消癌平聯(lián)合磁感應(yīng)熱療對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用*

范林林，鐘 雪，唐勁天，李利亞

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；3.清華大學(xué)工程物理系醫(yī)學(xué)物理與工程研究所醫(yī)療新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；4.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中小細(xì)胞肺癌占新發(fā)肺癌的15%[1]，且早期極易擴(kuò)散，其中60%～70%的患者在診斷時(shí)已為廣泛期疾?。‥S-SCLC）[2]。數(shù)十年來(lái)其治療無(wú)顯著進(jìn)展，免疫治療的發(fā)展為小細(xì)胞肺癌的治療帶來(lái)希望，但是生物標(biāo)志物不明確等問(wèn)題仍然存在[3]，因此探索新的治療方法尤為必要。

隨著磁感應(yīng)熱療在腫瘤研究領(lǐng)域的深入，其在聯(lián)合化療及中藥方面已展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。中藥消癌平的主要成分是通關(guān)藤，目前研究顯示其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、細(xì)胞毒作用、免疫調(diào)節(jié)和降低腫瘤細(xì)胞耐藥性等作用，對(duì)于肺癌、胃癌等多種腫瘤治療具有良好的效果[4-5]。因此本研究將從細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等方面探討消癌平聯(lián)合磁感應(yīng)熱療對(duì)于小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的作用效果，以期為小細(xì)胞肺癌的治療提供新型聯(lián)合用藥方案，并進(jìn)一步探索磁感應(yīng)熱療對(duì)于深部腫瘤治療的可能性。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株H446細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 藥物與試劑 伊立替康（輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：5 mL∶0.1 g，批號(hào)：AA9139）；細(xì)胞周期及Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，規(guī)格：100T，批號(hào)：KGA108）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gbico公司，規(guī)格：500mL，批號(hào)：C11875500BT）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司，規(guī)格：500mL，批號(hào)：SH30070.03E）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，規(guī)格：500T，批號(hào)：CK04）；胰蛋白酶（美國(guó)sigma公司，規(guī)格：100mg，批號(hào)：T2600000）。

1.3 主要儀器FACS Calibur型流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）；ZE5多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoScientific公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公）；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）。

2 方 法

2.1 磁性微球升溫性能的檢測(cè) 將40、60、80 mg的磁性微球分別放于24孔板中，加入2 mL含有20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，將HP型測(cè)溫光纖插入在板蓋正中已打好的小孔中，將24孔板置于300 kHz，40 Gs的交變磁場(chǎng)下，使用測(cè)溫軟件記錄隨加熱時(shí)間變化情況。

2.2 磁性微球浸提液制備 將微米級(jí)磁性微球使用超純水清洗3～5次直到清洗液變清澈，用75%酒精滅菌3次，再使用超純水將酒精洗凈，120℃高壓蒸汽滅菌30 min，干燥后放置超凈臺(tái)備用，每次使用前用紫外線照射30 min。取其中一部分干燥后的無(wú)菌磁性微球，加入含20%FBS的1640培養(yǎng)液，使其質(zhì)量濃度達(dá)到40、60、80 mg/mL，密封，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h得到相應(yīng)質(zhì)量濃度的浸提液。

2.3 細(xì)胞生物相容性檢測(cè) 將細(xì)胞懸液以5×103個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，依次將質(zhì)量濃度為0、40、60、80 mg/mL的浸提液200 μL加入孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。連續(xù)3 d用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。每孔加入10 μL的CCK-8檢測(cè)液，避光孵育3 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值（OD值），細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 于37℃水浴中快速解凍H446細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，加入8 mL的1640培養(yǎng)液（含有20%的胎牛血清，100 U/mL鏈霉素、青霉素），離心去上清，加入15 mL配好的1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至55 cm2培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)箱孵育24 h后換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占培養(yǎng)皿底面積80%～90%時(shí)，PBS漂洗2次，用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）2 mL消化，消化后加入6 mL培養(yǎng)液。離心收集細(xì)胞加入新鮮的培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)目調(diào)整至需要的比例備用。

2.5 消癌平對(duì)細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將200 μL細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，依次加入0、20、40、60、80 mg/mL的消癌平注射液。培養(yǎng)24、48 h后，用CCK-8檢測(cè)法測(cè)定每組的OD值（方法同“2.3”項(xiàng)），計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

