丹參多酚酸鹽對急性肺栓塞大鼠肺損傷的保護(hù)作用及肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響*

曾 光，胡俊晟，黃 榮，黃 毅，金永志，李夢帆

（上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院，上海 200062）

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是機體凝血-纖溶平衡失調(diào)導(dǎo)致血栓形成并堵塞肺動脈主干或分支引起的嚴(yán)重呼吸循環(huán)障礙的病理生理綜合征[1]，該病具有較高的發(fā)病率與致死率，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。有研究指出APE發(fā)生時，血栓會對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成機械性損傷并誘發(fā)炎癥反應(yīng)[2]。炎癥反應(yīng)發(fā)生時，靜息狀態(tài)的核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）被激活并參與調(diào)控多種病理及生理過程。CX3CL1是CX3C的家族成員，CX3CR1是它的特應(yīng)性受體，APE發(fā)生時其能加速炎癥因子滲出從而擴大炎癥反應(yīng)[3]。當(dāng)前，APE的臨床治療以抗凝治療為主。丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的具有行血通脈、活血化瘀之效的制劑，其主要成分是丹乙酸鎂，具有抗血小板聚集的效果[4]。本次研究通過設(shè)計APE大鼠模型，觀察丹參多酚酸鹽對APE大鼠肺損傷的保護(hù)作用，并分析其對大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3個月齡SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：0001507。在室溫22～24℃，相對濕度45%～55%環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，期間自由進(jìn)食飲水，12 h交替光照，處理方法遵守動物倫理原則，倫理審核編號：20181030c0241114[280]。

1.2 藥物與試劑 丹參多酚酸鹽（上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050246，批號：190827）；免疫組化試劑（香港Abcam，批號：146897）；SP免疫組化染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：mx154026）；蛋白印跡相關(guān)試劑（美國Beyotime Biotechnology，批號：A44585）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：JKSJ-1857）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒[貨號：JK-(a)-1438]、白細(xì)胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒[貨號：JK-(a)-1002]（上海晶抗生物工程有限公司）。

1.3 主要儀器RM2235型石蠟切片機（Leica公司）；HZQF160型電恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；NP-B型生物組織包埋機（Leica公司）；Universal HoodⅢ型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.4 造模與分組 采用隨機數(shù)字表法將60只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、丹參多酚酸鹽組，每組15只。模型組與丹參多酚酸鹽組大鼠采用自體血栓法復(fù)制APE大鼠模型[5]，造模前4 h，采集大鼠0.2 mL自體眼眶靜脈血置于無菌試管中，凝固4 h后將其分割成2 mm2血栓與0.5 mL生理鹽水混合制備成血栓混懸液（15～20個血栓）。采用水合氯醛將大鼠麻醉，自大鼠右頸總靜脈快速注入血栓混懸液。正常對照組大鼠不接受任何干預(yù)措施，假手術(shù)組則自大鼠右頸總靜脈注入0.5 mL生理鹽水。大鼠出現(xiàn)呼吸加深加快、發(fā)紺等癥狀表示建模成功。

1.5 實驗給藥 造模前1天與造模前40 min對各組大鼠進(jìn)行藥物灌胃，參照人與動物等效劑量換算，丹參多酚酸鹽組按照10 mg/kg劑量灌胃丹參多酚酸鹽（濃度為10 mg/mL）2 mL，其余各組大鼠采用等量生理鹽水灌胃，1次/d。實驗期間各組大鼠均自由進(jìn)食飲水。毒理試驗表明[6]，320 mg/kg劑量可引起B(yǎng)eagle犬注射部位血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞含棕黃色藥樣物，本次研究使用劑量在安全范圍內(nèi)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 HE法觀察各組大鼠肺組織病理變化情況 取出肺組織，采用10%甲醛固定石蠟包埋制備成4 μm的切片在65℃恒溫箱中6～12 h，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色鏡檢，觀察各組大鼠肺組織病理變化情況。

