不同添加劑對酪蛋白可食膜理化性質(zhì)的影響

穆凱宇，楊昱姝，劉佳欣，孫嘉臨，陳文章，劉學波，劉夫國

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院 陜西楊凌 712100）

近年來，塑料包裝薄膜被廣泛應用于食品包裝領域。由于其主要成分是不可再生的石油基材料，需要很長時間才能被自然降解，因此帶來了嚴重的環(huán)境污染問題。與此同時，塑料包裝薄膜還存在一定的安全問題，例如，塑料膜中使用的鄰苯二甲酸酯類增塑劑可能會滲出到食品中而污染食品，對人體健康產(chǎn)生危害。目前，以可降解、可食用的生物大分子成分（例如：蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)）為主要原料來制備可食用薄膜成為食品包裝領域的研究熱點。生物聚合物可食膜具有減少或完全替代某些傳統(tǒng)聚合物包裝材料的潛力。生物聚合物材料較傳統(tǒng)塑料包裝材料具有更高的安全性[1]。

來自動、植物資源的多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)化合物可用于制備可食用薄膜。天然蛋白質(zhì)因出色的功能特性而成為生產(chǎn)食品包裝薄膜的理想選擇[2]。蛋白質(zhì)中，酪蛋白具有很高的營養(yǎng)價值，優(yōu)異的水溶性和乳化能力，是制備可食膜的理想基質(zhì)材料[3-6]。蛋白質(zhì)可食用膜還具有良好的機械性能、透明性以及出色的氧氣和二氧化碳阻隔能力，在食品包裝生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景[7-8]。然而，相比于合成聚合物包裝材料，單一酪蛋白膜不能提供較高的機械強度。為了強化其性能，采用物理或化學處理的方法，促使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)，修飾聚合物網(wǎng)絡，以達到改善蛋白膜性能的目的。此外，將兩種或多種聚合物共混制膜也是改善薄膜物理、化學性質(zhì)的方法之一。例如：明膠/殼聚糖膜[9]、殼聚糖/明膠/聚乙烯醇膜[10]和殼聚糖/綠茶提取物膜[11]等。

據(jù)報道，通過添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG 酶）可以改善蛋白膜的物理性能，且產(chǎn)品具有較高的安全性[12]。在蛋白基質(zhì)中添加多糖，也可使膜性能增強。其中，應用較多的是殼聚糖，其具有良好的生物相容性和可生物降解性，較高的親水性和生物黏附性。EGCG 作為一種酚類化合物，其具有抗氧化活性和抑菌性[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可改善殼聚糖的乳化活性和抗氧化活性[15]。根據(jù)以上研究，本試驗選用酪蛋白作為成膜基質(zhì)，添加酶（TG酶）、多糖（殼聚糖）及多酚（EGCG）制備復合膜，對膜的厚度、色度、透明度、機械強度、抗氧化及微觀形態(tài)進行表征，確定復合膜的最佳成膜配方，為開發(fā)新型可食包裝膜提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白，北京奧博星生物技術有限公司；TG酶，江蘇一鳴生物股份有限公司；殼聚糖（CS），Sigma 公司；EGCG，北京北實縱橫科技有限公司；DPPH，上海麥克林生物化學有限公司；丙三醇、氫氧化鈉、乙酸等均為分析純級，陜西楊凌新三力化玻站。

納米激光粒度儀（ZEN3600），英國馬爾文儀器有限公司；物性測定儀 （TA.XT PLUS），英國Stable Micro systems 公司；色度儀（Ci7600），美國愛色麗（上海）色彩科技有限公司；掃描電子顯微鏡（S-3400N），日本日立公司；分光測色儀器（CS-820），中國杭州彩譜科技有限公司；數(shù)顯千分測厚規(guī)（0-10X30），中國浙江德清盛泰芯電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酪蛋白溶液的制備 將10 g 酪蛋白粉末分散于90 mL pH 9 的NaOH 水溶液中，在室溫連續(xù)攪拌40 min 使其充分溶解。將分散好的溶液于功率450 W 條件下超聲處理80 min，使酪蛋白水合程度顯著提高。純酪蛋白膜性質(zhì)較差，取3 g 丙三醇加入膜溶液中[16]，用于增強蛋白膜性能，使其在磁力攪拌條件下均勻分散在酪蛋白溶液中。將制備好的酪蛋白溶液（10%）置4℃冰箱中備用。

