白芍總苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用研究

易良波，楊菲菲，易忠祿

（1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.紅山區(qū)西城辦事處西南地村衛(wèi)生室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種侵襲性高、惡性程度高的消化道腫瘤，早期癥狀隱匿，確診時(shí)多為中晚期，且預(yù)后較差。目前針對(duì)胰腺癌的手術(shù)、放療、化療及對(duì)癥支持治療等治療方法效果均不理想[1-2]。因此尋求新的治療藥物是目前胰腺癌相關(guān)研究的熱點(diǎn)。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從白芍根中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化、肝保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等作用，已被用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[3-4]。近年來(lái)關(guān)于白芍總苷抗腫瘤的研究顯示，白芍總苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用[5-7]，但目前關(guān)于白芍總苷對(duì)人胰腺癌的研究較少，且相關(guān)的機(jī)制還值得進(jìn)一步探究。本研究旨在探討白芍總苷對(duì)人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1增殖、遷移和侵襲的影響，以期為臨床治療胰腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 細(xì)胞 人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1細(xì)胞系，貨號(hào)：SUER0463（XR），購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司，批號(hào)：091102）；RPMI-1640（貨號(hào)：12633012）、胎牛血清（貨號(hào)：16140071）（美國(guó)Gibco公司）；CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E606335）、Trizol（貨號(hào)：B511311）、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（貨號(hào)：B639277）、結(jié)晶紫（貨號(hào)：A600331）（上海生工生物公司）；兔抗人PCNA單克隆抗體（貨號(hào)：ab92552）、兔抗人MMP-2單克隆抗體（貨號(hào)：ab92536）、兔抗人MMP-9單克隆抗體（貨號(hào)：ab76003）、兔抗人β-actin單克隆抗體（貨號(hào)：ab115777）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號(hào)：ab6721）[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司]。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1在含有1%鏈霉素（100 mg/mL）、青霉素（10 000 U/mL）和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 白芍總苷溶液的制備 白芍總苷膠囊用二甲基亞砜（DMSO）溶解分別配制成質(zhì)量濃度為6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400μg/mL的溶液。

2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASPC-1細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)以5000個(gè)/孔接種于96孔板中，總體積為100μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入白芍總苷終質(zhì)量濃度為0、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400μg/mL的溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入20μL CCK8溶液，孵育4 h后，波長(zhǎng)為450 nm下測(cè)定吸光度OD值。

2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASPC-1細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)以3000個(gè)/孔接種于96孔板中，總體積為100μL，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、白芍總苷低劑量組、白芍總苷中劑量組、白芍總苷高劑量組，分別加入終質(zhì)量濃度為0、25、50、100μg/mL的白芍總苷溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入20μL CCK8溶液，孵育4 h后，波長(zhǎng)為450 nm下測(cè)定吸光度OD值。

2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASPC-1細(xì)胞，以500個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中。組別和復(fù)孔的設(shè)置如方法“2.4”，培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞克隆形成的數(shù)量，拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASPC-1細(xì)胞加入孔板中，每孔背后含有5條橫線并含有5×105個(gè)細(xì)胞。過(guò)夜培養(yǎng)后，用200μL的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，洗去劃下的細(xì)胞。組別和復(fù)孔的設(shè)置如方法“2.4”，培養(yǎng)24 h后，取樣拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 在下室加500μL RPMI-1640（15%小牛血清）培養(yǎng)基和50μL不同濃度白芍總苷溶液，上室加入2 000個(gè)ASPC-1細(xì)胞懸液。組別和復(fù)孔的設(shè)置如方法“2.4”，在培養(yǎng)箱孵育48 h后，取出Transwell小室。清除未遷移上室細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫浸染遷移至下室細(xì)胞。顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 RT-qPCR檢測(cè)MMP-9、MMP-2、PCNA的mRNA表達(dá)水平 按密度5×105個(gè)/孔將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ASPC-1細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，組別和復(fù)孔的設(shè)置如方法“2.4”。培養(yǎng)48 h后，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測(cè)MMP-9、MMP-2、PCNA的mRNA表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參。用Beacon Designer 8軟件設(shè)計(jì)特異性的引物。（見(jiàn)表1）RT-qPCR反應(yīng)體系：2×onestep RT-qPCR Master Mix 10μL、正向引物（10μmol/L）0.4μL、反向引物（10μmol/L）0.4μL、RT enzyme Mix 0.65μL、RNA Template 1 ng、RNase free ddH2O至20μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：第一步，反轉(zhuǎn)錄50°C 5 min，1個(gè)循環(huán)；第二步，95℃預(yù)變性3 min，1個(gè)循環(huán)。第三步95℃變性10 s，退火/延伸/采集熒光信號(hào)60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。RT-qPCR儀自動(dòng)生成熔解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，2-△△Ct的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 RT-PCR引物信息

2.9 Western blotting檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況 按密度5×105個(gè)/孔將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ASPC-1細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，組別和復(fù)孔的設(shè)置如方法“2.4”。培養(yǎng)48 h后，用RIPA裂解液冰上裂解20 min，4℃、13 000 r/min離心20 min，收集上清，采用BCA試劑盒蛋白定量。取30～40μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（1:1 000～1:10 000）4℃過(guò)夜，再加入二抗（1:10 000）室溫孵育1 h。最后用ECL曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，多組比較采用單因素方差分析，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 白芍總苷細(xì)胞毒性檢測(cè)CCK8結(jié)果表明，當(dāng)白芍總苷質(zhì)量濃度大于100μg/mL時(shí)，ASPC-1細(xì)胞的存活率明顯降低，表明白芍總苷濃度對(duì)ASPC-1細(xì)胞存活影響較大，因此選擇25、50、100μg/mL這3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（見(jiàn)圖1）