2.6 不同干預(yù)對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為6組：對(duì)照組（正常培養(yǎng)H446細(xì)胞）、磁感應(yīng)組（實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：300 kHz，40 Gs，30 min）、消癌平組（質(zhì)量濃度為36.27 mg/mL）、聯(lián)合組（磁感應(yīng)+消癌平）、無(wú)細(xì)胞加藥組、無(wú)細(xì)胞不加藥組。將H446細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×104個(gè)/mL，接種于24孔板內(nèi)，每孔1 mL，每組3個(gè)復(fù)孔。避光孵育24 h后，消癌平組、聯(lián)合組、無(wú)細(xì)胞加藥組分別換上含36.27 mg/mL消癌平的培養(yǎng)液，對(duì)照組、磁感應(yīng)組、無(wú)細(xì)胞不加藥組換上僅含胎牛血清的1640培養(yǎng)液。磁感應(yīng)熱療分別干預(yù)聯(lián)合組、磁感應(yīng)組，30 min/次。24 h后CCK-8工作液以50 μL/孔加入24孔板內(nèi)，避光孵育3 h后檢測(cè)OD值（方法同“2.3”項(xiàng)），計(jì)算每組的細(xì)胞抑制率及聯(lián)合組組合指數(shù)q值。

2.7 細(xì)胞凋亡/死亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、磁感應(yīng)組、消癌平組及聯(lián)合組。將H446細(xì)胞的濃度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，接種于24孔板內(nèi)，每孔2 mL，37℃、5%CO2的條件下避光孵育24 h后，消癌平組、聯(lián)合組分別換上含36.27 mg/mL的消癌平藥物培養(yǎng)液，對(duì)照組、磁感應(yīng)組換上僅含20%FBS的1640培養(yǎng)液。將24孔板置于磁場(chǎng)下，30 min/次，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。加入100 μL的Binding Buffer重懸H446細(xì)胞，予5 μL Annexin V-FITC及10 μL Propidium Iodide輕吹均勻，繼續(xù)加入400 μL的Binding Buffer混合均勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.8 細(xì)胞周期檢測(cè) 分組干預(yù)方法同“2.7”項(xiàng)。收集細(xì)胞后，將每0.5 mL的染色緩沖液加入10 μL碘化丙啶儲(chǔ)備液及10 μL RNaseA的PI染色液，放入4℃冰箱暫存。收集懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞（方法同“2.7”項(xiàng)），1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，用預(yù)冷的滅菌PBS洗滌2遍。加70%的預(yù)冷乙醇500 μL吹打均勻，4℃冰箱固定2 h，隨后1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入預(yù)冷的無(wú)菌PBS清洗1遍，加入配好的PI染色液500 μL重懸細(xì)胞混勻，37℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析，在5 h內(nèi)完成檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（s）表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)胞存活率檢測(cè)CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，磁性微球在0、40、60、80 mg/mL的質(zhì)量濃度下，在24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率最低值均大于90%，說(shuō)明磁性微球浸提液對(duì)H446細(xì)胞活力影響較小，H446細(xì)胞在不同質(zhì)量濃度的浸提液內(nèi)可以正常生長(zhǎng)。（見(jiàn)圖1）

圖1 磁性浸提液對(duì)H446細(xì)胞活力的影響，n=3）

3.2 磁性微球的體外升溫 不同質(zhì)量濃度磁性微球在300kHz、40 Gs磁場(chǎng)下，30 min內(nèi)的升溫情況見(jiàn)圖2，測(cè)溫光纖測(cè)得磁性微球隨時(shí)間的增長(zhǎng)而產(chǎn)熱增加。結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度樣品在磁場(chǎng)作用下具有較好的產(chǎn)熱能力，其中磁性微球在60mg/mL的質(zhì)量濃度下，30 min升溫到45℃，表明其具有良好升溫能力和溫度維持能力，符合磁感應(yīng)熱療介質(zhì)的要求。

圖2 磁性微球升溫曲線s，n=3）

3.3 消癌平對(duì)H446細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，消癌平能明顯抑制H446細(xì)胞的增殖；隨著藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，消癌平對(duì)H446細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。藥物的亞細(xì)胞毒性是指在抑制率為10%～20%時(shí)的藥物濃度，經(jīng)計(jì)算消癌平24 h的20%抑制率的質(zhì)量濃度為36.27 mg/mL，故選用36.27 mg/mL的質(zhì)量濃度作為聯(lián)合用藥濃度。（見(jiàn)表1）