1.2.2 酪蛋白復合膜液的制備 為制備不同材料的膜，首先配制不同的膜液，不同樣品的成分及添加量見表1。樣品縮寫名稱的具體含義為：酪蛋白組即對照組（CA）；添加EGCG 組（CAEG）；添加TG 酶組（CATG）；添加殼聚糖組（CACS）；同時添加TG 酶和EGCG 組（CATE）；同時添加EGCG 和殼聚糖組（CAEC）。每組樣品制備方法如下：

表1 酪蛋白復合膜溶液配方Table 1 Formulations used in casein composite films

1） 酪蛋白組即對照組（CA） 在后期蛋白質(zhì)溶液與添加劑混合的過程中，有水的引入，故為了控制變量，在原先制得溶液的基礎上加入等體積的水，充分混合，得到酪蛋白樣品溶液（5%），儲存?zhèn)溆谩?/p>

2） 添加TG 酶組（CATG） 酶添加量過高會導致酪蛋白迅速交聯(lián)，造成空間位阻，而TG 酶/酪蛋白比例超過10 U/g 時，對TG 酶催化聚合酪蛋白的影響不大。催化酪蛋白聚合所需酶量可選擇10～20 U/g[17]。通過濃度梯度預試驗，得出TG 酶添加量10 U/g 時，制得樣品最佳。取制備好的酪蛋白溶液，向其中加入TG 酶樣品，使酶濃度為10 U/g，并向其中添加等體積的水，充分混合，在50 ℃情況下孵育60 min，得CATG 樣品溶液，儲存?zhèn)溆谩?/p>

3） 添加EGCG 組（CAEG） 在酪蛋白樣品中加入基于酪蛋白質(zhì)量分數(shù)1%的EGCG，添加EGCG 后，向其中添加等體積的水，充分混合，將樣品避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

4） 添加殼聚糖組（CACS） 取0.2 g 殼聚糖加入100 mL 體積分數(shù)1%的冰乙酸水溶液中，磁力攪拌至溶解，調(diào)節(jié)溶液pH 5～6，取50 mL 酪蛋白溶液與50 mL 0.1%殼聚糖、冰乙酸溶液1∶1 混合，采用調(diào)溫磁力攪拌器攪拌均勻，備用。

5） 添加TG 酶和EGCG 組（CATE） 在CATG組的基礎上，按照CAEG 組添加EGCG 的方法加入EGCG，添加EGCG 后，將樣品置避光條件貯存?zhèn)溆谩?/p>

6） 添加EGCG 和殼聚糖組（CAEC） 在CAEG組的基礎上，按照CACS 組的方法加入殼聚糖，混合后攪拌均勻的樣品置避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

7） 添加TG 酶和殼聚糖組（CATC） 在CATG組的基礎上，按照CACS 組添加CS 的方法加入殼聚糖，混合后攪拌均勻的樣品避光貯存?zhèn)溆?。由于后續(xù)成膜過程中，該組膜液樣品烘干所得膜樣品不均一，顆粒聚集懸于表面，成膜效果較差，因此后續(xù)試驗中未作分析討論。

1.2.3 酪蛋白膜液粒徑和電位的測定 基于Chen 等[18]的方法，測定不同膜液的粒徑和ζ-電位。采用ZEN3600 納米激光粒度儀測量粒徑。將復合蛋白溶液用去離子水稀釋100 倍，取1 000 μL 稀釋的樣品，加入粒徑池中，運行程序測量。記錄3 次測量的平均值。另取870 μL 稀釋的樣品，放入電位池中，運行程序測量。

1.2.4 復合膜的制備 分別取經(jīng)不同添加劑處理的復合酪蛋白溶液每組20 mL，倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿（8 cm）中，在（30±1.0）℃烘箱中處理8 h，烘干后樣品在室溫（20 ℃，60%濕度）平衡48 h，對其性能進行表征。

