乳鐵蛋白-EGCG-多糖乳液的構(gòu)建及其遞送姜黃素的功能特性

馬翠翠，龐 瀟，孟煥娜，李雪琪，劉夫國

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100）

姜黃素是一種食品著色劑，也是食品中安全、天然的抗菌劑和抗氧化劑，可以替代許多化學(xué)合成的工業(yè)產(chǎn)物。然而，姜黃素的一些特性限制了其在食品中的應(yīng)用。首先，姜黃素的疏水性導(dǎo)致其在食品系統(tǒng)中顯示出低水溶性和不充分的分散性。其次，姜黃素的穩(wěn)定性差，在貯存和食品加工過程中遇到較為惡劣的環(huán)境時，姜黃素分解，進(jìn)而降低其營養(yǎng)價值和生物活性。此外，由于姜黃素本身的苦味，若在食品中直接使用就會導(dǎo)致對感官屬性產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至與食品成分發(fā)生不愉快的相互作用[1]。目前有效的解決方法之一是構(gòu)建食品遞送系統(tǒng)。常見的遞送系統(tǒng)包括乳液、納米顆粒、脂質(zhì)體等。而乳液作為包裹脂溶性姜黃素的一種優(yōu)良載體，在不顯著改變食品質(zhì)量和感官特性的情況下，可為活性物質(zhì)提供良好的穩(wěn)定性和緩釋性。通過增強(qiáng)其在水介質(zhì)中的溶解性，提高其功能性和生物活性[2]。

大量研究表明多層乳液和納米乳液在遞送活性成分方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢。多層乳液是一種具有獨特的封裝和釋放特性的新型遞送系統(tǒng)。一般而言，多層聚合物的添加能提高乳液在各種工藝條件（不同pH 值、離子強(qiáng)度和溫度）下的穩(wěn)定性，改善封裝成分的化學(xué)穩(wěn)定性，并提高對封裝成分釋放速率的控制水平[3-4]。Li 等[5]通過界面靜電沉積方法，在脂質(zhì)液滴周圍形成多層生物聚合物涂層，來控制包埋在乳液中的親脂性活性物質(zhì)的消化和釋放。這些涂層由球狀蛋白（β-乳球蛋白）構(gòu)成內(nèi)層，陽離子多糖（殼聚糖）構(gòu)成中間層，陰離子多糖（果膠或藻酸鹽）構(gòu)成外層。研究發(fā)現(xiàn)在存在外層的情況下，液滴在pH 4～7 范圍內(nèi)具有良好的聚集穩(wěn)定性。Taherian 等[4]評估了雙層魚油乳液的理化穩(wěn)定性，結(jié)果表明，雙層包埋可以提高空間位阻效應(yīng)，進(jìn)而提高乳液的穩(wěn)定性，有利于將魚油添加到食品和飲料中。納米乳液是粒徑小于200 nm 的熱力學(xué)穩(wěn)定、各向同性的乳液。研究表明，由乳清分離蛋白制備的納米乳液，在各種離子強(qiáng)度、熱處理和貯存條件下，均具有良好的穩(wěn)定性[5]。當(dāng)使用較高的蛋白質(zhì)濃度作為乳化劑來穩(wěn)定納米乳液時，可能不需要使用多糖作為制備納米乳液的第2層。以納米乳液為基礎(chǔ)的包埋技術(shù)，是一種很有前景的包埋天然活性成分的技術(shù)，具有以下優(yōu)點：（1）改善活性成分的物理化學(xué)穩(wěn)定性；（2）防止其在食品加工過程中變質(zhì)；（3）增加其在各種食品中的適用性。

