α-亞麻酸對(duì)高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病模型小鼠的降血糖作用

常松林，高曉余，柳雙鳳，孫 娜，董文明，田 洋，4*

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明 650201 2 食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程中心 昆明 650201 3 云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650201 4 云南省藥食同源功能食品工程研究中心 昆明 650201 5 云南高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院 昆明 650201）

糖尿病是一種在全球范圍迅速發(fā)展的代謝性疾病，Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90%以上[1]。Ⅱ型糖尿病發(fā)病率的上升與高度加工的食品相關(guān)[2]。藥物治療是糖尿病患者的常見選擇[3]。口服降糖藥可在一定程度上調(diào)節(jié)血糖，而多數(shù)藥物在治療的同時(shí)伴隨著一些不良影響，如體重增加、腹瀉、惡心、腹脹、酸中毒、胃腸功能紊亂、肝細(xì)胞和膽汁淤積性肝損傷等[4-5]。流行病學(xué)研究表明，Ⅱ型糖尿病在很大程度上可以通過改變飲食和生活方式來預(yù)防。從食品資源中尋找具有降糖作用的活性組分，是食品科學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域長(zhǎng)期以來的研究熱點(diǎn)。

α-亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA）是人體維持健康所必需的一種不飽和脂肪酸，具有多種營(yíng)養(yǎng)保健和藥理作用，主要包括心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎和抗氧化等作用[6]。關(guān)于富含ALA 的飲食攝入與糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究已有諸多報(bào)道。在臨床研究中，2019年我國的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究顯示：n-3 PUFA 的低攝入量可能與較高的Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[7]。上海女性[8]、新加坡華人[9]、日本男性[10]隊(duì)列研究顯示，攝入較多富含n-3 PUFA 的魚類等海產(chǎn)品與Ⅱ型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。隨機(jī)對(duì)照研究顯示，富含n-3 PUFA 的魚油及紫蘇油在Ⅱ型糖尿病合并血脂異常人群糖代謝方面均有改善作用[11-12]。Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型研究也表明，富含ALA 的飲食可改善糖尿病小鼠高血糖[13]、高甘油三酯血癥[14]。富含ALA 的飲食對(duì)糖尿病具有諸多顯著有益作用，而這些研究很難直接證明單體ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的有益作用。目前系統(tǒng)的文獻(xiàn)調(diào)研未見關(guān)于單體ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血糖改善作用的報(bào)道。為此，本研究在高脂飼料結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立的Ⅱ型糖尿病小鼠模型中探究ALA的降血糖作用，旨在為ALA 輔助降血糖相關(guān)保健食品的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-亞麻酸（純度97%），上海鼓臣生物技術(shù)有限公司。

雄性C57BL/6J 小鼠（體質(zhì)量16～20 g），成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2015-0001）；基礎(chǔ)飼料（LAD3001M）、高脂飼料（TP23400，60%熱量來自脂肪），南通特洛非飼料科技有限公司。

鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美國Sigma公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）測(cè)定試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；胰島素（Insulin，INS） 測(cè)定試劑盒，美國ALPCO 公司；總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘 油 三 酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)定量PCR 試劑，寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀（GA3 型），三諾生物傳感股份有限公司；糖化血紅蛋白檢測(cè)儀（博唐平TM A1C EZ），博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀（Flexstatin 型），美國ProteinSimple 公司；LightCyclerR480 II 熒光定量PCR 儀，德國羅氏診斷有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程 適應(yīng)性喂養(yǎng) （24±1）℃、12 h晝/夜循環(huán)，喂養(yǎng)小鼠7 d 后，隨機(jī)取12 只小鼠作為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；其余54 只小鼠飼喂高脂飼料2 周后，兩次腹腔注射85 mg/kg STZ[15]。4 d 后（第21，22 天），連續(xù)2 次測(cè)定小鼠空腹血糖，血糖濃度均大于7.0 mmol/L 即判定為造模成功。剔除造模不成功小鼠后，將48 只小鼠隨機(jī)分為模型組和低、中、高劑量ALA 組（n=12），低、中、高劑量組每天分別灌胃0.25，0.50，1.00 g/kg 的ALA，對(duì)照組和模型組小鼠灌胃無菌水，連續(xù)灌胃42 d。每8 d 測(cè)定1 次小鼠體質(zhì)量，并于第0，21，42，63 天測(cè)定小鼠空腹血糖濃度，于第63 天檢測(cè)各組小鼠的糖化血紅蛋白水平。第64 天犧牲小鼠并采血，分離血清置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。剝離小鼠肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪并稱量，仔細(xì)剝離腸道，測(cè)量小腸、大腸長(zhǎng)度，計(jì)算各臟器指數(shù)。具體的流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experiment process