1.2.5 蛋白膜厚度的測定 取平衡后的膜樣品，用電子厚度測量儀測量厚度。根據(jù)薄膜樣品中5個不同位置處的測量值計算平均厚度。

1.2.6 酪蛋白膜的不透明度測定 將待測樣品裁成10 mm×50 mm 的矩形，貼于比色皿內(nèi)側(cè)，用紫外分光光度計，在波長600 nm 處測定OD 值，以空比色皿作對照。不透明度計算公式如下：

式中，T600nm——膜在波長600 nm 處的透過率（%）；X——膜的厚度（mm）。

1.2.7 酪蛋白膜的色度測定 采用色度儀測定膜的色度，儀器設定為透射測量模式，將薄膜固定在透射測量位置。以儀器所配備的白板作為對比板進行測量，計算L*，a*和b*。每組測量5 次，試驗結(jié)果以平均值表示。

顏色變化（ΔE）計算公式：

式中，L*——亮度。當L*值為正時，顏色偏白，反之顏色偏黑；當a*值為正時，顏色偏紅，反之顏色偏綠；當b*值為正時，顏色偏黃，反之則偏藍。

1.2.8 膜的機械性能測定 將膜樣品切成1 cm×6 cm 的長條。將平衡后的膜條安裝在TA.XT PLUS 物性測定儀的夾具中，夾具間隔30 mm，以3.00 mm/s 移動拉伸速度對膜樣品進行測試。根據(jù)所測力-變形數(shù)據(jù)繪制應力-應變曲線，得到薄膜的拉伸強度和薄膜斷裂伸長率。每個樣品測量5次，結(jié)果以平均值表示[19]。

1.2.9 膜的水蒸氣透過率（WVP）測定 通過重量分析法[20]改良測定WVP，將待測薄膜放在存有KNO3飽和溶液的蒸發(fā)皿中，提前室溫平衡48 h。在50 mL 離心管中加入5 g 干燥CaCl2，將樣品覆蓋在離心管口密封，放入存有飽和KNO3溶液的密閉容器中。放置48 h 后稱量離心管及CaCl2質(zhì)量。計算其增加的質(zhì)量，確定CaCl2所吸收的水分。根據(jù)公式（3）計算WVP。

式中，WVP——水蒸氣透過率 （g·mm/m2·d·kPa）；M——離心管和CaCl2增加的質(zhì)量（g）；L——膜厚度（mm）；t——測試時間（d）；A——膜的測試面積（m2）；ΔP——膜內(nèi)外水蒸氣壓差，1.268 kPa。

1.2.10 DPPH 自由基清除率的測定 取每種膜樣品20 mg 加到5 mL 甲醇中，25 ℃溶解12 h，得到膜提取液。將200 μL 膜提取溶液與2 mL DPPH 溶液（0.025 g/L）混合，在環(huán)境溫度下避光保存30 min。使用紫外分光光度計測量其在波長517 nm 處的吸光度。根據(jù)吸光度計算其DPPH 自由基清除率：

式中，A0——空白對照組在波長517 nm 處的吸光度；A——添加膜液的樣品組的吸光度[21]。

1.2.11 掃描電子顯微鏡圖像分析 （SEM） 采用SEM 捕獲膜的表面和橫截面圖像。將膜樣品凍干處理后，用導電膠帶將其固定在觀察臺上，經(jīng)離子濺射儀噴金。使用15.0 kV 電壓，2 000 放大倍數(shù)觀察正面，300～350 放大倍數(shù)觀察側(cè)截面，探究其微觀結(jié)構(gòu)形貌。

1.2.12 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 8.5 軟件繪圖，SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以“±s”表示，當P＜0.05 時差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品膜液的粒徑和電位分析