本研究的目的是通過制備多酚-蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物，以光譜法探究乳鐵蛋白、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、多糖間的相互作用方式。以乳鐵蛋白、EGCG 和多糖 （海藻酸鈉和阿拉伯膠）為壁材組分，通過層層自組裝法構(gòu)建姜黃素納米乳液，分析姜黃素乳液的粒徑、ζ-電位、流體行為、光照穩(wěn)定性和生物可及性，旨在探究不同界面組成的共價復(fù)合物對乳液物理性質(zhì)、穩(wěn)定性，以及包埋活性成分（姜黃素）的化學(xué)穩(wěn)定性的影響，以期為開發(fā)新型功能因子遞送體系提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF），上海普洛欽國際貿(mào)易有限公司；阿拉伯膠（Gum Arabic from acacia tree，GA）、海藻酸鈉 （Alginic acid sodium，SA）、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基 （DPPH，純度95%），Sigma-Aldrich 公司（美國圣路易斯）；姜黃素（Curcumin，純度≥95%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，純度≥98%），北京北實縱橫科技發(fā)展有限公司；無水乙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；黏蛋白、胃蛋白酶、胰酶、膽鹽，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。其它化學(xué)試機(jī)均為分析純級。

AUW120D 電子天平，島津公司；DZKW-4 電子恒溫水浴鍋，北京市中興偉業(yè)儀器有限公司；KO-500DE 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；AH-BASIC 高壓均質(zhì)機(jī)，上海ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司；84-1A 磁力攪拌器、pH 計，奧豪斯儀器有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；XH-C 漩渦混合器，金壇市白塔新寶儀器廠；ZEN3600 激光納米粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；UV-1240 紫外可見分光光度計，日立公司；DW-HL668 超低溫冷凍儲存箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀，Waters 公司；LGJ-25C 真空冷凍干燥器，北京四環(huán)儀器廠；熒光分光光度計，美國PE 公司；Vetex70-傅里葉變換紅外光譜，德國布魯克公司；RS-232C 可程式氙燈老化試驗機(jī)老化箱，東莞市精域環(huán)境測試設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳鐵蛋白-EGCG 二元共價復(fù)合物的制備采用堿處理誘導(dǎo)法[6]，將一定的LF 和EGCG 分別溶解于50 mL 去離子水中，將蛋白溶液的濃度控制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，EGCG 的濃度控制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，使用0.2 mol/L 的NaOH 將2 種溶液的pH 值調(diào)至9.0，過夜保證其充分水合。將兩種處理好的溶液在連續(xù)攪拌條件下以1∶1 的體積比混合。將該混合物暴露于空氣中24 h 后，采用去離子水透析48 h，為保證未參與反應(yīng)的游離EGCG可以透析完全，每隔6 h 換1 次水。將樣品置于冷凍干燥裝置2～3 d 保證產(chǎn)物完全凍干，得到凍干LF-EGCG 樣品。

乳鐵蛋白對照組的處理方法同上，不加入EGCG。

1.2.2 加熱及pH 值對LF-EGCG 二元共價復(fù)合物顆粒性質(zhì)的影響 將制備好的LF-EGCG 溶液倒入20 mL 試管中，調(diào)節(jié)至已知的pH 值，然后將其置于90 ℃水浴處理20 min，得到加熱的樣品H（LF-EGCG）。樣品在熱處理過程中不攪拌，通常容器的中心溫度在加熱2 min 后才能到達(dá)40 ℃，即初始加熱速率為20 ℃/min。因此，樣品要比球狀蛋白質(zhì)的熱變性溫度高至少10 ℃，這足以使蛋白質(zhì)解折疊并發(fā)生聚集[7]。熱處理后，將溶液從水浴中移出并在室溫（25 ℃） 下冷卻，在分析前靜置18～24 h，將所得懸浮液調(diào)節(jié)至不同pH 值，測定不同pH 值下的ζ-電勢。

1.2.3 乳鐵蛋白-EGCG-多糖三元復(fù)合物的制備參照Peinado 等[8]的方法，采用熱處理協(xié)同靜電自組裝法制備乳鐵蛋白-EGCG-多糖復(fù)合膠體顆粒。將一定量的乳鐵蛋白-EGCG 二元共價復(fù)合物溶解在雙蒸水中（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），阿拉伯膠和海藻酸鈉溶解在20 mL 去離子水中（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%），攪拌過夜使其充分水合。待完全溶解后，用0.2 mol/L的HCl 和NaOH 將復(fù)合物溶液的pH 值調(diào)節(jié)到8.0。靜置后移入具塞試管，90 ℃水浴加熱20 min。室溫冷卻后，將溶液pH 值調(diào)至4.0。與等體積的不同濃度多糖（阿拉伯膠和海藻酸鈉）溶液混合后靜置1 h，形成以多糖為殼的膠體顆粒H （LFEGCG）-GA 和H（LF-EGCG）-SA。對形成復(fù)合膠體顆粒的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)條件。

