繡球菌子實(shí)體單組分多糖結(jié)構(gòu)表征及其免疫活性

郝正祺，劉靖宇，2，孟俊龍，2，常明昌，2，馮翠萍*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷 030801 2 山西省食用菌工程技術(shù)研究中心 山西太谷 030801）

多糖是一類由糖苷鍵聚合形成的生物大分子，主要來源于動(dòng)植物及微生物，在生物體中發(fā)揮著信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)控和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)茸饔肹1]。真菌多糖具有廣泛的生物活性，特別是在免疫調(diào)節(jié)方面，常被作為免疫調(diào)節(jié)劑和抗癌藥物應(yīng)用于臨床治療中[2]。有研究表明，真菌多糖的生物活性與其分子質(zhì)量、分支程度、三螺旋結(jié)構(gòu)、單糖組成和糖苷鍵類型有關(guān)，如高分子質(zhì)量多糖比低分子質(zhì)量多糖具有明顯的抗腫瘤和抗氧化功效；巨噬細(xì)胞分泌NO 能力受多糖化學(xué)組成和糖苷鍵類型的影響等[3-5]。

巨噬細(xì)胞是連接機(jī)體非特異性免疫和獲得性免疫之間重要的橋梁，它不僅吞噬并消化細(xì)胞殘片和病原體，還可以激活淋巴球或其它免疫細(xì)胞，令其對病原體作出反應(yīng)，在宿主的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。巨噬細(xì)胞常被作為評價(jià)活性多糖免疫調(diào)節(jié)特性的理想細(xì)胞模型。

繡球菌（Sparassis latifolia），又名繡球菇、繡球蕈，是一種珍稀名貴的食藥用真菌，具有豐富的礦物質(zhì)、氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分，β-葡聚糖含量高達(dá)39.9%～43.6%[8-10]。繡球菌β-葡聚糖以帶有1，6 分支的β-（1，3）-D-葡聚糖為主，分支頻率約為3 個(gè)主鏈單位1 個(gè)分支，還有少量的β-（1，6）-D-葡聚糖和ɑ 型葡聚糖，具有多種生理及藥理學(xué)功效[11]，可抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成及黑色瘤細(xì)胞的代謝，刺激外周血單核細(xì)胞及小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，提高動(dòng)物的造血功能，同時(shí)繡球菌多糖還可提高炎癥相關(guān)因子IL-12，IL-1β 等基因的表達(dá)量，促使樹突狀細(xì)胞的成熟[12-14]。目前對繡球菌多糖純化后均一多糖組分的結(jié)構(gòu)、免疫活性及其構(gòu)效關(guān)系研究較少。本研究組采用聚能超聲波輔助水提醇沉法提取繡球菌多糖，分離純化后測定其分子質(zhì)量、單糖組成、結(jié)構(gòu)、表觀形貌等，研究其免疫活性，探究其均一多糖組分結(jié)構(gòu)表征與免疫活性之間的關(guān)系，為繡球菌多糖功能食品原料的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

繡球菌子實(shí)體，由山西省太和食用菌栽培基地提供。

1.2 主要試劑

核糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖等單糖標(biāo)準(zhǔn)品，DPPH、Tris、鄰苯三酚，美國Sigma 公司；大孔樹脂HZ-830、DEAE-52 纖維素粉末、Sephadex-G200 粉末、透析袋（8 000～14 000 u）、T-右旋糖酐（T-10，T-40，T-70，T-500，T-2000） 標(biāo)品、DMEM 高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、中性紅染料、脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、一氧化氮（NO）測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；10×上樣緩沖液、RNAiso Plus 試劑盒、Prime Script TM RT Master Mix（Perfect Real Time） 試劑盒、SYBRRPremix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）試劑盒，日本Takara公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.3 主要設(shè)備與儀器

