基于多酚類物質差異性判別普洱生茶的貯藏年限

林 昕，王 麗，陳興蓮，邵金良，蘭珊珊，魏茂瓊，沙林杰，劉宏程*

（1 云南省農業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所 昆明 650203 2 農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室 昆明 650203 3 農業(yè)農村部農產品質量監(jiān)督檢驗測試中心 昆明 650203）

普洱茶[1]是我國“六大茶類”中的代表性黑茶之一，也是典型的地理標準型產品，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抑菌、助消化、醒酒、解毒等多種功效[2]。與其它茶類相比，普洱茶是擁有獨特風味品質特征的后發(fā)酵茶葉，其滋味“醇厚回甘”，具有“陳香味”香氣，這是由普洱茶鮮明的屬性所決定[2]。根據(jù)普洱茶加工工藝的不同分為普洱生茶和普洱熟茶。普洱生茶[3-4]具有更強的清除自由基、抗氧化活性，降血糖、降血脂等抗衰老的功效，被稱為“減肥茶”和“美容茶”，受到國內外廣大消費者的青睞。依據(jù)傳統(tǒng)經驗，普遍認為普洱生茶的品質經過一段時間的貯藏會明顯提升，具有“越陳越香，紅褐明亮”的特征[5]。研究者分別通過感官評價[6]、香氣評價[7]、湯色評價[8]和品質成分評價[9]等多方面，證實了這一點。

目前普洱生茶貯藏時間對品質的影響成為研究熱點。普洱生茶貯藏時間的傳統(tǒng)鑒別方法主要依據(jù)普洱生茶的感官審評打分判定[10]。茶葉的感官評價需要從業(yè)者具備專業(yè)性強、經驗豐富和感官識別靈敏的素質，然而合格的評茶人員很少，并且感官審評結果極具主觀性，易受外界因素影響，最終影響評分結果。為科學、準確地評定普洱生茶的貯藏時間，田小軍等[11]利用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質譜聯(lián)用方法分析普洱生茶貯藏期間香氣成分變化，并結合化學計量學進行特征性指標研究。曾亮等[12]采用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用方法測定茶湯中多種成分的變化趨勢，并結合化學計量學進行特征成分篩選。劉興勇等[13]通過高效液相色譜儀獲得不同陳化年限普洱茶內含成分的指紋圖譜信息，結合化學計量學方法判別不同貯藏時間的普洱茶。上述研究表明，通過儀器測定普洱茶內含成分差異性，結合化學計量學方法鑒別不同貯藏年份的普洱茶是可行的。多酚類物質是普洱茶品質形成的重要物質基礎[14]，本研究通過分析普洱茶中18 種代表性多酚類成分在貯藏期間的變化特征，結合偏最小二乘判別分析法及其變量重要性貢獻值，來反映普洱生茶貯藏期間多酚類組分的變化特征，為普洱生茶貯藏時間的評定提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和樣品

1.1.1 茶葉樣品 在昆明市茶葉市場購買得到不同貯藏年限的普洱茶樣品，每個產區(qū)6 份，合計18 份，按照T/TEA 002-2019《陳年普洱茶》[15]中對普洱茶貯藏期定義對樣品進行劃分，以普洱生茶貯藏年限為依據(jù)低于5年分為C 組，貯藏年限高于5年低于10年分為B 組，高于10年分為A 組（詳見表1）。

表1 茶葉樣品來源Table 1 Sources of raw Pu-erh tea samples

1.1.2 儀器和試劑 Waters Alliance e2695-2998高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器、Empower 3 數(shù)據(jù)工作站，美國Waters 公司；KQ-500DB 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-10B-6D 高速離心機，上海安亭科學儀器廠；JJ200 電子分析天平，江蘇省常熟市雙杰測試儀器廠；MILLIQ 純水機，美國Millipore 公司。

乙腈、甲醇（色譜純級），德國Merck 公司；磷酸、乙酸（分析純級），國藥集團化學試劑有限公司；多酚類對照品：兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate，CG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、蘆?。≧utin）、槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、山奈苷（Kaempferitrin）、芹菜素（Apigenin）、金絲桃苷（Hyperoside）、沒食子酸（Gallic acid，GA）、茶黃素（Theaflavin）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（Theaflavin-3’-gallate，TF-3’-G）、茶黃素-3，3’-雙沒食子酸（Theaflavine-3，3’-digallate，TF-3，3’-G）（純度≥98.0%），成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

