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    益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)不確定度的評(píng)定

    2021-11-22 06:34:56商迎輝李夢(mèng)潔劉蕓如黃漢昌勞鳳學(xué)
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:移液器保健食品雙歧

    商迎輝,李夢(mèng)潔,劉蕓如,黃漢昌,勞鳳學(xué)

    (北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院 生物化學(xué)工程學(xué)院 北京 100191)

    益生菌是對(duì)人體有益的活性菌群,能增強(qiáng)人體的免疫力[1],促進(jìn)腸道的健康,預(yù)防和改善腹泄等狀況[2]。其中,雙歧桿菌不但可產(chǎn)生B1、B2、B6、B12等多種維生素及氨基酸,還可產(chǎn)生有機(jī)酸,使有害菌或一些致病菌因腸內(nèi)pH 值的下降而死亡。另外,益生菌必須滿(mǎn)足可食用性、安全性和穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)再加工生產(chǎn)后仍然穩(wěn)定且具有活性,可以耐受胃酸、膽汁和胰酶的消化,可在體內(nèi)繁殖[3]。

    益生菌每日的攝入量決定其益生效果,到達(dá)腸道內(nèi)的益生菌數(shù)為106CFU/g(mL)時(shí)才能對(duì)人體產(chǎn)生益生效果[4]。益生菌類(lèi)保健食品應(yīng)含有與其益生作用相對(duì)應(yīng)的菌種和最低的含量值?!兑嫔?lèi)保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)》中規(guī)定益生菌類(lèi)保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)的活菌數(shù)量的最小值為106CFU/g(mL)。

    不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[5]。《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》[6]和《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》[7]中明確要求:微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有對(duì)測(cè)量不確定度評(píng)定的相應(yīng)能力。

    不確定度的評(píng)定一般用A 類(lèi)評(píng)定和B 類(lèi)評(píng)定來(lái)評(píng)定測(cè)量不確定度分量。其中,A 類(lèi)評(píng)定用統(tǒng)計(jì)方法評(píng)定不確定度分量,重復(fù)性檢測(cè)引入的不確定度屬于A 類(lèi)不確定度;而另一類(lèi)B 類(lèi)評(píng)定用任何非統(tǒng)計(jì)方法評(píng)定不確定度分量,儀器和設(shè)備校準(zhǔn)引入等的不確定度屬于B 類(lèi)不確定度[8]。

    同時(shí)含有乳桿菌和雙歧桿菌的益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌的計(jì)數(shù)是按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》(GB 4789.35-2016)[9]進(jìn)行,其中,樣品稀釋和加樣時(shí)既可以使用1 mL 吸管也可以使用微量移液器。其操作方便,耗材成本較低,在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)過(guò)程中微量移液器的使用更普遍。益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌的數(shù)量較大,稀釋倍數(shù)大,由于與微量移液器相比吸量管的允差小,因此帶入的不確定度變小。本研究目的是比較以上兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)的測(cè)量不確定度產(chǎn)生的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    市售益生菌類(lèi)保健品(同時(shí)含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬),湯臣倍健股份有限公司;莫匹羅星鋰鹽、半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS 培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1.2.1 引入B 類(lèi)不確定度的儀器與設(shè)備 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》(GB 4789.35-2016)。

    1)天平 感量0.01 g,依據(jù)檢定證書(shū),量程0~25 g 時(shí),最大允許誤差±0.025 g。

    2)量筒 250 mL,依據(jù)《常用玻璃量器》(JJG 196-2006)[10],容量允差為±2.0 mL。

    3)無(wú)菌吸量管(A 類(lèi))依據(jù) 《常用玻璃量器》(JJG 196-2006),1 mL(具0.01 mL 刻度),容量允差為±0.008 mL;10 mL(具0.1 mL 刻度),容量允差為±0.05 mL。

    4)微量移液器(100~1 000 μL)依據(jù)《移液器檢定規(guī)程》(JJG 646-2006)[11],移取1 mL 時(shí),容量允差為±0.01 mL。

    1.2.2 其它設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱(36 ℃),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;均質(zhì)器,西班牙IUL 及無(wú)菌均質(zhì)袋;厭氧包,日本MGC 公司。

    1.3 方法

    1.3.1 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)進(jìn)行雙歧桿菌計(jì)數(shù)》(GB 4789.35-2016)

    1.3.2 雙歧桿菌計(jì)數(shù)過(guò)程

    1.3.2.1 樣品稱(chēng)量與制備 充分混勻樣品,按無(wú)菌操作要求稱(chēng)取25.00 g,置于含225 mL 無(wú)菌生理鹽水的均質(zhì)袋中,用均質(zhì)器均質(zhì)120 s,制成1∶10 的樣品勻液。