膜溶液顆粒大小影響微粒間的作用及溶液烘干成膜的結(jié)構(gòu)。由圖1粒徑分析可得，與CA 組對比，每種添加劑的引入對于粒徑都有顯著的影響（P<0.05），其中，CATG 組的粒徑最大。TG 酶能催化?；D(zhuǎn)移反應，在蛋白質(zhì)、多肽及伯胺之間形成共價鍵。如果蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基作為?；荏w，那么在分子間及分子內(nèi)會形成ε-（γ-Glu）-Lys 鍵[22]，形成粒徑較大的顆粒結(jié)構(gòu)。CACS組也有較大的粒徑，殼聚糖和酪蛋白分別帶正電荷和負電荷，因此這兩種聚合物間的作用可能是通過靜電作用發(fā)生的[23]。而CAEG 組粒徑明顯減小，EGCG 與酪蛋白發(fā)生非共價和共價結(jié)合，酪蛋白結(jié)構(gòu)中的疏水性殘基和脯氨酸為茶多酚的強烈絡合提供位點，形成非共價復合物，而茶多酚的氧化和親核加成過程可促進茶多酚和蛋白質(zhì)之間不可逆的共價締合[24]。具有較高親水性EGCG 的結(jié)合促進了酪蛋白的分散，故粒徑最小。由于EGCG與殼聚糖復合可以提高殼聚糖的乳化活性，使殼聚糖更容易吸附到酪蛋白上[15]。故與CA 組相比，CAEC 組粒徑顯著升高。

圖1 不同添加劑對酪蛋白復合溶液粒徑的影響Fig.1 Effects of different additives on particle size of casein complex solution

各添加劑帶有不同的電荷，可通過改變分子間靜電排斥力而影響膜的結(jié)構(gòu)[25]。液滴的電荷在分散體系穩(wěn)定性方面起重要作用，液滴之間的靜電排斥可防止液滴的聚集。電位絕對值增加，粒子之間的靜電排斥力增加，系統(tǒng)相對穩(wěn)定[26]。由圖2可知，各組相較于CA 組變化較為顯著（P<0.05），其中CATG 組電位絕對值最小，表明顆粒間的靜電斥力最小。CACS 組電位值較CA 組更低，通常殼聚糖溶液的電位在酸性條件下為正，在一些特定的pH 值，如pH 6～6.5 時，氨基的電荷損失會使殼聚糖電位變負[23]，同時CATE、CAEC 組電位較低，說明EGCG 的引入使得復合物的電荷降低?？傮w來說，靜電排斥效果會使膜溶液中粒子分布更加均勻，影響其成膜后的物理特性。

圖2 不同添加劑對酪蛋白復合溶液電位的影響Fig.2 Effects of different additives on the potential of casein complex solution

2.2 不同膜樣品的厚度、色度、不透明度分析

膜的厚度取決于成膜溶液基質(zhì)中溶劑的組成和濃度。由表2可知，復合膜的厚度為150～200 μm，各組之間差異較為顯著（P<0.05）。對比發(fā)現(xiàn)，添加TG 酶的復合膜較厚（204 μm），可能是由于酶交聯(lián)提高了蛋白質(zhì)的聚集程度。而添加CS 和EGCG 的復合膜較薄，主要是因為引入EGCG 降低了膜液的粒徑，粒子的結(jié)構(gòu)變??；引入CS 使得粒子間通過交聯(lián)作用形成更加致密的結(jié)構(gòu)，粒子與粒子的間隙更小，因而總的縱向空間體積較小。

膜的光學特性在食品包裝的生產(chǎn)中尤其重要，因為它會影響消費者對食品的接受度[27]。CAEG、CATG 和CATE 3 組的a*值均為負值，且相較于其它組a*絕對值更小，因此綠色較其它組弱。僅添加EGCG 的CAEG 組b*值最大，幾乎為零，相較于其它組，發(fā)黃趨勢更為明顯。綜合顏色變化可知，摻入酚類化合物的蛋白膜相比于未摻入酚類化合物的膜呈現(xiàn)更暗的顏色，且相較于CA組差異較大（P<0.05）。一方面可能是因為引入的酚類氧化成醌類物質(zhì)，使薄膜顏色變暗。另一方面是因為添加酚類物質(zhì)后，光會被形成的交聯(lián)結(jié)構(gòu)散射和折射，從而產(chǎn)生較暗的視覺感受[28]，在光敏感食品上有著良好的應用。