超聲波細(xì)胞破碎儀（Scientz-1200E），寧波新芝有限公司；中壓特制玻璃層析柱 （2.6 cm×30 cm），山東化工研究院；恒流泵（DHL-ZB）、自動(dòng)部分收集器（DBS-100A），滬西儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10），IKA 公司；冷凍干燥機(jī)（PL 3000），Thermo 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Tensor27），Bruker 公司；紫外分光光度計(jì)（Cary 4000）、凝膠滲透色譜，Agilent 公司；離子色譜儀（ICS-3000），DIONEX 公司；超導(dǎo)核磁共振波譜儀（600 MHz），Bruker 公司；掃描探針顯微鏡（SPA-300 HV），日本精工；掃描電鏡（JSM-6010），JEOL日本電子；凝膠色譜柱（TSK-GEL-4000PWXL），日本Tosoh 公司；CO2培養(yǎng)箱 （HF 90 / HF 240），Heal Force公司；熒光倒置顯微鏡（IX2-UCB），OLYMPUS 公司；多功能酶標(biāo)儀 （Sepctramax i3X），Molecular Devices 公司；MyCyler PCR 儀，Bio-Rad 公司；熒光定量PCR 儀（QuantStudio 7 Flex），Thermo Scientific 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 繡球菌多糖的制備、分離及純化 繡球菌粗多糖參照文獻(xiàn)[15]的方法制備。將繡球菌子實(shí)體樣品置于35 ℃烘箱中干燥，切片后粉碎，過200目篩。稱取一定量的繡球菌子實(shí)體干粉，按料液比1∶40（g/mL）加入純水，聚能超聲波1 200 W 處理20 min，將1%的纖維素酶、中性蛋白酶分別在pH 4 和pH 7，溫度40 ℃條件下水解3 h。滅酶后100℃水浴提取3 h，水提液3 500×g離心20 min，取上清，旋蒸濃縮，加入3 倍體積的無水乙醇醇沉，4℃下靜置過夜，3 500×g離心15 min 得到沉淀。沉淀分別用丙酮、乙醚洗滌、過濾后收集多糖。采用Sevag 法除蛋白，HZ-830 離子交換樹脂脫色、除雜，冷凍干燥后得到繡球菌粗多糖樣品，命名為SlPs。

取一定量的SlPs 溶解質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，用0.45 μm 一次性針頭過濾器除雜，將5 mL 樣品液緩緩加入DEAE-52 陰離子交換柱（2.6 cm×30 cm），用0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫，調(diào)節(jié)恒流泵速度為1.0 mL/min，同時(shí)利用自動(dòng)收集器每5 min 收集1 管（約5 mL）。采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集得到SlPs 洗脫液，濃縮，透析（3 500 u，24 h）去除NaCl，冷凍干燥得到多糖樣品。取一定量經(jīng)DEAE-52 純化的多糖樣品，用0.45 μm 濾器除雜后，將5 mg/mL 溶液緩緩加入Sephadex-100 凝膠過濾柱（2.6 cm×30 cm）進(jìn)一步純化，用蒸餾水洗脫，控制恒流泵使其流速為1 mL/min，每5 mL 收集1 管，苯酚-硫酸法追蹤檢測，直至吸光值出現(xiàn)為止，收集吸收峰的洗脫液，濃縮凍干后得純化的多糖，命名為SlP。

1.4.2 結(jié)構(gòu)鑒定

1） 均一性和相對分子質(zhì)量的測定 采用高效凝膠滲透色譜法測定SlP 的平均分子質(zhì)量，色譜柱為TSK-GEL-4000 PWXL （300 mm×7.8 mm），檢測器為折光示差檢測器，檢測溫度40 ℃，上樣量20 μL，上樣質(zhì)量濃度2 mg/mL；0.6 mL/min蒸餾水洗脫。采用不同分子質(zhì)量的T-右旋糖酐標(biāo)品（T-10，T-40，T-70，T-500 和T-2000）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lg Mw=-0.3826Rt+8.66，R2= 0.9945，式 中，Mw——分子質(zhì)量（u）；Rt——保留時(shí)間（min）。

2） 單糖組成的測定 稱取10 mg 樣品于安瓿瓶中，加入4 mL 2 mol/L 三氟乙酸，用酒精噴燈對安瓿瓶進(jìn)行封口，在120 ℃油浴中水解6 h。完全反應(yīng)后冷卻至室溫，減壓條件下將水解物蒸發(fā)至干燥，用甲醇洗滌3～5 次，除去剩余的三氟乙酸。采用離子色譜分析單糖組成，通過Dionex ICS 3000 色譜系統(tǒng)分析，色譜柱為Dionex Carbopac PA 10（250 mm×4 mm）。將干燥的水解液溶解在1 mL 蒸餾水中，用10 倍梯度稀釋法測定，柱溫30 ℃，上樣量25 μL，洗脫液為2 mol/L NaOH，流速0.45 mL/min。采用單糖標(biāo)準(zhǔn)品為阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖。

