL，收集30份，測定每份中天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的濃度，繪制泄露曲線，確定上樣量。

2.3.4 洗脫條件考察

2.3.4.1 洗脫劑體積分數(shù)考察 精密稱取5份處理好的HPD100樹脂2 g，分別置于150 mL具塞錐形瓶中，分別加入15 mL 0.15 g生藥/mL的樣品，于25℃下100 r/min振蕩24 h，使樹脂充分吸附后濾過，測定吸附后樣品中剩余天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量。使用蒸餾水將充分吸附飽和的大孔樹脂清洗至表面無殘留，加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液（10%、30%、50%、70%、90%）15 mL，于25℃下100 r/min振蕩24 h，測定解吸附后樣品中剩余天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量，比較不同體積分數(shù)洗脫劑下大孔樹脂解吸天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的解吸率。

2.3.4.2 洗脫流速考察 精密稱取5份處理好的HPD100大孔樹脂各100 g，濕法裝入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（裝柱高度20 cm）。100 mL 0.15 g生藥/mL供試品溶液，以1.5 BV/h進行動態(tài)吸附，吸附完全后，用200 mL水沖洗，測定吸附量，再用300mL 30%乙醇分別以1、2、3、4、5BV/h進行解吸，計算解吸率。

2.3.4.3 洗脫劑用量考察 精密稱取處理好的HPD100大孔樹脂100g，濕法裝入3.0cm×25cm的玻璃柱中（裝柱高度20 cm）。100 mL 0.15 g生藥/mL供試品溶液，以1.5BV/h進行動態(tài)吸附，吸附完全后，先用200mL水沖洗，測定吸附量，再以30%乙醇500mL、3 BV/h的流速進行洗脫，每10 mL流出液收集一管，測定洗脫液中各管天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量。以管數(shù)為橫坐標，天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量為縱坐標繪制洗脫曲線。

2.3.5 最佳工藝條件驗證 精密稱取處理好的HPD100大孔樹脂100g，濕法裝入3.0cm×25cm的玻璃柱中（裝柱高度20 cm），按照得到的最佳純化工藝進行洗脫，測定純化液中天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇的含量。

3 結果與分析

3.1 含量測定方法

3.1.1 天麻總酚的含量測定 精密量取沒食子酸對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL按照上述方法顯色后，以吸光度值（y）為橫坐標，質量濃度（x）為縱坐標繪制標準曲線。得標準曲線方程為y=0.099 2x+0.021 5，R2=0.998 4，表明沒食子酸在0～12.216 μg/mL范圍內線性關系良好，可定量表征天麻總酚含量。（見圖1）

圖1 沒食子酸對照品標準曲線

3.1.2 天麻素和4-羥基苯甲醇的含量測定 天麻素標準曲線方程為y=4 515.4x+19 887，R2=0.999 0；4-羥基苯甲醇標準曲線方程為y=9 730.7x+7 205.8，R2=0.999 7，表明天麻素和4-羥基苯甲醇在20.2～141.4 μg/mL、4.044～28.308 μg/mL范圍內線性關系良好。（見圖2）

圖2 天麻素與4-羥基苯甲醇對照品標準曲線

圖4 5種大孔樹脂的靜態(tài)解吸率

3.2 大孔樹脂型號的篩選 靜態(tài)吸附實驗結果表明，AB-8和HPD100對3種成分的靜態(tài)吸附量均較高；D301對天麻總酚的吸附量遠高于其余4種樹脂，可能由于其吸附色素能力較強，導致吸附后上清液的顏色較淺，影響比色法檢測的準確度。由于HPD100對3種成分的解吸能力優(yōu)于AB-8，故選定HPD100型大孔樹脂。（見圖3～4）

圖3 5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附量

3.3 上樣條件考察 實驗結果表明，不同pH值的上樣液對HPD100吸附能力的影響不規(guī)律，因此選擇提取液原液上樣（pH=5）；隨著上樣液濃度增加，靜態(tài)吸附率先降低后趨于不變，說明上樣液濃度大于0.15 g/mL后，增加上樣液濃度，HPD100對3種成分的吸附百分比基本相同。綜合考慮，0.15 g/mL的上樣液既能達到較大吸附量又不會造成藥材的浪費，因此選擇0.15 g/mL為最佳上樣濃度。（見圖5～6）

圖5 上樣液pH對吸附率的影響

圖6 上樣液濃度對吸附率的影響

由動態(tài)吸附實驗可知，上樣流速大于1.5 BV/h時，流出液中酚類成分的含量明顯增加，可能由于流速過快，部分酚類成分未被吸附就流出樹脂柱。由多酚泄露曲線可知，當上樣量小于100 mL時，天麻酚類成分的泄露量極少；上樣量超過100 mL時，流出液中酚類成分的泄露量明顯升高，超過190 mL后上樣量與泄露量達到動態(tài)平衡，此時大孔樹脂吸附飽和。為避免藥材浪費，選擇上樣流速為1.5 BV/h，上樣量為100 mL。（見圖7～8）

圖7 上樣流速對HPD100大孔樹脂吸附能力的影響

圖8 天麻酚類成分的泄露曲線

3.4 洗脫條件考察 實驗結果表明，隨著乙醇體積分數(shù)增大，酚類成分的解吸率先升高后降低，當乙醇體積分數(shù)為30%時解吸率最高，故選擇30%乙醇為最佳洗脫劑。（見圖9）

圖9 洗脫劑體積分數(shù)對解吸率的影響

實驗結果表明，隨著洗脫流速增加，天麻總酚和4-羥基苯甲醇的解吸率差別不大，天麻素的解吸率逐漸降低。考慮到純化效率，選擇3 BV/h為最佳洗脫流速。由洗脫曲線知天麻素和4-羥基苯甲醇在洗脫劑用量為150 mL時基本洗脫完全，總酚在洗脫劑用量為300 mL時基本洗脫完全。因此選擇洗脫劑用量為300 mL。（見圖10～11）

圖10 洗脫流速對解吸率的影響

圖11 天麻酚類成分洗脫曲線

3.5 最佳工藝條件驗證HPD100型大孔樹脂富集純化天麻酚類成分的最佳條件為：100 g HPD100大孔樹脂濕法裝入3.0cm×25cm的玻璃柱中（裝柱高度20cm），用100 mL 0.15g生藥/mL提取液原液上樣，上樣流速為1.5 BV/h，洗脫劑為30%乙醇，洗脫體積為300 mL，洗脫流速為3 BV/h。

表2 驗證試驗結果

4 結 論

本研究以天麻總酚、天麻素和4-羥基苯甲醇三者的含量作為檢測指標，比較5種樹脂對天麻酚類成分的吸附、解吸性能，發(fā)現(xiàn)HPD100型大孔樹脂最適合天麻酚類的富集。通過靜態(tài)和動態(tài)吸附、解吸實驗，確定最佳工藝為：100 g HPD100大孔樹脂濕法裝入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（裝柱高度20 cm），用100mL0.15g生藥/mL提取液原液上樣，上樣流速為1.5BV/h，再以30%乙醇300 mL、3 BV/h的流速進行洗脫。在此條件下得到的天麻酚類成分純化物中天麻總酚含量為35.18 mg/g，天麻素含量為20.14 mg/g，4-羥基苯甲醇含量為4.13 mg/g。