1.2.4 粒徑和表面電荷測定 采用激光納米粒度儀測量復(fù)合物的粒徑和電位，每次測量12 次，結(jié)果以平均直徑（Z-Average）、ζ-電位和多分散指數(shù)（PdI）表示。溶液在測量分析前用雙蒸水稀釋100倍，以避免多次散射的影響。所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.5 FTIR 分析 使用Spectrum 100 Fourier 變換分光光度計在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)測量，分辨率為4 cm-1。將10 mg 乳鐵蛋白、未經(jīng)加熱的二元復(fù)合物、加熱的二元和三元復(fù)合物樣品與100 mg KBr 粉末混合后壓制成小球，將混合物壓入光盤進(jìn)行光譜記錄。以KBr 作為參考，所有試驗均重復(fù)3 次。

1.2.6 熒光光譜 蛋白質(zhì)發(fā)射熒光主要來源于3個氨基酸殘基的影響：苯丙氨酸 （Phe）、酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）。Trp 熒光因其對環(huán)境極性的高靈敏度被廣泛用于研究蛋白質(zhì)與其它大分子之間的相互作用[9]。

通過熒光分光光度計在25 ℃下對所有樣品進(jìn)行熒光測量。在0.2 mg/mL 的恒定質(zhì)量濃度下測量蛋白質(zhì)的固有熒光。設(shè)置激發(fā)波長為292 nm，發(fā)射波長記錄范圍為300～450 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度為240 nm/min。所有數(shù)據(jù)都在25 ℃下收集，單個發(fā)射光譜是3 次測量值的平均值。

1.2.7 姜黃素乳液的制備 單層乳狀液的制備：將對照LF 和LF-EGCG 共價復(fù)合物 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）分別溶解于雙蒸水中，取一部分LF-EGCG 溶液水浴加熱（90 ℃，20 min），熱處理后，將溶液從水浴中移出并在室溫下冷卻，得到H（LF-EGCG）溶液。所有溶液溶脹過夜，形成水相（體積分?jǐn)?shù)90%）。將MCT 加熱至60 ℃，加入姜黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）并磁力攪拌10 min，得到油相（體積分?jǐn)?shù)10%）。采用高速乳化剪切機(jī)進(jìn)行剪切處理，速度設(shè)定為10 000 r/min，在剪切過程中用一次性注射器將油相緩慢加入至水相，每個樣品處理3 min，每次處理間隔3 min，得到粗乳液。將粗乳狀液加入至高速均質(zhì)機(jī)進(jìn)一步均質(zhì)，得到姜黃素納米乳液。均質(zhì)壓力保證在60 MPa 左右，共均質(zhì)3 次。

雙層乳狀液的制備：取一定體積的H （LFEGCG）單層乳狀液，一邊加入多糖溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%）一邊剪切，剪切速度為10 000 r/min，每個樣品處理3 min，每次間隔3 min。得到粗乳狀液后，使用高壓均質(zhì)機(jī)對粗乳狀液進(jìn)一步均質(zhì)。均質(zhì)壓力保證在60 MPa 左右，均質(zhì)3 次后得到H （LFEGCG）-GA 和H（LF-EGCG）-SA 姜黃素乳液。所有乳液均貯藏于4 ℃環(huán)境下。

1.2.8 乳液粒徑及電位分析 采用激光納米粒度儀測量乳液的粒徑（Z-average size）和ζ-電位，每次測量3 次后取平均值。為減小乳液濃度過高導(dǎo)致多重光散射對測量造成的誤差，所有樣品在分析測試前均用雙蒸水（pH 6.0）稀釋至油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%。每個樣品重復(fù)3 次分析。