1.6.2 ELISA檢測大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平 栓塞4 h、72 h后，分別從各組隨機取6只大鼠，水合氯醛麻醉后采用頸部脫臼法處死大鼠，采集各組大鼠血液樣本，3000r/min離心15min，取上清液，采用ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行各項操作。

1.6.3 免疫組化法檢測大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)情況 石蠟切片脫蠟至水，加入3% H2O2在37℃條件下孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。采用蒸餾水清洗切片并在PBS中浸泡5 min×3次，將切片置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 min×3次，采用5%～10%正常山羊血清進(jìn)行封閉，室溫條件下孵育10 min，棄血清，加入一抗之后在4℃冰箱內(nèi)過夜。室溫靜置30 min，PBS沖洗5 min×3次，加入適量二抗37℃孵育30 min。沖洗5 min×3次，加入適量堿性磷酸酶或辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液PBS 37℃孵育30 min。沖洗5 min×3次，加入顯色劑顯色15 min，自來水充分沖洗后蘇木素復(fù)染，脫水、干燥、透明、封片。光學(xué)顯微鏡鏡檢，每張切片選取3個不重疊視野，每只大鼠取4張肺片進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，獲得的平均值作為大鼠CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果。

1.6.4 Western blotting法檢測大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)情況 取大鼠肺組織加入200 μL RIPA緩沖液稀釋，混勻后冰上放置40 min，4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液作為樣品。取50 μL樣品加入上樣孔，電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。TBS封閉過夜，次日TBS洗膜，加入1∶400一抗室溫孵育12 h，加入（1∶2 000）二抗室溫孵育2 h，清洗后采用凝膠成像分析軟件分析檢測電泳條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理變化情況 栓塞4 h，大鼠肺組織病理變化主要表現(xiàn)為輕中度水腫、出血，伴有肺泡壁增厚、炎癥細(xì)胞浸潤等，未發(fā)生明顯細(xì)胞壞死。正常對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，血管內(nèi)無血栓，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；假手術(shù)組大鼠與正常對照組情況相似，但肺間質(zhì)間表現(xiàn)出少量炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺組織可見凝血血栓，肺泡腫脹增厚，血管周圍出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤；丹參多酚酸鹽組大鼠肺組織血栓減少，炎癥癥狀減輕。

栓塞72 h，正常對照組大鼠肺組織與4 h時無明顯差異；假手術(shù)組大鼠出現(xiàn)輕度肺泡壁水腫；模型組大鼠肺組織病理變化主要表現(xiàn)為明顯的肺泡壁充血，伴肺氣腫，輕、中度單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有水腫液，壞死區(qū)支氣管上皮折疊與管壁分離，壞死區(qū)出血；丹參多酚酸鹽組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)與正常對照組、假手術(shù)組相似，病理變化主要表現(xiàn)為輕、中度肺泡壁水腫，伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE，×200）

2.2 各組大鼠不同時期血清炎癥因子水平比較 假手術(shù)組大鼠在各時間點血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。栓塞4 h，模型組大鼠血清TNF-α、IL-8水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；4組大鼠血清IL-1β水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；丹參多酚酸鹽組大鼠血清IL-8水平明顯低于模型組（P＜0.05）。

栓塞72h，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；丹參多酚酸鹽組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平均明顯低于模型組（P＜0.05）；模型組大鼠栓塞72 h血清TNF-α、IL-8含量明顯高于栓塞4 h（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠不同時期血清炎癥因子水平比較（x±s，ng/L）

2.3 各組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞計數(shù)比較 栓塞4 h、72 h后，假手術(shù)組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)均明顯多于正常對照組（P＜0.05）；丹參多酚酸鹽組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組（P＜0.05）。模型組大鼠栓塞72 h肺組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于栓塞4h（P＜0.05）。（見表2、圖2～3）

表2 各組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞計數(shù)比較±s，個）

表2 各組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB陽性細(xì)胞計數(shù)比較±s，個）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與栓塞4 h比較，cP＜0.05