本試驗中茶葉前處理及其檢測方法等參數(shù)參考李永迪等[16]和王麗等[17-19]的試驗方法。

1.2.1 樣品前處理及供試液制備 將普洱茶樣品按照“四分法”處理，將粉碎后的茶葉樣品過60 目篩。精密稱取1.0 g 樣品置于50 mL 離心管中，加入10 mL 80%甲醇水溶液，超聲處理30 min，以5 000 r/min 離心5 min，移取上層清液到25 mL容量瓶中，離心管內再加入10 mL 80%甲醇水溶液復提，合并上清液并定容到25 mL，吸取1 mL 上清液經0.22 μm 有機相濾膜過濾，待上機測定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱選擇Waters C18 柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），柱溫30.0 ℃，進樣體積10.0 μL，流速0.7 mL/min，流動相A 為乙腈，流動相B為0.5%乙酸水溶液，梯度洗脫程序見表2。檢測波長分別是270 nm 和360 nm。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedures

1.2.3 對照品溶液制備 分別精密稱取兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、槲皮素、山奈酚、山奈苷、芹菜素、金絲桃苷、沒食子酸、對羥基苯丙酸、咖啡堿、茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯、茶黃素-3，3’-雙沒食子酸各對照品10 mg，各用甲醇溶解并定容至于10 mL，搖勻得到單一對照品儲備溶液，再準確吸取上述各對照品于容量瓶中并用甲醇定容，得到18 種混合對照品溶液，低溫避光保存、備用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進行方差分析比較不同樣品間的顯著性差異，P＜0.05 認為具有統(tǒng)計學顯著差異，并在SPSS 23.0 軟件上進行聚類分析，將數(shù)據(jù)標準化處理后輸入軟件SIMCA-P11.0進行主成分分析和偏最小二乘判別分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏年限普洱生茶中多酚類成分差異性分析

普洱生茶中的多酚類物質[20-21]通常包括黃烷醇類（兒茶素類為代表）、黃酮及黃酮苷類（山奈酚和槲皮素為代表）、花青素和酚酸及縮酚酸等。對不同貯藏年限的普洱生茶中18 種多酚類成分含量檢測并統(tǒng)計分析，分析結果見表3。從結果可以看出，普洱生茶中的兒茶素類多酚成分含量隨著貯藏年限的延長而逐步下降，長期貯藏的A 組與短期貯藏的C 組相比大部分存在顯著差異性。普洱生茶中的黃酮及黃酮苷類中的蘆丁、山奈酚和金絲桃苷的含量也逐步下降，山奈酚的含量經統(tǒng)計學分析表明長期貯藏的A 組含量與短期貯藏的C 組含量存在顯著差異性。沒食子酸是普洱茶中重要的特征性組分，隨著貯藏年限的延長，其含量逐步增加，長期貯藏的A 組含量與短期貯藏的C組含量比較，存在統(tǒng)計學上的顯著差異性。茶黃素類化合物中茶黃素-3-沒食子酸酯和茶黃素-3，3’-雙沒食子酸的含量隨著貯藏年限的延長含量逐步增加，其它的茶黃素含量略有下降，茶黃素-3’-沒食子酸的含量無明顯變化，這與茶黃素是由兒茶素類為主組分氧化形成有關。

表3 不同貯藏年限普洱生茶多酚類成分含量（mg/g）Table 3 Polyphenols contents of raw Pu-erh tea with different storage times（mg/g）

2.2 不同貯藏年限普洱生茶多酚類組分的多元統(tǒng)計分析

2.2.1 主成分分析結果 主成分分析法是通過正交變換將一組可能存在相關性的變量轉換為一組線性不相關的變量，轉換后的這組變量叫主成分。目前主成分分析法作為一種非監(jiān)督模式的統(tǒng)計方法得到廣泛應用。

在本文中，將18 種多酚類成分進行標準化處理，帶入軟件SPSS 23.0 進行PCA 分析。通過對普洱生茶中多酚類化合物進行信息提取和濃縮，得到PCA 的得分圖和載荷因子圖（圖1），特征值及方差貢獻率見表4。

圖1 PCA 得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.1 PCA score scatter plot（a）and loading scatter plot（b）

表4 PCA 特征值及方差貢獻率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate of PCA

從圖1a 可以看出，不同貯藏年限的普洱生茶雖然可以被區(qū)分開來，但是部分樣品混合在一起。從表4可知，前5 個主成分PC1、PC2、PC3、PC4 和PC5 的特征值大于1，其累積貢獻率達82.186%，能較好的反映變量的原始信息。從PCA 載荷圖（圖1b）可以看出，沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、山奈酚和茶黃素-3-沒食子酸酯、沒食子酸6 個含量指標在第1主成分上載荷較大，兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、茶黃素、茶黃素-3’-沒食子酸和茶黃素-3，3’-雙沒食子酸5 個含量指標在第2 主成分上載荷較大，從結果可以看出，兒茶素類組分和茶黃素類組分在主成分中貢獻率中占據(jù)優(yōu)勢，說明普洱茶生茶在貯藏期間，兒茶素類組分和茶黃素類組分發(fā)生了明顯變化。