對許多應用于食品的包裝薄膜來說，薄膜的不透明度是重要的參數(shù)。不透明度數(shù)值越高，透明性越差。如表2所示，與對照組相比，單獨添加TG酶和殼聚糖的兩組樣品相較于CA 組的不透明度有明顯上升（P<0.05），可能是由于蛋白質(zhì)-酶和蛋白質(zhì)-多糖相互作用，形成了更多的聚集體，使光不易通過。另外，蛋白質(zhì)和添加劑的相互作用使膜厚度增加，也使其不透明度上升。添加EGCG 的3組樣品中，只添加EGCG 的樣品不透明度數(shù)值最小，即透明性最好。主要原因是引入EGCG 使樣品粒徑更小，形成更加均勻的結(jié)構(gòu)，且樣品厚度均較小，光線容易透過，表現(xiàn)出較好的光透過性。

表2 不同添加劑對酪蛋白復合膜厚度、色度和不透明度的影響Table 2 Effects of different additives on the thickness，chromaticity and opacity of casein composite films

總體來說，與對照組相比，添加TG 酶和殼聚糖導致薄膜厚度增加，不透明度也增加，而引入EGCG 導致膜厚度減小，薄膜色澤較暗，透明性較好。

2.3 不同膜樣品的機械性能分析

機械性能對食品包裝材料至關重要。良好的機械性能是保證包裝產(chǎn)品完整性的前提[29]。本實驗通過測量樣品的拉伸強度和斷裂伸長率來確定不同添加劑對酪蛋白復合膜機械性能的影響。

由圖3可知，6 組樣品都有良好的拉伸強度，這與酪蛋白性質(zhì)及甘油的引入有關。在復合膜中，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間通過氫鍵、疏水相互作用以及二硫鍵結(jié)合發(fā)生相互作用[30]，使膜具有一定的穩(wěn)定性，其中添加甘油賦予薄膜一定的柔韌性和延展性。相較于CA 組，經(jīng)不同添加劑處理的蛋白膜的拉伸強度都有一定程度的增強（P<0.05）。對比分析CA 組與CATG、CAEG 和CACS 組發(fā)現(xiàn)，TG酶、EGCG 和殼聚糖的單獨引入都會使復合膜的拉伸強度增強，且引入殼聚糖的綜合效果最佳。由于拉伸強度不是簡單地隨添加劑的引入而疊加，加入TG 酶和EGCG 的CATE 組的性能雖強于CA 組，但其拉伸強度低于TG 酶和EGCG 單獨與酪蛋白作用帶來的提升。CAEC 組的拉伸強度也較高，說明在EGCG 存在的條件下，殼聚糖仍起主要作用。

圖3 不同添加劑對酪蛋白復合膜拉伸強度的影響Fig.3 Effects of different additives on tensile strength of casein composite films

圖4顯示復合膜的斷裂伸長率。與CA 組相比，CATG 組略微增強，CAEC 組的變化不大，其余組均有一定程度的下降，可能是引入TG 酶使蛋白膜發(fā)生分子交聯(lián)，其結(jié)構(gòu)更為復雜和緊密。樣品中只添加EGCG 和殼聚糖兩組的斷裂伸長率均明顯下降（P<0.05），可能是由于拉伸強度增強的同時，堅韌的材料在受到縱向剪切力時變得酥脆易斷。而同時添加EGCG 和TG 酶的CATE 組斷裂伸長率最低，可能是因為EGCG 的加入使得TG酶催化作用下蛋白質(zhì)間形成的多孔交聯(lián)結(jié)構(gòu)被填補，使充滿孔洞的結(jié)構(gòu)變成密集緊實，進而變得酥脆。而添加EGCG 和殼聚糖的CAEC 組斷裂伸長率下降不大，可能是由于引入帶正電的殼聚糖使得EGCG 與酪蛋白相互作用得到改善，保留了蛋白膜的韌性。

圖4 不同添加劑對酪蛋白復合膜斷裂伸長率的影響Fig.4 Effects of different additives on elongation at break of casein composite films

綜上所述，在膜樣品中添加一些化合物可能會提高膜樣品的機械性能，也可能因添加的化合物與酪蛋白的相互作用而降低膜樣品的機械性能。當部分樣品的拉伸強度增強時，斷裂伸長率可能會大幅度下降，因此在選擇材料時，拉伸強度最強不代表材料的綜合性能最好。綜合比較6 種薄膜的拉伸強度和斷裂伸長率，得出CAEC 組的拉伸強度較CA 組明顯提高的同時，也具有良好的斷裂伸長率，綜合機械性能最佳。