CX3CR1 NF-κB 4 h 72 h 4 h 72 h正常對照組 6 - 11.79±4.68 10.52±3.54 15.63±4.72 15.81±4.88假手術(shù)組 6 - 10.87±4.62 11.76±5.08 18.57±5.63 15.47±4.56模型組 6 - 20.94±4.73a 20.36±5.42a 51.74±8.92a 31.97±6.85ac丹參多酚酸鹽組 6 10 13.17±4.39b 14.62±6.03b 21.74±4.92b 18.17±4.59b組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）

2.4 各組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 假手術(shù)組大鼠各時間點肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。栓塞4 h、72 h后，模型組大鼠CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；丹參多酚酸鹽組大鼠CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.05）。模型組、丹參多酚酸鹽組大鼠栓塞72 h肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯低于栓塞4 h（P＜0.05）。（圖4～5、見表3）

圖4 各組大鼠肺組織CX3CR1蛋白表達(dá)電泳圖

圖5 各組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

表3 各組大鼠肺組織CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與栓塞4 h比較，cP＜0.05

CX3CR1 NF-κB 4 h 72 h 4 h 72 h正常對照組 6 - 0.96±0.03 0.97±0.02 0.98±0.03 0.99±0.01假手術(shù)組 6 - 0.98±0.02 0.99±0.01 0.99±0.02 0.98±0.02模型組 6 - 1.74±0.08a 1.42±0.07a c 1.81±0.09a 1.47±0.08a c丹參多酚酸鹽組6 10 1.48±0.07b 1.28±0.07b c 1.39±0.07b 1.08±0.06b c組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）

圖3 各組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)情況比較（免疫組化，×100）

3 討 論

2014年歐洲心臟病學(xué)會指出[7]，APE是靜脈血栓栓塞癥最嚴(yán)重的表現(xiàn)。其主要致病機制包括血液高凝、血管內(nèi)皮損傷等[8]。王清鶴等[9]通過對比肺腺癌合并肺栓塞、單純肺腺癌、單純肺栓塞與健康志愿者發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)、NF-κB信號通路、補體反應(yīng)等均參與到疾病病理過程中。APE病理過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板間的黏附作用促進(jìn)了血栓形成，血栓形成后對肺動脈造成阻塞引起呼吸、循環(huán)功能障礙，同時產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞，不斷加重APE病理程度。CX3CL1是趨化因子CX3C家族中的唯一成員，其具有細(xì)胞黏附分子與趨化蛋白的功能，可以募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮重要作用[10]。SUKKAR M B[11]等研究指出，CX3CL1在慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等疾病中起了到趨化T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與細(xì)胞黏附分子的作用，能夠與特應(yīng)性受體CX3CR1相結(jié)合促使血管內(nèi)皮細(xì)胞與炎癥細(xì)胞相黏附，并參與血管炎的病理過程。CX3CL1和CX3CR1廣泛分布于機體各處，因此在許多慢性炎癥疾病中均可發(fā)現(xiàn)CX3CL1、CX3CR1表達(dá)水平明顯上調(diào)。此外，APE發(fā)生時會對NF-κB產(chǎn)生刺激作用，使其從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，并對APE病理生理過程的相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，釋放TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子，放大并持續(xù)炎癥反應(yīng)。由于NF-κB廣泛存在于各類細(xì)胞中，因此APE發(fā)生時其表達(dá)水平也會明顯上調(diào)。

當(dāng)前，APE的主要治療方法為抗凝溶栓治療，但西醫(yī)治療存在大出血的風(fēng)險。中醫(yī)治療肺系疾病多注重化痰活血藥物的應(yīng)用，相對于單純的西醫(yī)治療，中醫(yī)治療APE通常可以減輕患者治療過程中的藥物不良反應(yīng)。有研究指出[12-14]，清熱解毒扶正顆粒、二陳湯、止咳定喘湯等補氣化痰方均能有效抑制NF-κB活性，為APE的防治工作提供了新思路。中醫(yī)學(xué)將APE歸于“痰飲”“喘證”“胸痹”等范疇，認(rèn)為其病機在于痰濁、血瘀、氣虛，祛瘀、補氣、化痰是APE的主要治療原則[15]。丹參具有通脈、活血、化瘀的功效，丹參多酚酸鹽從是丹參中提取的有效成分。有研究[16-17]表明丹參多酚酸鹽含有丹參乙酸鎂，可以抑制機體炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并起到抗細(xì)胞凋亡、抗炎、抑制氧化應(yīng)激、改善微循環(huán)等功效。我們推測丹參多酚酸鹽可以對APE大鼠肺組織起到一定的保護(hù)作用，其具體作用機制可能與抑制APE大鼠肺組織炎癥反應(yīng)、CX3CR1表達(dá)水平與NF-κB信號通路有關(guān)。故設(shè)計動物學(xué)實驗復(fù)制APE大鼠模型驗證以上猜想。