表1 不同質(zhì)量濃度消癌平作用下H446細(xì)胞抑制率，n=3）

表1 不同質(zhì)量濃度消癌平作用下H446細(xì)胞抑制率，n=3）

注：與0 mg/mL比較，aP＜0.01

質(zhì)量濃度（mg/mL） 24 h(%) 48 h（%）0 0.53±0.36 0.76±0.57 20 7.75±2.04a 27.56±0.63a 40 24.80±3.97a 43.36±3.09a 60 35.98±1.89a 51.21±2.28a 80 44.66±3.02a 59.69±2.47a

3.4 不同干預(yù)措施對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制率，磁感應(yīng)組、消癌平組和聯(lián)合組H446細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），磁感應(yīng)組H446細(xì)胞增殖抑制率明顯高于消癌平組（P＜0.05），聯(lián)合組H446細(xì)胞增殖抑制率明顯高于磁感應(yīng)組和消癌平組（P＜0.05）。組合指數(shù)（q）=1.12，說(shuō)明磁感應(yīng)熱療聯(lián)合消癌平對(duì)H446細(xì)胞增殖抑制具有一定的相加作用。（見(jiàn)表2）

表2 不同干預(yù)措施干預(yù)H446細(xì)胞增殖抑制率s，n=3）

表2 不同干預(yù)措施干預(yù)H446細(xì)胞增殖抑制率s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與消癌平組比較，bP＜0.05；與磁感應(yīng)組比較，cP＜0.05

組別 24 h（%）對(duì)照組 0.53±0.36磁感應(yīng)組 26.60±1.06a b消癌平組 21.70±1.62a c聯(lián)合組 47.72±0.52a b c

3.5 不同干預(yù)措施對(duì)H446細(xì)胞凋亡/死亡的影響 磁感應(yīng)組和消癌平組H446細(xì)胞的總凋亡率均高于對(duì)照組（P＜0.05），尤其是H446細(xì)胞早期凋亡率均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明磁感應(yīng)熱療和消癌平均能增加H446細(xì)胞的凋亡；磁感應(yīng)熱療聯(lián)合消癌平作用H446細(xì)胞24 h后，聯(lián)合組總凋亡率高于消癌平組和磁感應(yīng)組（P＜0.05）。組合指數(shù)（q）=1.11，提示聯(lián)合組H446細(xì)胞凋亡率明顯增加，表明磁感應(yīng)熱療聯(lián)合消癌平誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡成相加作用。（見(jiàn)圖3、表3）

表3 各組細(xì)胞在凋亡率方面的比較s，n=3）

表3 各組細(xì)胞在凋亡率方面的比較s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與消癌平組比較，bP＜0.05；與磁感應(yīng)組比較，cP＜0.05

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圖3 不同干預(yù)措施對(duì)H446細(xì)胞凋亡/死亡的影響

3.6 不同干預(yù)措施對(duì)H446細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，消癌平組和磁感應(yīng)組G0/G1期H446細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.01），G2/M、S期細(xì)胞比例均上升（P＜0.01），說(shuō)明消癌平和磁感應(yīng)熱療能改變H446細(xì)胞的細(xì)胞周期，將H446細(xì)胞阻滯于G2/M、S期；與對(duì)照組比較，聯(lián)合組G2/M期H446細(xì)胞比例明顯上升（P＜0.01），提示聯(lián)合治療能將H446細(xì)胞阻滯于G2/M期；但細(xì)胞G2/M期所占比例與消癌平組和磁感應(yīng)組比較，S期H446細(xì)胞比例與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明磁感應(yīng)熱療聯(lián)合消癌平治療對(duì)H446細(xì)胞周期的協(xié)同阻滯作用不明顯。（見(jiàn)圖4、表4）

圖4 各組H446細(xì)胞的細(xì)胞周期比較

表4 各組H446細(xì)胞的細(xì)胞周期中各期細(xì)胞所占比例s，n=3）

表4 各組H446細(xì)胞的細(xì)胞周期中各期細(xì)胞所占比例s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別 G0/G1（%） S（%） G2/M（%）對(duì)照組 52.01±2.45 37.86±1.30 10.12±1.16消癌平組 32.79±1.01a 49.84±1.10a 17.36±0.09a磁感應(yīng)組 37.45±0.66a 43.50±0.48a 19.04±1.08a聯(lián)合組 38.55±2.36a 40.61±6.41 20.49±3.56a

