尋常型銀屑病三種中醫(yī)證型外周血單核細胞基因芯片與miRNA芯片關聯(lián)分析*

盧 月，亓 篧，陳曲波，韓 凌,3，郜恒駿，盧傳堅,3

（1.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006；2.生物芯片上海國家工程研究中心，上海 201203；3.廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510006）

銀屑病是一種慢性遷延、易反復發(fā)作的皮膚炎癥性疾病。世界衛(wèi)生組織（WHO）2016年報告全球銀屑病患病率在0.09%到11.43%之間[1]，我國發(fā)病率近25年間由0.12%增長至1.49%，銀屑病已成為危害公共健康的常見疾病[2]。銀屑病在治療上存在諸多缺陷，往往緩解期短，易復發(fā)，易耐受，且大多數(shù)藥物都存在相當?shù)亩靖弊饔?。中醫(yī)學在治療銀屑病方面具有獨特的理論體系，長期以來積累了豐富的臨床經驗。中醫(yī)證候是中醫(yī)學臨床與基礎的核心，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的重要內容。課題組對1979—2010年尋常型銀屑病文獻證候分布情況進行分析，發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者所有證型中，排前3位的證候血熱證（32.86%）、血燥證（23.56%）、血瘀證（19.43%），累計共占75.85%；并且血瘀證與穩(wěn)定期相關，消退期與血燥證相關[3-4]。

本課題通過基因表達譜芯片和miRNA芯片技術，對銀屑病三種常見中醫(yī)辨證分型患者的外周血單核細胞基因表達水平和miRNA表達水平進行分析，對差異表達基因和miRNA進行關聯(lián)分析，從基因和miRNA水平揭示銀屑病不同證型的微觀物質基礎。

1 資料與方法

1.1 納入標準 符合尋常型銀屑病診斷標準[5]，中醫(yī)證型診斷符合白疪證型診斷[6]；簽署知情同意書。

1.2 排除標準 妊娠或哺乳期婦女；近半年內服用過類固醇藥物和/或服過維甲酸類藥物或用過生物制劑；1個月內外用過類固醇制劑或維甲酸類乳膏；合并有甲狀腺功能亢進、心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病和精神病患者，以及長期服藥的患者；多種中醫(yī)證型夾雜的患者。

1.3 研究對象 所有患者均來源于廣東省中醫(yī)院皮膚科門診和病房。經本院倫理委員會批準。尋常型銀屑病組：共62例，其中血熱證16例，血瘀證23例，血燥證23例；男44例，女18例；平均年齡45.5歲（19～60歲），病程1個月至10年。健康對照組：共10名，均為門診體檢健康者，性別和年齡與銀屑病組相匹配。

1.4 儀器及試劑TRI Reagent（德國Sigma公司，貨號：T9424），miRNeasy Micro試劑盒（德國QIAGEN公司，貨號：217084），RNase-Free DNase Set（德國QIAGEN公司，貨號：79254），Affymetrix表達譜配套試劑盒GeneChipRWT PLUS試劑盒（美國Affymetrix公司，貨號：902280)，GeneChipR雜交洗脫染色試劑盒（美國Affymetrix公司，貨號：900720），滾動雜交爐（美國Affymetrix公司，貨號：00-0331-220V），洗滌工作站450DX2（美國Affymetrix公司，貨號：00-0335），數(shù)據(jù)采集軟件Command Console Software 3.1（美國Affymetrix公司），數(shù)據(jù)分析軟件Transcriptome Analysis console Software（美國Affymetrix公司）；Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀（美國Agilent公司）；芯片掃描儀GeneChipRScanner 3000DX2（美國Affymetrix公司，貨號00-0334）；本實驗選用芯片為Affymertix公司的GeneChipRclariom D基因芯片和Agilent Human miRNA，Release 21.0（8*60K,Design ID：070156）芯片。

1.5 標本采集及處理 采集肘靜脈血10 mL于含有肝素的抗凝管中，按照試劑盒說明書分離外周血單核細胞（PBMC），置-80℃冰箱保存。

1.6 RNA的抽提與質檢 根據(jù)Sigma提供的標準操作流程,采用TRI Reagent對樣本總RNA進行抽提，進而使用miRNeasy Micro試劑盒和RNase-Free DNase Set純化總RNA。在質檢評斷合格后，純化后的總RNA，經Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀評估RNA的完整性。

1.7 基因芯片實驗 本研究采用Affymetrix表達譜配套試劑盒GeneChipRWT PLUS試劑盒，按照生產廠商規(guī)定的標準操作流程對樣品總RNA中的mRNA進行體外反轉錄擴增，同時用生物素（biotin）標記cRNA。