2.2.2 聚類分析結果 聚類分析是一種將研究對象分為相對同質的群組的統(tǒng)計分析技術，作為一種無監(jiān)督模式，被廣泛應用。在本文中，將18 個樣品的18 種多酚類成分進行標準化處理，輸入軟件SPSS 23.0 進行聚類分析。采用系統(tǒng)聚類中“瓦爾德-平方歐式距離”算法，結果見圖2。

從圖2可知，當橫坐標為15 時，可將茶葉樣品聚類為3 類，拋開3 和12 號樣品，貯藏年限超過5年的普洱生茶樣品，A 組和B 組樣品聚在一起歸為一類。貯藏年限不超過5年的C 組普洱生茶樣品聚集在一起歸為一類。這結果說明普洱生茶貯藏年限從第5年起，普洱生茶內含多酚類成分發(fā)生明顯變化。

圖2 不同貯藏年限普洱生茶的聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram for cluster analysis of raw Pu-erh tea with different storage times

2.2.3 偏最小二乘判別分析結果 主成分分析結果和聚類分析結果表明，隨著普洱生茶貯藏年限的變化，18 種多酚類組分隨之發(fā)生明顯變化，并且在統(tǒng)計學上是有意義的。偏最小二乘判別法是一種數(shù)學優(yōu)化技術，它通過最小化誤差的平方和找到一組數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配，適用于多自變量的分析中。因此，可將偏最小二乘判別法引入不同貯藏年限普洱生茶的研究中，以18 種多酚組分為自變量（X），以貯藏年限為因變量（Y），將長期貯藏年限（10年）普洱生茶定義為A 組，中期貯藏年限（5年）普洱生茶為B 組，短期貯藏年限普洱生茶為C 組，進行模型分析，并對模型進行了200 次置換檢驗試驗，結果見圖3。從圖3可以看出，不同貯藏年限的普洱生茶被明顯區(qū)分開來。依據(jù)偏最小二乘判別分析結果，以4 個主成分作為模型擬合結果最優(yōu)，模型的R2X（cum）自變量擬合指數(shù)值是0.893，表示當模型以4 個主成分擬合自變量時，其可反映總自變量中的89.3%；同時，因變量（Y）的擬合指數(shù)R2Y（cum）值是0.821，表示當模型以4 個主成分擬合自變量時，可反映總因變量中的82.1%；模型預測指標Q2（cum）=0.864，說明對于不同貯藏年限普洱生茶的預測率為86.4%，說明模型結果可靠。

圖3 不同貯藏年限普洱生茶的PLS-DA 圖Fig.3 PLS-DA score plot of raw Pu-erh tea with different storage times

為了進一步探尋以多酚類成分為自變量對于偏最小二乘判別法模型分析結果的貢獻率，求得偏最小二乘判別法模型的變量值貢獻圖（圖4）。變量值的大小代表了各品質成分對模型貢獻率的大小，數(shù)值越大貢獻越大，按大小順序排列的普洱生茶中多酚類組分沒食子酸、懈皮素、山奈酚、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶黃素-3-沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯為主要的差異性組分，結合含量統(tǒng)計分析結果，可以將沒食子酸、懈皮素、山奈酚、茶黃素-3-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯8 個普洱茶多酚類成分作為區(qū)分不同貯藏年限普洱生茶的偏最小二乘判別法模型的標志性成分。

圖4 偏最小二乘判別法模型的變量值條形圖Fig.4 Barplot with PLS-DA model of VIP

3 結論

本研究對不同貯藏年限普洱生茶內含有的18 種代表性多酚類組分含量進行測定，通過化學計量學方法對這些數(shù)據(jù)進行分析。結果表明，隨著貯藏年限的延長，普洱生茶中兒茶素類組分含量呈下降趨勢，茶黃素類組分含量呈上升趨勢，黃酮及黃酮苷類含量呈不規(guī)則變化。相同貯藏年限茶葉樣品可以被聚聚在一起，不同貯藏年限樣品分離趨勢雖然存在，但是分離度一般。對數(shù)據(jù)采用偏最小二乘判別分析，不同貯藏年限普洱生茶樣品分離趨勢明顯，通過對多酚類組分重要性（重要性值>1）分析，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、山奈酚、芹菜素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、山奈苷、茶黃素-3-沒食子酸酯、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯10 個多酚類組分對于不同貯藏年限普洱生茶樣品呈現(xiàn)分離趨勢起到主要作用，結合含量差異性分析結果，沒食子酸、山奈酚、茶黃素-3-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯7 個多酚類組分在普洱生茶貯藏期間發(fā)生明顯變化，可以視為標志性成分。本研究可為普洱生茶貯藏期間品質變化深入研究提供依據(jù)。