3） 特征吸收峰的測定 采用傅里葉紅外光譜法測定多糖特征吸收峰。稱取一定量的多糖樣品和溴化鉀粉末，按質(zhì)量比1∶50 充分混合，研磨后壓片，在波長400～4 000 cm-1的掃描范圍內(nèi)采集數(shù)據(jù)，通過軟件對圖譜進(jìn)行分析。

4） 初級結(jié)構(gòu)的鑒定 稱取干燥的100 mg SlP，溶解在裝有0.55 mL DMSO 的核磁管中，采用600 MHz 的核磁共振儀在室溫下檢測13C NMR，1H NMR。

5） 三螺旋結(jié)構(gòu)分析 采用剛果紅染色方法分析SlP 的三螺旋結(jié)構(gòu)。配制方法：將2 mL 1 mg/mL SlP 溶液與91 μmol/L 剛果紅溶液充分混合，逐滴加入1 mol/L NaOH，使其終濃度在0～0.5 mol/L 范圍內(nèi)增加，用紫外-可見分光光度計(jì)在波長400～700 nm 范圍內(nèi)掃描，在不同NaOH 濃度下檢測多糖溶液與剛果紅溶液的λmax。以NaOH 濃度為橫坐標(biāo)，多糖與剛果紅混合溶液最大吸收波長λmax為縱坐標(biāo)，繪制圖像。

6） 表觀形貌觀測 將凍干的SlP 粉末粘到銅質(zhì)樣品臺上，對樣品表面噴金，用掃描電鏡觀察SlP 表面的結(jié)構(gòu)。

7） 分子形貌觀測 配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL SlP 溶液，采用0.45 μm 一次性濾器除雜、過濾，取5 μL SlP 溶液滴在新鮮剝離的云母片表面上，室溫干燥過夜。室溫下采用AFM 觀測多糖分子在溶液中的形貌，用NanoScope 軟件處理、分析試驗(yàn)圖形。

1.4.3 免疫活性的測定

1） 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清和2%青霉素-鏈霉素的高糖培養(yǎng)基（DMEM）中，在溫度37 ℃、濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，達(dá)到對數(shù)期。

2） 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 增值活力的影響采用MTT 法測定巨噬細(xì)胞增殖活力。將處于對數(shù)期的細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板上，密度為1×106細(xì)胞/mL，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后，除空白對照外，分別加入31.25，15.63，7.81，3.92 μg/mL 和1.95 μg/mL 的SlP，每組3 次重復(fù)1 次，于溫度37℃、相對濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT 溶液，在溫度37 ℃、相對濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。4 h 后棄MTT 溶液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床中輕輕振搖15 min，在波長490 nm 處用酶標(biāo)儀測定OD 值。計(jì)算時(shí)以僅含多糖的孔為背景誤差組，除去背景誤差。

3） 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 NO 分泌量的影響 將巨噬細(xì)胞RAW264.7 培養(yǎng)液調(diào)整至含量為1×106個(gè)/mL，接種到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔500 μL，置于溫度37 ℃、相對濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基。將含有7.81，3.92 μg/mL 和1.95 μg/mL SlP 的細(xì)胞培養(yǎng)液 （設(shè)為組I，II 和 III）、陽性對照組10 μg/mL LPS 和空白的細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板中，作用24 h 后收集細(xì)胞上清液。按照索萊寶一氧化氮（NO）測定試劑盒說明書，測定巨噬細(xì)胞RAW 264.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO 分泌量。

4） 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 吞噬能力的影響將巨噬細(xì)胞RAW264.7 培養(yǎng)液調(diào)整至含量為1×106個(gè)/mL，接種到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔500 μL，置于溫度37 ℃、相對濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基。將含有7.81，3.92 μg/mL 和1.95 μg/mL SlP 的細(xì)胞培養(yǎng)液 （設(shè)為組I，II 和III）、陽性對照組10 μg/mL LPS 和空白的細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板中，作用24 h 后，加入0.075%中性紅染料，置環(huán)境溫度37 ℃，相對濕度5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，棄舊的培養(yǎng)基，向每孔中加入PBS 反復(fù)洗滌3 次。在每孔中加入細(xì)胞裂解液，室溫反應(yīng)15 min，在波長540 nm 處測定吸光值。吞噬指數(shù)（PI）= ODA1/ODA2，式中，A1、A2分別為樣品組和空白組的OD 值。