按照Affymetrix芯片雜交流程，把生物素標記的cRNA加入盒式芯片中，按照表達譜芯片配套提供的雜交標準流程使用配套試劑盒，在45℃滾動雜交爐中滾動雜交16 h，雜交完成后在洗滌工作站按照標準操作流程進行芯片的洗滌。

芯片結果采用芯片掃描儀GeneChipRScanner 3000DX2進行掃描，用Command Console Software 3.1軟件讀取原始數(shù)據(jù)，質控合格的數(shù)據(jù)采用Command Console Software 3.1軟件進行歸一化處理，使用Gene level_SST_RMA算法對數(shù)據(jù)進行質控并出具數(shù)據(jù)報告，采用Transcriptome Analysis console軟件進行初步的基因差異表達分析。篩選P〈0.05，fold change≥2的差異基因，利用DAVID進行富集，選擇P〈0.05的通路進行分析。

1.8 miRNA芯片實驗 本研究使用的芯片為Agilent Human miRNA,Release 21.0（8*60K，Design ID：070156）芯片，樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并經Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性。RNA質檢合格后，參照芯片標準流程進行樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫。

采用Feature Extraction軟件（version10.7.1.1,Agilent Technologies）處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。利用t檢驗的P值和倍數(shù)變化值進行差異miRNA篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數(shù)變化值≥2.0且P≤0.05。接著，利用3個數(shù)據(jù)庫（Targetscan，microRNAorg，pita）共同對差異miRNA進行靶基因預測，接著對靶基因進行GO和KEGG富集分析，以判定差異miRNA主要影響的生物學功能或者通路。

根據(jù)表達譜芯片的差異基因分析結果，miRNA芯片差異miRNA及靶基因預測結果，利用DIANA在線工具及其數(shù)據(jù)庫對基因芯片和miRNA芯片結果進行關聯(lián)分析和維恩分析。

2 結 果

2.1 銀屑病不同證型患者和健康人的表達譜芯片與miRNA芯片結果關聯(lián)分析 我們根據(jù)銀屑病不同中醫(yī)證型患者和健康人miRNA芯片差異miRNA的靶基因預測結果，將表達譜分析的差異基因與miRNA芯片分析的差異miRNA按照差異改變負相關的關系進行關聯(lián)分析。結果表明，銀屑病血熱證患者和健康人的差異miRNA包括hsa-miR-136-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-485-3p；銀屑病血燥證患者和健康人的差異miRNA包括hsa-miR-1-3p、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-485-3p；銀屑病血瘀證患者vs健康人的差異miRNA包括hsa-let-7c-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-146a-5p等21個。（見表1～3）

表1 銀屑病血熱證患者和健康人差異miRNA與靶向差異基因

表2 銀屑病血燥證患者和健康人差異miRNA與靶向差異基因

表3 銀屑病血瘀證患者和健康人差異miRNA與相關聯(lián)差異基因

2.2 三種銀屑病中醫(yī)證型與健康人關聯(lián)分析差異miRNA篩選共有差異miRNA，將三種證型與健康人的差異基因和差異miRNA進行關聯(lián)分析后，對各證型關聯(lián)分析后miRNA和基因的差異倍數(shù)都≥1.2倍的miRNA進行韋恩分析，經分析得到共有差異miRNA為hsa-miR-485-3p。（見圖1）

圖1 三種銀屑病中醫(yī)證型患者與健康人關聯(lián)分析差異miRNA

2.3 三種銀屑病中醫(yī)證型與健康人關聯(lián)分析差異基因 篩選出的共有差異基因分析按照上述分析方法，將各證型關聯(lián)分析后miRNA和基因的差異倍數(shù)都≥1.2倍的差異基因進行維恩分析。結果表明，三種證型的共有差異基因為miR-485-3p的靶基因RBMS1和FAM98B。（見圖2）

圖2 三種銀屑病中醫(yī)證型患者與健康人關聯(lián)分析差異基因

2.4 三種銀屑病中醫(yī)證型存在靶標關系的特有差異miRNA和基因分析 關聯(lián)分析和韋恩分析結果表明血瘀證存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共142對，血燥證存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共15對，而血熱證不存在證型特有差異miRNA。