    1.3.2.2 樣品稀釋

    1)吸量管組 用1 mL 無(wú)菌吸量管吸取1∶10 樣品稀釋液1 mL,沿管壁緩緩注入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi),充分振搖后制成1∶100的樣品稀釋液。按上述操作,依次作10 倍系列稀釋。

    2)移液器組 使用微量移液器進(jìn)行上述操作。

    1.3.2.3 加樣

    1)吸量管組 選擇3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度用1 mL 無(wú)菌吸量管吸取1 mL 樣品稀釋液于無(wú)菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平皿。

    2)移液器組 使用微量移液器進(jìn)行上述操作。

    1.3.2.4 培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 稀釋液被移入平皿后,將冷卻至48 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS 培養(yǎng)基傾注平皿約15 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混合均勻。從樣品稀釋到平板傾注在15 min內(nèi)完成。36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 雙歧桿菌菌落計(jì)數(shù)

    選取菌落數(shù)在30~300 CFU 范圍,無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)雙歧桿菌菌落總數(shù)。

    2.2 結(jié)果表述

    只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍,計(jì)算2 個(gè)平板上的菌落數(shù)平均值,將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每克樣品中雙歧桿菌菌落數(shù)。

    2.3 不確定度的評(píng)定

    2.3.1 樣品重復(fù)性檢測(cè)引起的A 類(lèi)不確定度 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》(GB 4789.35-2016),對(duì)同一含乳桿菌和雙歧桿菌的保健食品做10 次獨(dú)立測(cè)試,結(jié)果只有稀釋度為108的雙歧桿菌菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍。由于每克樣品中雙歧桿菌的數(shù)量在109數(shù)量級(jí),因此對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)進(jìn)行A 類(lèi)不確定度的評(píng)定[12-14]。

    2.3.1.1 吸量管組 按貝塞爾公式計(jì)算檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差:

    式中,S——標(biāo)準(zhǔn)差;xi——第i次測(cè)量的測(cè)得值;——n次測(cè)量所得一組測(cè)得值的算數(shù)平均值。

    相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    式中,urel()——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;u()——標(biāo)準(zhǔn)不確度;——n次測(cè)量所得一組測(cè)得值的算數(shù)平均值。

    2.3.1.2 移液器組 按貝塞爾公式計(jì)算出檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差:

    相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    2.3.2 B 類(lèi)不確定的度評(píng)定[15-17]

    2.3.2.1 樣品制備過(guò)程中引入的不確定度 用天平(精度0.01 g)稱(chēng)取25.00 g 樣品,由天平檢定證書(shū)可知,最大允許差為±0.025 g。按級(jí)使用的數(shù)字儀表、測(cè)量?jī)x器最大允許誤差導(dǎo)致的不確定度屬于矩形(均勻)分布,天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    相對(duì)不確定度為:

    用容量250 mL 的量筒量取225 mL 無(wú)菌生理鹽水,加入樣品中制備樣品勻液?!冻S貌AЯ科鳌罚↗JG 196-2006)規(guī)定,250 mL 量出式量筒的容量允差為±2.0 mL。取矩形分布,量筒引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    相對(duì)不確定度為:

    以上2 項(xiàng)合成可得樣品制備過(guò)程中引入的相對(duì)合成不確定度為:

    2.3.2.2 樣品稀釋過(guò)程中引入的不確定度

    1)吸量管組 樣品10 倍系列稀釋方法:吸取樣品1 mL 加入9 mL 稀釋液中。依據(jù)《常用玻璃量器》(JJG 196-2006),1 mL(具0.01 mL 刻度),容量允差為±0.008 mL。取矩形分布,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    相對(duì)不確定度為:

    10 mL 吹出式(A 類(lèi))分度吸量管容量允差為±0.05 mL,取矩形分布,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    相對(duì)不確定度為:

    該過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度U稀釋依據(jù)泊松關(guān)于微生物培養(yǎng)產(chǎn)生的不確定度定量測(cè)定理論中的公式計(jì)算:

    因樣品的梯度稀釋方法相同,則=k×,k為10 倍系列梯度稀釋的次數(shù),本試驗(yàn)中雙歧桿菌計(jì)數(shù)的稀釋倍數(shù)是108,則k=7。