5） 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 免疫細(xì)胞因子基因表達(dá)量的影響 將巨噬細(xì)胞RAW264.7 以1 ×106個(gè)/mL 含量接種到24 孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL。24 h 后換液，將含有7.81，3.92 μg/mL 和1.95 μg/mL SlP 的細(xì)胞培養(yǎng)液（設(shè)為組I，II 和III）、陽性對照組10 μg/mL LPS 和空白的細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板中，孵育24 h 后獲得細(xì)胞懸液，用于檢測 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10 和IFN-β mRNA 相對表達(dá)量。采用TRIzol 試劑提取總RNA，定量后用RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在 GenBank 中找到小鼠巨噬細(xì)胞中βactin、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10 和IFN-β的基因序列，通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)所需引物，由深圳華大基因有限公司合成，其引物序列如下：TNF-α 上游引物5′-TATGGCTCAGGGTC CAACTC -3′ ，下游引物 5′ -GCTCCAGTGA ATTCGGAAAG-3′；IL-1β 上游引物5′-GAGCC CATCCTCTGTGTCTC-3′，下游引物5′-AGCT CATATGGGTCCGACAG-3′；IL-6 上游引物5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′，下游引物5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′；IL-3 上游引物5′-GACCTGAAGGGCACATGAGA-3′ ，下游引物5′-CAAGTGCCAGTGAGTTGCAG-3′；IL-10 上游引物5′-CATTG CATACG GGACAGAACT-3′，下游引物5′-ACTGTTTGAGGGCCACTTCAT -3′ ；IFN-β 上游引物5′-CTCCATTACCATCCGCCTCA-3′，下游引物5′-GCCAGCAGCCTTACGAGATA-3′；β-actin 上游引物5′-AGCCATGTACGTAGC CATCC-3′，下游引物5′-CTCTCAGCTGTGGTG GTGAA-3′。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s（40 個(gè)循環(huán)）；72 ℃30 s，95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SlP 均一性和相對分子質(zhì)量

如圖1所示，SlP 高效凝膠滲透色譜圖表現(xiàn)為單一、對稱峰，說明SlP 是均一多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，測得SlP 分子質(zhì)量為1.04×104u。

圖1 分子量分布Fig.1 The distribution of molecular weight

2.2 單糖組成

如圖2所示，SlP 主要由葡萄糖構(gòu)成。

圖2 離子色譜圖Fig.2 Ion chromatography （IC） chromatograms

2.3 紅外光譜分析

如圖3所示，SlP 具有典型的多糖吸收峰。在3 425.36 cm-1出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰由多糖分子間游離羥基和氨基官能團(tuán)的O-H 和N-H 伸縮振動(dòng)引起；在2 925.60 cm-1出現(xiàn)的中強(qiáng)尖峰由糖鏈亞甲基間的C-H 伸縮振動(dòng)引起；在1 641.85 cm-1出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰由多糖分子中-COOH 或-CO-中C＝O伸縮振動(dòng)引起；在1 416.05 cm-1和1 374.38 cm-1處有吸收峰，由C-H 彎曲振動(dòng)引起；而在1 150.20 cm-1和996.23 cm-1附近出現(xiàn)的中等吸收峰則分別由C-O-H 的拉伸振動(dòng)和C-O-C 糖苷鍵的拉伸振動(dòng)的重疊環(huán)振動(dòng)引起。

圖3 紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum

2.4 核磁共振波譜分析

由圖4可知，在1H NMR 波譜中的異頭氫信號在δ 4.51～4.96 ppm 范圍出現(xiàn)5 個(gè)強(qiáng)吸收峰，表明SCP-1 糖苷鍵中含有β 構(gòu)型；從13C-NMR 譜圖可看出，異頭碳區(qū)域的共振信號峰出現(xiàn)在δ 103.49×10-6和δ 103.45×10-6處，進(jìn)一步表明為SlP 為β構(gòu)型葡聚糖。