3 討 論

銀屑病疾病分期一般分為進行期、穩(wěn)定期和消退期，與銀屑病常見三種中醫(yī)證型相對應。血熱證多處于銀屑病進行期，血熱熾盛或外受毒熱刺激，而致血熱生風，風盛化燥，故皮損潮紅脫屑，伴瘙癢，并口干、心煩、易怒，大便秘結，小便赤黃。血瘀證多處于穩(wěn)定期，且病程長，濕毒內滯，氣滯血瘀。此時皮損為暗紅色，呈斑塊狀并肥厚，或呈苔蘚樣變，有明顯浸潤，伴瘙癢。血燥證多處于消退期，熱毒蓄久，傷陰耗血所致。此時皮損顏色淡紅，鱗屑少，伴瘙癢，并咽干、口干、大便秘結[7]。本課題通過基因表達譜芯片和miRNA芯片，在基因和miRNA表達水平對銀屑病常見三種中醫(yī)證型進行分析，并將結果進行關聯(lián)，得到三種中醫(yī)證型共有差異miRNA，以及可能是其作用靶點的差異基因。

經關聯(lián)分析和韋恩分析，結果表明血瘀證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共159對，血燥證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共16對，而血熱證組不存在證型特有差異miRNA。SLA2與其調控的hsa-miR-26b-5p是血瘀證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因之一。SLA2（Src like adaptor 2，又名SLAP-2）是主要在造血細胞中表達的銜接蛋白。在T細胞中，SLAP-2與幾種酪氨酸磷酸化蛋白相結合，通過與泛素連接酶c-Cbl的相互作用負性調節(jié)T細胞抗原受體下游信號傳導[8]。此外，hsa-miR-26b-5p與代謝調節(jié)、糖尿病相關[9]。WASL與hsa-miR-1-3p是血燥證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因。WASL（WASP like actin nucleation promoting factor，又名N-WASP）在細胞遷移、免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用，該基因可以通過調控NF-kB和MAPK信號通路進而影響牙齦成纖維細胞中炎癥細胞因子的表達[10]。并且，WASL可以調控IL-23在角質形成細胞中的表達，進而影響慢性皮膚炎癥的發(fā)生[11]。hsa-miR-1-3p與其靶基因作用，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病的發(fā)生[12]。

經分析得到三種中醫(yī)證型共有差異miRNA為hsa-miR-485-3p。研究表明，miR-485-3p通過下調Top2α的表達，調控核因子-YB影響DNA拓撲異構酶Ⅱα的表達和藥物反應性[13]。此外，miR-485-3p是盤狀皮膚紅斑狼瘡發(fā)病機制中的調控因子，通過調節(jié)炎癥介質的產生，從而促進盤狀皮膚紅斑狼瘡病變中的皮膚炎癥，說明miR-485-3p與皮膚免疫炎癥密切相關[14]。RBMS1（RNA Binding Motif single stranded interacting protein 1）是結合單鏈DNA/RNA的小蛋白家族成員，參與DNA復制與細胞周期調控。RBMS1能夠特異性結合C-myc基因上游的復制起始區(qū)[15]，調控C-myc表達，調控銀屑病表皮角質形成細胞的增殖與分化。此外，RBSM1可通過IL-6/STAT3信號通路促進胃癌細胞的侵襲轉移[16]。研究[17]表明，與健康人比較，血熱證銀屑病患者皮損中JAKl/STAT3信號通路活化程度顯著升高，下游因子C-myc、VEGF表達量升高，同時高于血燥證和血瘀證患者，證型間的表達水平呈血熱證〉血瘀證〉血燥證的狀態(tài)。RBSM1是否通過JAKl/STAT3調控下游因子C-myc、VEGF的表達發(fā)揮影響三種證型狀態(tài)的機制還需要進一步深入研究。研究表明，中國漢族人群RBMS1基因rs7593730位點與代謝性疾病2型糖尿病具有顯著相關性，RBMS1和ITGB6基因2q24位點的突變人群具有2型糖尿病易感性[9]。研究[18]顯示，F(xiàn)AM98B與hCLE、DDX1、HSPC117形成復合物，在細胞核和細胞質之間穿梭以轉運RNA，在控制細胞核和細胞質RNA功能中發(fā)揮重要作用。FAM98B作為銀屑病三種證型中共有差異靶基因，其在銀屑病方面的作用還尚未報道。

本研究通過對尋常型銀屑病不同中醫(yī)證型患者外周血單核細胞的基因表達譜芯片與miRNA芯片結果進行關聯(lián)分析，得到銀屑病不同中醫(yī)證型的微觀物質基礎；并且發(fā)現(xiàn)miR-485-3p及其靶基因RBMS1和FAM98B有可能是參與銀屑病發(fā)生的重要miRNA和基因。