圖1 不同濃度白芍總苷對(duì)ASPC-1細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）

3.2 白芍總苷對(duì)ASPC-1細(xì)胞增殖的影響C CK8結(jié)果表明，24 h白芍總苷中、高劑量組細(xì)胞增殖水平低于空白對(duì)照組（P〈0.05），白芍總苷低劑量組細(xì)胞增殖水平與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；48、72 h白芍總苷低、中、高劑量組細(xì)胞增殖水平均低于空白對(duì)照組（P〈0.05），且白芍總苷濃度越高，細(xì)胞增殖速度下降越明顯。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組ASPC-1細(xì)胞OD450值比較（±s，n=3）

Western blotting和RT-qPCR結(jié)果顯示，白芍總苷低、中、高劑量組ASPC-1細(xì)胞PCNA蛋白和PCNA mRNA表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組（P〈0.05），且呈劑量依賴性。（見(jiàn)圖3）

圖3 各組ASPC-1細(xì)胞PCNA蛋白和PCNA mRNA表達(dá)水平比較

3.3 白芍總苷對(duì)ASPC-1細(xì)胞克隆形成能力的影響ASPC-1細(xì)胞給予白芍總苷干預(yù)后，白芍總苷低、中、高劑量組細(xì)胞克隆數(shù)均低于空白對(duì)照組（P〈0.05），且呈劑量依賴性。（見(jiàn)圖4）

圖4 白芍總苷對(duì)ASPC-1細(xì)胞克隆形成能力的影響

3.4 白芍總苷對(duì)ASPC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白芍總苷低、中、高劑量組細(xì)胞劃痕寬度明顯寬于空白對(duì)照組（P〈0.05）。（見(jiàn)圖5）細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白芍總苷低、中、高劑量組細(xì)胞穿過(guò)基膜的數(shù)量明顯少于空白對(duì)照組（P〈0.05）。（見(jiàn)圖6）

圖5 各組ASPC-1細(xì)胞遷移能力比較

圖6 各組ASPC-1細(xì)胞侵襲能力比較

3.5 白芍總苷對(duì)ASPC-1細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)的影響 白芍總苷低、中、高劑量組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白對(duì)照組（P〈0.05），且呈劑量依賴性。（見(jiàn)圖7）

圖7 各組ASPC-1細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)比較

4 討 論

白芍總苷（TGP）是一種潛在的抑癌劑。李湛全等[7]研究表明，白芍總苷聯(lián)合天冬酰胺酶對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞、胃癌SGC-7901細(xì)胞和胃癌AGS細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制作用。在前列腺癌中，白芍總苷可通過(guò)抑制炎癥相關(guān)STAT3信號(hào)通路激活抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。此外，白芍總苷還可通過(guò)降低B細(xì)胞活化因子（BAFF）對(duì)n-亞硝基二乙胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞癌具有抑制作用[6]。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的白芍總苷能夠降低胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1的細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性。同時(shí)，當(dāng)白芍總苷質(zhì)量濃度大于100μg/mL時(shí)，ASPC-1細(xì)胞的細(xì)胞存活率明顯降低，因此，選擇25、50、100μg/mL這3個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。白芍總苷處理后，ASPC-1細(xì)胞的增殖活力降低，且遷移和侵襲能力下降。表明白芍總苷可抑制胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1的增殖、遷移和侵襲。

腫瘤的形成是多因素、多階段、多基因變異所致的復(fù)雜病變過(guò)程。已有的研究表明，細(xì)胞增殖失控是導(dǎo)致細(xì)胞癌變的重要機(jī)制之一。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），又被稱為周期素，位于人類第20號(hào)染色體，具有調(diào)控DNA合成步驟、修復(fù)損傷DNA、輔助DNA聚合酶δ與DNA鏈結(jié)合、調(diào)控細(xì)胞周期等作用[8-9]。KHAN S等[10]研究表明，奧美昔芬納米顆粒通過(guò)抑制PCNA的表達(dá)來(lái)抑制胰腺腫瘤的生長(zhǎng)。而SOHN E J等[11]研究表明，在胰腺癌中CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復(fù)合體亞基2（CNOT2）能上調(diào)PCNA表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。由此可知，PCNA的表達(dá)水平與胰腺癌增殖狀態(tài)呈正相關(guān)，能夠準(zhǔn)確反映胰腺癌細(xì)胞增殖狀態(tài)。本研究表明，經(jīng)白芍總苷處理后，ASPC-1細(xì)胞中PCNA mRNA和PCNA蛋白表達(dá)水平均降低，提示白芍總苷能通過(guò)下調(diào)PCNA的表達(dá)來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。這與上述結(jié)論一致。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物特征之一，也是引起癌癥患者死亡的根本原因。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）是目前研究發(fā)現(xiàn)與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)酶最重要的一類[12-13]。本研究表明，經(jīng)白芍總苷處理后，ASPC-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低，提示白芍總苷可以抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)。這與NAVEED等[14]研究結(jié)果一致，他們指出白芍總苷能抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)減輕小鼠心肌梗死后心肌重構(gòu)。MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成員，能通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。目前已有研究表明MMP-2和MMP-9在胰腺癌中高表達(dá)，且表達(dá)水平與胰腺癌臨床分期、組織學(xué)分化、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑有關(guān)，下調(diào)MMP-9和MMP-2的表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力[15-17]。由此我們可以推測(cè)，白芍總苷能通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

綜上所述，本研究在分子和細(xì)胞層面揭示了白芍總苷抗胰腺癌的作用機(jī)制，為胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲提供體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。并為進(jìn)一步尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ)，值得進(jìn)行深入研究。