圖4 1H 和13C 核磁共振光譜圖Fig.4 1H and 13C NMR spectra

2.5 SCP-1 三螺旋結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示，與剛果紅相比，在0.04 mol/L NaOH 條件下，剛果紅+SlP 溶液的λmax發(fā)生明顯的變化，出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，說明SlP 與剛果紅形成復(fù)合物，呈三螺旋結(jié)構(gòu)存在；當(dāng)NaOH 濃度超過0.04 mol/L 時(shí)，溶液λmax減小，絡(luò)合物開始分解，螺旋結(jié)構(gòu)開始解離；當(dāng)NaOH 濃度接近0.28 mol/L 時(shí)，絡(luò)合物完全分解，螺旋完全解開。由此說明在弱堿性條件下SlP 具有三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 不同濃度NaOH 下剛果紅與SlP混合液的λmax 變化圖Fig.5 The maximum absorption wavelength of various SlP-Congo red mixture at different concentrations of NaOH

2.6 分子形貌

如圖6所示，在掃描范圍5 μm×5 μm 下觀察SlP 分子間呈現(xiàn)無規(guī)則的線團(tuán)和島嶼狀結(jié)構(gòu)，鏈間纏繞且具有分支狀結(jié)構(gòu)；掃描范圍800 nm ×800 nm 下，SlP 出現(xiàn)大小、形狀不一的球形聚集體，這些聚集體的形成可能是因氫鍵作用，SlP 的多股單鏈間相互糾纏締合所致。SlP 的單鏈高度和直徑分別分布于31.48～42.61 nm 和0.28～1.75 nm范圍。

圖6 SlP 原子力顯微鏡Fig.6 AFM images of SlP

2.7 表觀形貌

掃描點(diǎn)鏡下SlP 表觀形貌如圖7所示。100 倍下，SlP 呈現(xiàn)大小、形狀不一無規(guī)則的碎片狀；放大300 倍，SlP 碎片一面光滑，一面粗糙。

圖7 掃描電鏡鏡圖Fig.7 SEM images

2.8 免疫活性分析

2.8.1 對巨噬細(xì)胞增殖活力的影響 從圖8可知，SlP 質(zhì)量濃度在1.95～31.25 μg/mL 范圍內(nèi)，SlP可促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞增殖。當(dāng)SlP 質(zhì)量濃度在7.81 μg/mL 時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。

圖8 SlP 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖的影響Fig.8 Effect of SlP on macrophage proliferation

2.8.2 對巨噬細(xì)胞NO 分泌量和吞噬能力的影響 從圖9可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞的12 h，其NO 分泌量、吞噬能力極顯著增強(qiáng) （P<0.01）；SlP 質(zhì)量濃度在1.95～7.81 μg/mL 范圍，能夠促進(jìn)噬細(xì)胞NO 分泌量、吞噬指數(shù)隨質(zhì)量濃度的提高而增大，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為7.81 μg/mL 時(shí)，NO 分泌量、吞噬指數(shù)最大；與LPS 陽性對照組相比，SlP 作用巨噬細(xì)胞后，其NO 分泌量、吞噬指數(shù)明顯低于LPS 組，差異極顯著（P<0.01）。

圖9 SlP 對巨噬細(xì)胞NO 分泌量和吞噬能力的影響Fig.9 Effect of SlP on NO secretion and phagocytic capacity of macrophages

2.8.3 對巨噬細(xì)胞免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響 從圖10可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS 作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞12 h，TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-3 mRNA、IL-10、IFN-β mRNA 表達(dá)量明顯升高，差異極顯著（P<0.01）。SlP 在質(zhì)量濃度1.95～7.81 μg/mL 范圍內(nèi)，能提高巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量，隨著質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量逐漸增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為7.81 μg/mL 時(shí)，差異極顯著（P<0.01）；與陽性對照組相比，LPS 作用后巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量明顯高于多糖，差異極顯著（P<0.01）。

圖10 SlP 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響Fig.10 Effect of SlP on immunity cell cytokine mRNA expression in RAW264.7 macrophages

3 討論

多糖對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用并非直接作用于機(jī)體，主要是通過激活NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答系統(tǒng)來間接實(shí)現(xiàn)的[16]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體中重要的免疫細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫反應(yīng)以及非特異性防御中發(fā)揮著重要的作用。巨噬細(xì)胞能夠殺死病原菌和腫瘤細(xì)胞，釋放出刺激其它免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子，并在細(xì)胞表面攜帶抗原，將其呈遞給T 細(xì)胞，參與抗原的呈遞[17]。β-葡聚糖是一種常見的生物免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可與巨噬細(xì)胞表面模式識別受體結(jié)合，啟動(dòng)免疫反應(yīng)機(jī)制，增加活化巨噬細(xì)胞數(shù)量。本試驗(yàn)中SlP主要由β-葡聚糖構(gòu)成，一定濃度的SlP 能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