2.4 不同膜樣品的水蒸氣透過率分析

為了防止或減少食品的脫水，用作包裝或涂層的薄膜必須控制水分從產(chǎn)品到環(huán)境的傳輸，因此可食用薄膜的水蒸氣透過率應盡可能低[31]。薄膜的組成和結(jié)構(gòu)是影響水蒸氣透過率的最重要因素。水蒸氣透過率的數(shù)值越高，膜樣品的水阻隔性能越差。如圖5所示，與對照組相比，添加EGCG組水蒸氣透過率都有一定程度的降低，而單獨添加TG 酶和殼聚糖的樣品水蒸氣透過率都呈升高的現(xiàn)象。添加TG 酶的CATG 組水蒸氣透過率數(shù)值顯著升高（P＜0.05）。在分別添加TG 酶和殼聚糖的基礎上，添加EGCG 的CATE 組和CAEC 組的水蒸氣透過率均降低，其中CAEC 組的水蒸氣透過率最低。

研究表明，添加酚類物質(zhì)后薄膜更堅固，柔韌性更差，可能產(chǎn)生更多的多孔結(jié)構(gòu)，從而促進水分子的遷移[32]。然而，如圖5所示，添加EGCG 組的水蒸氣透過率較低，其原因可能是EGCG 具有較多羥基，與蛋白質(zhì)之間形成氫鍵，密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以減少聚合物基質(zhì)的自由體積，并增加水分子通過網(wǎng)絡的曲折度，從而降低水分子通過薄膜的擴散速率[33]。添加TG 酶的膜相對于未添加的膜水蒸氣透過率明顯增加，可能是因為經(jīng)TG 酶催化，膜的內(nèi)部發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)，形成較大的孔徑。添加TG 酶的同時加入EGCG，可在原有基礎上對膜進行修飾。相比于CATG 組，CATE 組具有較低的水蒸氣透過率，可能是引入多酚填補了CATG 膜上因交聯(lián)形成的孔隙。添加殼聚糖的膜樣品水蒸氣透過率變化率不大，這可能是由于一方面CACS膜液粒徑較CA 組有所增加，其成膜孔隙隨之增大，另一方面復合物靜電結(jié)合使得膜變得致密，兩方面綜合作用使CACS 水蒸氣透過率變化不大。添加殼聚糖和EGCG 的膜樣品水蒸氣透過率最低，可能是由于添加EGCG 改善了殼聚糖的乳化活性[15]。經(jīng)多糖和多酚共同作用，膜樣品更加緊密。

圖5 不同添加劑對酪蛋白復合膜水蒸氣透過率的影響Fig.5 Effects of different additives on water vapor permeability of casein composite films

分析得出，TG 酶在催化蛋白交聯(lián)的同時，形成較多的大孔隙結(jié)構(gòu)，引起水蒸氣透過率的增加。引入EGCG 形成CA-EGCG 復合結(jié)構(gòu)，增加了水蒸氣透過的曲折度，降低了水蒸氣透過率。單獨引入殼聚糖的對水蒸氣透過率的影響不大。EGCG和殼聚糖混合后可以改善乳化活性，在EGCG 與殼聚糖的綜合影響下，CAEC 組的水蒸氣透過率最低，阻隔效果最好。

2.5 不同膜樣品的DPPH 自由基清除活性分析

為了對比不同蛋白質(zhì)膜樣品的DPPH 自由基清除活性，將每種膜樣品浸于甲醇中，獲得提取液，測定不同樣品的DPPH 自由基清除能力，結(jié)果如圖6所示。各組膜樣品均具有一定的DPPH 自由基清除能力，相較于CA 組，各組抗氧化能力均有較為明顯的提升（P＜0.05）。CAEG 組具有較強的自由基清除能力，這是因為其中含有EGCG。EGCG 具有較強的自由基清除活性，能夠螯合金屬離子。同樣CAEC 組也顯現(xiàn)出較強的自由基清除能力，其低于CAEG 組，原因可能為引入殼聚糖后有一定的屏蔽作用，使得EGCG 暴露面積小于CAEG 組。雖然殼聚糖也具有一定的抗氧化能力，但是其清除DPPH 自由基的作用較弱[26]。