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.2.1 口服葡萄糖耐量測(cè)定 小鼠隔夜饑餓（12 h） 后灌胃2 g/kg 葡萄糖溶液。分別于0，15，30，60，90，120 min 測(cè)定小鼠血糖濃度，并計(jì)算血糖變化的曲線下面積 （Area under the curve，AUC）。

1.3.2.2 小鼠血清指標(biāo)檢測(cè) 于-80 ℃冰箱中取出保存完好的血清，參照試劑盒說明書測(cè)定血清中LPS、INS、TC、TG、HDL-C、LDL-C 的水平。

1.3.2.3 功能基因檢測(cè) 按照動(dòng)物組織RNA 提取試劑盒說明書提取小鼠肝臟中RNA，測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR 分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立T 檢驗(yàn)（兩尾法），P≤0.05 為差異性顯著，P≤0.01 為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)第40 天后，與對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P≤0.05），與模型組相比，ALA 中劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P≤0.05）。結(jié)果表明ALA 能明顯抑制Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量的增加。

圖2 ALA 對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響（n=10～12）Fig.2 Effect of ALA on body weight in diabetic mice（n=10-12）

2.2 ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，模型組臟器指數(shù)均顯著升高（P≤0.01 或P≤0.05）；與模型組相比，ALA 高劑量組肝臟、附睪脂肪指數(shù)顯著降低（P≤0.05），中劑量組腎周脂肪、附睪脂肪指數(shù)顯著降低（P≤0.05）；此外，中劑量組大腸、腸道全長(zhǎng)指數(shù)顯著下降（P≤0.05），而高劑量組小腸、大腸、腸道全長(zhǎng)指數(shù)均顯著下降（P≤0.05）；表明ALA 具有改善Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的作用。

表2 ALA 對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響（n=10～12）Table 2 Effect of ALA on organ index in diabetic mice （n=10-12）

2.3 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平

由圖3a 可知，在ALA 干預(yù)期間 （第21～63天）模型組的空腹血糖濃度持續(xù)上升；與模型組相比，在第42 天時(shí)，低、中、高劑量ALA 組空腹血糖均顯著低于模型組（P≤0.05）；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第63 天）中、高劑量組空腹血糖濃度同樣顯著低于模型組（P≤0.05）。此外，糖化血紅蛋白測(cè)定結(jié)果也表明ALA 可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠干預(yù)期間的血糖狀況，以高劑量的ALA 效果最佳 （圖3b）。

圖3 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平（n=10～12）Fig.3 ALA improved the blood glucose levels in type Ⅱdiabetic mice（n=10-12）

2.4 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性

由圖4a 可知，0 min 時(shí)中、高劑量ALA 組小鼠的血糖濃度顯著低于模型組（P≤0.05）；葡萄糖負(fù)荷15 min 時(shí)，各組小鼠血糖濃度升高達(dá)到峰值，模型組小鼠血糖濃度最高，低、中、高劑量ALA組小鼠血糖濃度明顯低于模型組 （P≤0.05），30 min 時(shí)低、中劑量組血糖濃度與模型組相比具有顯著差異 （P≤0.05），60 min 時(shí)中劑量組血糖濃度與模型組相比具有顯著差異（P≤0.05）。由圖4b 可知，模型組AUC 顯著高于對(duì)照組（P≤0.05），而中劑量組AUC 顯著低于模型組（P≤0.05）。上述結(jié)果表明ALA 可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性。

圖4 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性（n=10～12）Fig.4 ALA can improve glucose tolerance in type Ⅱdiabetic mice （n=10-12）