    2)移液器組 根據(jù) 《移液器檢定規(guī)程》(JJG 646-2006)規(guī)定,100~1 000 μL 移液器吸取1 000 μL 時(shí)容量允差為±1 000 μL×1.0%=0.01 mL,取矩形分布,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    相對(duì)不確定度為:

    10 mL 吹出式(A 類(lèi))分度吸量管容量允差為±0.05 mL,取矩形分布,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    該過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度U稀釋依據(jù)泊松關(guān)于微生物培養(yǎng)產(chǎn)生的不確定度定量測(cè)定理論中的

    公式計(jì)算:

    2.3.2.3 加樣過(guò)程引入的不確定度

    1)吸量管組 用吸量管吸取1 mL 樣品稀釋液加入平板,加樣引入的相對(duì)不確定度等同于稀釋樣品過(guò)程中吸取1 mL 產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。

    U(1mL)=0.0046,U加=0.0046

    2)移液器組 用移液器吸取1 mL 樣品稀釋液加入平板,加樣引入的相對(duì)不確定度等同于稀釋樣品時(shí)吸取1 mL 產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。

    U(1ml)=0.0058,U加=0.0058

    2.3.3 合成不確定度

    2.3.3.1 吸量管組 雙歧桿菌計(jì)數(shù)的合成相對(duì)不確定度為:

    則合成不確定度為:

    2.3.3.2 移液器組 雙歧桿菌計(jì)數(shù)的合成相對(duì)不確定度為:

    則合成不確定度為:

    2.3.4 擴(kuò)展不確定度 測(cè)定結(jié)果按正態(tài)分布估計(jì),置信水平為95%時(shí),包含因子k=2。擴(kuò)展不確定度可由合成不確定度乘以包含因子獲得,U吸量管=2×0.14=0.28,U移液器=2×0.18=0.36。

    2.3.5 不確定度結(jié)果計(jì)算 當(dāng)包含率在95%時(shí),保健食品樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U吸量管為0.28,X=±U吸量管。以吸量管作為稀釋和加樣量具,樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)X值區(qū)間為9.35~9.91。取反對(duì)數(shù)后,其取值為(2.2~8.1)×109CFU/g,樣品雙歧桿菌總數(shù)的置信區(qū)間為(2.2~8.1)×109CFU/g。同樣,以移液管作為稀釋和加樣量具,樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)X值區(qū)間為9.43~10.15。取反對(duì)數(shù)后,其取值為(2.7~14)×109CFU/g,樣品雙歧桿菌總數(shù)的置信區(qū)間為(2.7~14)×109CFU/g。

    2.4 數(shù)據(jù)分析

    2.4.1 兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果(對(duì)數(shù)值)的影響 使用MATLAB 軟件對(duì)吸量管組和移液器組雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值(見(jiàn)表1、表2)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。ANOVA 箱形圖見(jiàn)錯(cuò)誤! 未找到引用源。ANOVA 計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖2,結(jié)果中P=1.2816×10-4,證明兩組數(shù)據(jù)差異非常明顯。

    圖1 ANOVA 箱形圖Fig.1 ANOVA boxplot

    圖2 MATLAB 軟件中ANOVA 分析結(jié)果Fig.2 ANOVA result from the MATLAB analysis

    表1 吸量管組雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果(×108 CFU/g)Table 1 Counting result of the Bifidobacterium using pipette(×108 CFU/g)

    表2 移液器組雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果(×108 CFU/g)Table 2 Counting result of the Bifidobacterium using micropipettor(×108 CFU/g)

    2.4.2 兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果不確定度的影響 除A 類(lèi)不確定度外,吸量管組樣品稀釋和加樣引入的不確定度以及置信區(qū)間均略小于移液器組。

    表3 兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果不確定度的影響Table 3 The influence of the two different tools to the uncertainty of counting the Bifidobacterium

    3 討論

    依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》(GB 4789.35-2016)[9]對(duì)益生菌類(lèi)保健食品中的雙歧桿菌計(jì)數(shù),其中樣品稀釋和加樣既可使用1 mL 吸量管也可使用微量移液器。由于益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌的數(shù)量較大,稀釋倍數(shù)大,因此引入的不確定度均較大。稀釋過(guò)程中使用吸量管與移液器相比,使用吸量管帶入的不確定度略小,且使用吸量管對(duì)加樣過(guò)程帶入的不確定度、合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度均略小,而使用吸量管對(duì)A 類(lèi)不確定度的影響比使用移液器略大。另外,使用兩種量具對(duì)同一益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果差異顯著。應(yīng)進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因,使用哪種量具計(jì)數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確,以及如何縮小或消除這種差異。

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