APE大鼠肺組織HE染色結(jié)果表明，APE大鼠肺組織主要的病理變化為肺泡壁血管充血、輕度擴張，并伴有輕、中度水腫，可見炎癥細(xì)胞浸潤。栓塞4 h后各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果表明，丹參多酚酸鹽組大鼠肺損傷程度減輕，但相對模型組僅略有緩解，效果并不明顯。栓塞72 h后，APE大鼠肺組織主要病理改變?yōu)榉闻荼谘艹溲?、高度擴張，伴有肺出血與肺泡壁壞死。此時與模型組比較，丹參多酚酸鹽組大鼠肺損傷程度明顯減輕，提示丹參多酚酸鹽可以有效緩解APE帶來的肺組織病理損害，對肺組織具有一定的保護(hù)作用。柴海強[18]發(fā)現(xiàn)丹紅注射液聯(lián)合利伐沙班可以有效改善APE患者的凝血功能與微循環(huán)，認(rèn)為與丹紅注射液活血化瘀功效有關(guān)。研究[19-20]表明丹參多酚酸鹽具有降低血清TNF-α、IL-8水平，減少血管內(nèi)皮損傷的功效?？梢灶A(yù)見丹參多酚酸鹽不僅可以活血化瘀，緩解APE病理癥狀，同時可以起到抗炎功效，改善肺循環(huán)。本研究表明栓塞72 h，丹參多酚酸鹽組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平均低于模型組（P＜0.05），提示丹參多酚酸鹽減輕了APE大鼠機體炎癥反應(yīng)，與以上研究結(jié)果相似。我們猜想丹參多酚酸鹽可以通過減輕機體炎癥反應(yīng)，從而抑制NF-κB信號通路激活與CX3CR1表達(dá)，避免進(jìn)一步的炎癥細(xì)胞浸潤與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。免疫組化與蛋白印跡結(jié)果表明，模型組大鼠CX3CR1、NF-κB呈高表達(dá)，陽性細(xì)胞計數(shù)及蛋白表達(dá)水平明顯高于其余各組（P＜0.05）。栓塞4 h后，丹參多酚酸鹽組大鼠CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平均低于模型組，但仍高于正常對照組與假手術(shù)組，栓塞72 h后，丹參多酚酸鹽組大鼠CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平與正常對照組與假手術(shù)組相近，提示丹參多酚酸鹽可以下調(diào)大鼠CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)水平，從而起到保護(hù)大鼠肺組織，減輕APE損傷的效果。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們推測APE發(fā)生后，內(nèi)源性或外源性血栓進(jìn)入肺動脈內(nèi)造成呼吸循環(huán)系統(tǒng)障礙并引起血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧缺血與機械性損傷，激活NF-κB信號通路并上調(diào)CX3CL1、CX3CR1表達(dá)水平，促使TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子分泌與釋放，從而擴大炎癥反應(yīng)加重肺組織損傷。丹參多酚酸鹽可以下調(diào)CX3CR1表達(dá)水平，抑制NF-κB信號通路活化，破壞炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而改善APE的病理過程。

綜上所述，丹參多酚酸鹽能夠減輕APE大鼠肺組織損傷，可能與抑制肺組織中CX3CR1、NF-κB蛋白表達(dá)，減輕機體炎癥反應(yīng)水平有關(guān)。