2.5 ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響

如圖5a 所示，與對(duì)照組相比，模型組的空腹胰島素水平明顯升高（P=0.091）；與模型組相比，中劑量ALA 組胰島素水平明顯降低（P=0.066）；此外，中劑量ALA 顯著抑制了高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(shù)的顯著上升（P≤0.05，圖5b）。結(jié)果表明ALA 可以有效改善Ⅱ型糖尿病小鼠的胰島素抵抗。

圖5 ALA 降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血清胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)（n=8）Fig.5 ALA reduced the insulin level and insulin resistance index in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

2.6 ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖異生作用的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組Glut4的mRNA 表達(dá)水平極顯著下調(diào)（P≤0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量ALA 組對(duì)糖尿病小鼠Glut4的mRNA 表達(dá)水平雖有上調(diào)作用，但差異不顯著（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，模型組G6pc的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P≤0.05）；與模型組相比，ALA 高劑量組G6pc的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P≤0.05）。表明，ALA 可能通過抑制肝臟糖異生來有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平。

圖6 ALA 對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖異生的影響（n=8）Fig.6 Effect of ALA on liver glucose transport and gluconeogenesis in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

2.7 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠代謝內(nèi)毒素血癥及炎癥狀態(tài)

由圖7a 可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的LPS 水平極顯著上升（P≤0.01）；與模型組相比，中劑量ALA 組小鼠的LPS 水平顯著降低（P≤0.05）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA 表達(dá)水平極顯著上調(diào) （P≤0.01）；與模型組相比，高劑量ALA 顯著降低MCP-1、TNF-α 的mRNA 表達(dá)（P≤0.05）。

圖7 ALA 可改善Ⅱ型糖尿病小鼠代謝內(nèi)毒素血癥及炎癥狀態(tài)（n=8）Fig.7 ALA improved the metabolic endotoxemia and inflammation in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

2.8 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂

由圖8a 可知，與對(duì)照組相比，糖尿病模型組小鼠的TG、TC 水平均極顯著升高（P≤0.01），而HDL-C 水平則極顯著下降（P≤0.01）。與模型組相比，中、高劑量ALA 組小鼠的TG、TC 水平顯著降低（P≤0.05）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的Fiaf、LPL、Pparα 的mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P≤0.05）；與模型組相比，高劑量ALA 可顯著增加Pparα 的mRNA 表達(dá)水平（P≤0.05），ALA 對(duì)Fiaf、LPL的mRNA 表達(dá)水平也具有一定的提升作用（圖8b）。上述結(jié)果表明ALA 可改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂。

圖8 ALA 可改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂代謝紊亂（n=8）Fig.8 ALA improved the lipid metabolism disorder in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

3 討論

肥胖、高血糖、高胰島素血癥和高脂血癥是Ⅱ型糖尿病的關(guān)鍵特征。研究中常采用高脂飼料結(jié)合STZ 誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型糖尿病模型[14]。在本實(shí)驗(yàn)的第40 天后，模型組小鼠體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組，表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖導(dǎo)致糖尿病小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，ALA 可以有效減少糖尿病小鼠體質(zhì)量增加（圖2）。有研究發(fā)現(xiàn)富含ALA 的亞麻籽油有助于降低Ⅱ型糖尿病肥胖小鼠的體質(zhì)量[16]，這與本研究結(jié)果一致。

空腹血糖及糖化血紅蛋白是診斷糖尿病的常規(guī)指標(biāo)，與口服葡萄糖耐受量、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)相結(jié)合可反映機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)能力、胰島β 細(xì)胞功能和胰島素敏感性[17]。有研究表明n-3 多不飽和脂肪酸[18]、亞麻籽油[19]可增加胰島素的敏感性，使用低濃度的胰島素可達(dá)到同樣的葡萄糖清除效果。在本研究中，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠的空腹血糖水平、糖化血紅蛋白含量（圖3），顯著改善了葡萄糖耐受不良（圖4）及胰島素抵抗（圖5），研究結(jié)果表明ALA 可改善糖尿病小鼠血糖調(diào)節(jié)能力和胰島素敏感性，降低糖尿病小鼠血糖水平。