圖6 不同添加劑對酪蛋白復合膜DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of different additives on DPPH radical scavenging rate of casein composite films

2.6 復合膜的微觀圖像分析

為了探究膜樣品的微觀形貌，分析了膜樣品表面和側(cè)截面的電鏡照片。如圖7所示，CA 組可觀察到大量的氣孔，因此水蒸氣透過率較大。通過截面圖可看出其結(jié)構(gòu)較為均勻，相對于其它膜，拉伸強度較低。單獨添加TG 酶、EGCG 和殼聚糖的3 組，都有一定的交聯(lián)組織結(jié)構(gòu)，其機械強度和阻水性能都有一定的提升，CATE 組中，TG 酶的催化使得膜內(nèi)部形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，EGCG 的引入使TG 酶催化形成的縫隙孔徑得以補充，形成緊密的結(jié)構(gòu)，因此CATE 組的側(cè)截面比CA 組更加均勻、平整，結(jié)構(gòu)韌性更差，更酥脆，斷裂伸長率更低。CAEC組的截面圖具有線性和網(wǎng)狀等復雜結(jié)構(gòu)，在具有一定的機械強度的同時具有良好的斷裂伸長率。

圖7 不同添加劑的酪蛋白復合膜在2K 放大倍數(shù)下的平面以及300 放大倍數(shù)條件下的截面電鏡照片F(xiàn)ig.7 Planar electron microscopy at 2K magnification and cross section electron microscopy at 300 magnification of casein composite films with different additives

膜截面示意圖如圖8所示，不同的形狀代表不同的物質(zhì)。CA 組酪蛋白分子間帶相同電荷，存在靜電斥力，分布趨向于均勻。添加TG 酶的CATG 組，酪蛋白受酶的催化作用，蛋白分子間結(jié)合，形成聚合結(jié)構(gòu)，分子間空隙增多、增大，機械強度增強。CAEG 組由于引入EGCG，酪蛋白分子間的縫隙被填補，水蒸氣透過率下降，機械強度增強，然而由于分子間較強的作用，導致空隙過少，形變空間較少，膜結(jié)構(gòu)酥脆易斷。CACS 組由于引入殼聚糖，多糖與蛋白結(jié)合形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，在提升水阻隔性能和拉伸強度的同時，對膜的韌性無太大損害。CATE 組與CACS 組厚度相似，具有較高的機械強度。CAEC 組性能最佳，圖形的重疊程度表示交聯(lián)程度，EGCG 的引入改善了殼聚糖的乳化活性，使殼聚糖與酪蛋白的反應程度加深，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅水蒸氣阻隔能力最佳，而且抗拉伸強度和韌性也較優(yōu)良。

圖8 添加劑與酪蛋白作用后形成膜樣品的截面示意圖Fig.8 A cross-sectional diagram of the film samples formed by interaction between additives and casein

3 結(jié)論

以酪蛋白為基底構(gòu)建可食膜，通過添加TG酶、EGCG 和殼聚糖對酪蛋白膜進行改性，測量膜液的粒徑和電位，復合膜的表觀結(jié)構(gòu)、水蒸氣透過率、機械性能和自由基清除能力。結(jié)果表明，TG 酶通過催化酪蛋白形成分子間共價鍵，從而提升酪蛋白膜的機械性能，然而催化的同時形成較多的空隙，使得復合膜的水阻隔性能下降。帶正電的殼聚糖與帶負電的酪蛋白通過靜電作用相結(jié)合，制得的復合膜拉伸強度和韌性均大幅提升，水阻隔能力有所提升。EGCG 與酪蛋白通過共價和非共價方式結(jié)合，使得復合膜較為致密，抗拉伸性能大幅提升，水蒸氣阻隔能力上升，然而其結(jié)構(gòu)過于致密，韌性變差，彎折易碎。同時添加EGCG 和CS 的CAEC 組，改善了CAEG 組膜樣品的結(jié)構(gòu)過于緊密的情況，使其具有較高拉伸強度的同時，又具有良好的韌性。殼聚糖和EGCG 均具有一定的抗氧化能力，在食品包裝方面有一定的優(yōu)勢。經(jīng)綜合比較，CAEC 膜的綜合性能最佳，在食品包裝領域具有應用優(yōu)勢。