巨噬細(xì)胞受到刺激后，可以分泌大量細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10、IFN-β 等，在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤生長等方面發(fā)揮著重要的作用。TNF-α 是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效性調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，能夠提高嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞功能，刺激超氧化物產(chǎn)生，釋放溶酶體酶，介導(dǎo)其它細(xì)胞和炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫和代謝功能，維持機(jī)體平衡[18]。IL-1β 由Th2 型T 輔助淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和B 細(xì)胞產(chǎn)生，能夠抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)合成IL-1 受體拮抗劑，間接抑制IL-1 的功能，是一種多效應(yīng)的炎癥因子[19]。IL-6 是宿主對感染和受損組織反應(yīng)的主要介質(zhì)，能促進(jìn)T 細(xì)胞發(fā)育，刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，參與炎癥反應(yīng)，在內(nèi)分泌和造血系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用[20]。IL-3 由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生，在NK 細(xì)胞以及T 淋巴細(xì)胞中表達(dá)，能與其它細(xì)胞因子聯(lián)合作用，誘導(dǎo)和擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，對腫瘤抑制具有一定的作用[21]。IL-10 可以抑制炎癥細(xì)胞的黏附，阻止促炎癥細(xì)胞因子合成及分泌，降低致炎作用的細(xì)胞因子的數(shù)量，減輕炎癥反應(yīng)[22]。IFN-β 可以調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的免疫功能，增強(qiáng)IgG 受體的表達(dá)，有利于T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞的激活，巨噬細(xì)胞對抗原的吞噬以及NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷，增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力[23]。本試驗(yàn)中，一定濃度的SlP 能夠提高RAW 264.7 小鼠巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10、IFN-β mRNA 表達(dá)量，并呈劑量的依賴性。SlP 對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的調(diào)控可能與其表面膜識別受體有關(guān)，SlP 與巨噬細(xì)胞表面膜受體如TLR 2 和TLR 4 受體、CR 3 受體、MR 受體等相互作用將信號傳遞給巨噬細(xì)胞，細(xì)胞信號通過級聯(lián)放大作用及不同信號途徑之間相互交聯(lián)作用，調(diào)控免疫反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)相應(yīng)蛋白的活性以及表達(dá)量的變化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。關(guān)于SCP-1 和巨噬細(xì)胞之間特定的免疫調(diào)控機(jī)制，將將在后續(xù)試驗(yàn)中研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)SlP 通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫活性來促進(jìn)NO 的產(chǎn)生。作為一種高效且多樣化的生物調(diào)節(jié)劑，NO 在巨噬細(xì)胞的非特異性免疫過程中發(fā)揮著重要的作用[24]。NO 不僅能夠抑制、殺死腫瘤細(xì)胞和致病微生物，還能對其它細(xì)胞因子的分泌起到一定調(diào)控作用。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO主要是由于一氧化氮合酶 （NOS） 的催化作用引起，誘導(dǎo)型NOS（iNOS）是由巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞合成，直接參與機(jī)體免疫細(xì)胞防御及炎癥反應(yīng)。SlP 與巨噬細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)iNOS 表達(dá)量的上調(diào)，激活細(xì)胞的非特異性免疫，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NO 分泌量增加。

4 結(jié)論

從繡球菌子實(shí)體多糖中純化的SlP 是一種由葡萄糖構(gòu)成的β-葡聚糖，分子質(zhì)量集中在1.04×104u，具有三螺旋結(jié)構(gòu)，表觀呈現(xiàn)大小、形狀不一、無規(guī)則的碎片狀，分子間呈現(xiàn)無規(guī)則的線團(tuán)和島嶼狀，鏈間纏繞且具有分支狀結(jié)構(gòu)。SlP 能夠促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞增殖，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力、NO 分泌量以及細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10、IFN-β 免疫因子mRNA 的表達(dá)量。SlP 可作為一種良好的功能食品原料應(yīng)用于食品工業(yè)中。