器官損傷及脂肪組織積累與糖尿病密切相關(guān)。在本研究中，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠肝臟指數(shù)（表2），進(jìn)而有可能改善了糖尿病小鼠的肝臟功能異常。脂肪過度積累會(huì)導(dǎo)致其功能失調(diào)，胰島素敏感性降低，ALA 顯著改善了糖尿病小鼠附睪脂肪、腎周脂肪沉積的現(xiàn)象（表2）。此外，胃腸道會(huì)分泌各種細(xì)胞因子，不僅促進(jìn)食物消化，還可影響胰島素的釋放和外周組織的胰島素響應(yīng)性。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，糖尿病模型組小鼠腸道指數(shù)顯著增加，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠腸道指數(shù)（表2），推測(cè)ALA 可能通過恢復(fù)腸道長(zhǎng)度進(jìn)而改善胃腸道功能。

肝臟葡萄糖代謝失調(diào)在糖尿病的發(fā)病機(jī)理中起著至關(guān)重要的作用[20]。肝臟是一種胰島素敏感性組織，它通過調(diào)節(jié)葡萄糖利用與糖異生之間的相互作用在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起作用[21]。G6pc基因在肝臟中表達(dá)量的增加會(huì)促進(jìn)非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至血管中提高血糖水平[22]。在本研究中，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠肝臟G6pc的表達(dá)水平（圖6），抑制肝臟糖異生來改善糖尿病小鼠血糖水平。

胰島素抵抗的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)，炎癥因子能干擾胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，也可與氧化應(yīng)激過程相互作用加重胰島素抵抗，而LPS 是炎癥啟動(dòng)的主要誘導(dǎo)因子[23]。MCP-1 是一種將免疫細(xì)胞募集到炎癥部位的蛋白；TNF-α 是一種抑制胰島素分泌并誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡的促炎性細(xì)胞因子，在胰島素的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[24]。研究顯示，抑制MCP-1受體[25]及抑制TNF-α 表達(dá)[26-27]，可改善Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗和肝脂肪變性。另有研究報(bào)道，富含ALA 的亞麻籽油和n-3 PUFA 可影響胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，抑制炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NFκB 的轉(zhuǎn)錄活性，從而減少促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[28-29]。在本研究中糖尿病小鼠血清LPS 水平及肝臟MCP-1、TNF-α、IL-1β 和IL-6的mRNA 表達(dá)水平顯著增加，ALA 干預(yù)42 d 后使糖尿病小鼠血清LPS 水平及炎癥因子MCP-1、TNF-α 的表達(dá)水平顯著降低（圖7），該結(jié)果與上述前人研究結(jié)果基本一致。

血脂紊亂是糖尿病眾多典型并發(fā)癥之一[30]。機(jī)體內(nèi)脂肪代謝與糖代謝有密切關(guān)系，糖尿病患者由于胰島素分泌不足或細(xì)胞對(duì)胰島素作用不敏感，使葡萄糖進(jìn)入肌肉細(xì)胞受阻，從而造成葡萄糖的利用率降低，血糖升高。脂肪分解產(chǎn)生大量游離脂肪酸，血液中存在的大量游離脂肪酸使得肌肉細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗利用度更差，形成糖尿病的惡性循環(huán)[31]。有研究顯示，富含ALA 的亞麻籽油[32]和紫蘇油[33]均可改善糖尿病小鼠的高甘油三酯血癥。在本研究中，ALA 能使糖尿病小鼠血清中TG、TC 含量顯著降低（圖8a）。此外，本研究還檢測(cè)了肝臟中與TG 代謝密切相關(guān)的幾種功能基因的表達(dá)。與模型組相比，ALA 高劑量組表現(xiàn)出較高水平的Pparα 的mRNA 表達(dá)（圖8b），表明ALA 可能通過上調(diào)Pparα 的mRNA 表達(dá)來改善糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝狀態(tài)。

綜上所述，ALA 可能通過抑制肝臟糖異生，降低肝臟組織炎癥，增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來改善糖尿病小鼠高血糖、高脂血癥。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究ALA 降糖、降脂分子機(jī)理研究以及相關(guān)保健食品的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。