4 討 論

中醫(yī)藥治療腫瘤，具有多靶點(diǎn)、療效好和毒性低的優(yōu)點(diǎn)，因此越來(lái)越受到人們的關(guān)注，且已成為腫瘤藥物研發(fā)的重要來(lái)源之一[6]。中藥消癌平的有效成分是通關(guān)藤，通關(guān)藤具有清熱、平喘、化痰的功效，可用于治療具有喘咳癥狀的疾病，如哮喘、支氣管炎、肺癌等。隨著實(shí)驗(yàn)的深入，研究者發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤中C21甾體皂苷抗腫瘤效果十分明顯，所以該藥漸漸成為抗腫瘤專(zhuān)藥[7]。臨床研究表明，消癌平聯(lián)合放療、化療和靶向治療可以改善腫瘤患者癥狀，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間，如朱麗娜等[8]認(rèn)為消癌平治療進(jìn)展期非細(xì)胞肺癌效果理想值得臨床推廣；駱許靜等[9]證實(shí)消癌平片聯(lián)合PC方案能夠改善晚期非小細(xì)胞肺癌患者的免疫功能；同時(shí)一項(xiàng)Meta分析[10]研究表明消癌平注射液能提高晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療療效，改善生活質(zhì)量，減輕不良反應(yīng)。因此，本研究選用消癌平作為干預(yù)手段，采用不同質(zhì)量濃度的消癌平注射液體外作用于H446細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著消癌平濃度的升高，H446細(xì)胞的活力降低，增殖抑制率增高，進(jìn)一步證實(shí)消癌平注射液在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞層面干預(yù)是可行的。

本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)研制開(kāi)發(fā)出第三代磁感應(yīng)治療儀，進(jìn)一步研究表明，磁感應(yīng)熱療技術(shù)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有不同程度的抑制作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)分別給予H446細(xì)胞質(zhì)量濃度為40、60、80 mg/mL的磁性微球浸提液，連續(xù)培養(yǎng)H446細(xì)胞3 d，結(jié)果表明磁性微球?qū)446細(xì)胞的活力影響較小，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)＞75%的要求。升溫曲線表明，質(zhì)量濃度為60 mg/mL磁性微球在300 kHz、40 Gs磁感應(yīng)下作用30 min，溫度可以達(dá)到45℃，其毒性小及具有良好的升溫能力，是良好的磁感應(yīng)熱療介質(zhì)。將磁感應(yīng)熱療和磁感應(yīng)熱療聯(lián)合消癌平應(yīng)用于H446細(xì)胞，從細(xì)胞增殖抑制方面可以看到磁感應(yīng)熱療和磁感應(yīng)熱療聯(lián)合消癌平都可以抑制H446細(xì)胞的增殖，并且聯(lián)合應(yīng)用明顯增加了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。其中的原因可能是與高溫誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)；也可以誘導(dǎo)H446細(xì)胞形成更成熟的細(xì)胞類(lèi)型，從而抑制其自我更新能力，使腫瘤細(xì)胞對(duì)包括中藥在內(nèi)的輔助治療更加敏感[13]。王國(guó)卿等[14]研究發(fā)現(xiàn)人肺癌A549細(xì)胞接受磁流體熱療后細(xì)胞呈凋亡樣改變，高溫時(shí)呈壞死樣改變；胡潤(rùn)磊等[15]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)小鼠肺癌A549細(xì)胞在交變磁場(chǎng)作用下生長(zhǎng)受到抑制。

細(xì)胞凋亡，又稱(chēng)程序性死亡，是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)性死亡過(guò)程[16]。其主要有內(nèi)源性和外源性凋亡兩種途徑，均參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡為抗腫瘤治療的機(jī)制之一，目前促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物研發(fā)也成為研究的熱點(diǎn)[17]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了消癌平組、磁感應(yīng)組和聯(lián)合組H446細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡明顯增加。調(diào)控細(xì)胞周期是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式之一，不同措施將細(xì)胞阻滯于不同周期，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常分裂而凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磁感應(yīng)組和消癌平組能將H446細(xì)胞阻斷在G2/M和S期，聯(lián)合組能將其阻斷在G2/M期，說(shuō)明H446細(xì)胞G2/M期對(duì)于3種干預(yù)措施均比較敏感，而聯(lián)合治療阻滯周期效果較單獨(dú)治療并不明顯，結(jié)果表明調(diào)控細(xì)胞周期可能不是消癌平聯(lián)合磁感應(yīng)熱療促腫瘤凋亡的作用機(jī)制。其作用機(jī)制可能涉及信號(hào)通路和細(xì)胞因子，其中通路主要有Akt通路、Notch通路和Wnt通路，涉及的細(xì)胞因子主要有Puma、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白等，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證[18-20]。

綜上，消癌平聯(lián)合磁感應(yīng)熱療能明顯增加對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)其凋亡，但在周期阻滯未見(jiàn)明顯相加作用。