1.2.9 流變學(xué)特性分析 采用AR1500 型流變儀測定乳液的流變性質(zhì)。夾具采用Φ40 mm 不銹鋼平行板，取約1 mL 乳液于測量板上，選擇穩(wěn)態(tài)剪切模式，測定溶液的表觀黏度隨剪切速率的變化；同樣取約1 mL 乳液于測量板上，選擇小幅振蕩模式，固定振蕩應(yīng)力為1 Pa，測定溶液儲能模量G'和損耗模量G″隨振蕩頻率的變化。

1.2.10 乳液的穩(wěn)定性測定 參考Davidov-Pardo等[10]的方法分析乳液中負(fù)載的姜黃素對UV 光的穩(wěn)定性。

首先配制不同濃度的姜黃素乙醇溶液，使用紫外可見分光光度計分別測量其在425 nm 波長處的吸光度，繪制出姜黃素的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣品中姜黃素的含量：將5 mL 新鮮制備的乳液放進(jìn)設(shè)定好的老化箱進(jìn)行光照處理，光照條件為0.68 w/m2，25 ℃光照120 min，每隔30 min 取樣并測定不同乳液中姜黃素的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出不同乳液處理后姜黃素的剩余濃度，比較不同樣品光照下的穩(wěn)定性差異。

1.2.11 生物可及性測定 根據(jù)Meng 等[11]的方法進(jìn)行體外模擬消化，測量姜黃素的生物可及性。

初始體系：取20 mL 新鮮制備的乳液置于37℃恒溫磁力攪拌器中進(jìn)行攪拌處理 （100 r/min）。所有組均用錫箔紙包裹避光。

模擬口腔：包含0.03%粘蛋白的模擬唾液20 mL 于37 ℃預(yù)熱后與初始樣品混合，將pH 值調(diào)節(jié)至6.8，37 ℃，100 r/min 恒溫磁力攪拌10 min。

模擬胃消化：取20 mL 口相樣品轉(zhuǎn)移到100 mL 燒杯中，與20 mL 包含0.0032%胃蛋白酶的模擬液混合，將pH 值調(diào)節(jié)至2.5，37 ℃，100 r/min 恒溫磁力攪拌2 h。

模擬腸道消化：取30 mL 胃相樣品轉(zhuǎn)移到100 mL 燒杯中，并用1 mol/L NaOH 將pH 值調(diào)節(jié)至6.95～6.99 后，加入1.5 mL 鹽儲備液、預(yù)先制備的膽汁鹽溶液（0.1875 g 膽鹽加入3.5 mL、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液）及胰蛋白酶溶液（0.06 g 脂肪酶加入2.5 mL、pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液）。用0.25 mol/L NaOH 滴定以保持樣品的pH 值為7.00，在37 ℃條件下恒溫磁力攪拌2 h。

姜黃素的生物可及性分析：將小腸消化液在4 ℃，4 000×g條件下離心40 min，收集上清液，代表消化過程中形成的“膠束”部分。用乙醇提取膠束中的姜黃素，渦旋振蕩后在4 000×g條件下繼續(xù)離心20 min，取上清液在425 nm 波長處測定吸光值。采用公式 （1） 計算姜黃素的生物可及性（Bioaccessibility，BA）。

1.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與處理 所有試驗重復(fù)3次，處理后的數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。使用軟件SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析，基于Duncan 的多重比較檢驗，確定數(shù)值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

在食品加工過程中，食品工藝條件，尤其是溫度和pH 值對食品中蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有重要影響。因此，本研究首先采用理化分析方法表征了加熱處理、pH 值、多糖濃度對不同樣品粒徑和ζ-電位的影響，以篩選出最適pH 值和多糖濃度制備姜黃素乳液。通過將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%乳鐵蛋白-EGCG 溶液與GA、SA 溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%）在不同pH 值（2～10）條件下混合，確定形成蛋白-多酚-多糖三元復(fù)合物的最佳pH 值和多糖濃度。

2.1 不同pH 值條件下二元共價復(fù)合物及加熱顆粒的電位和粒徑

蛋白質(zhì)可以帶正電荷或帶負(fù)電荷，具體取決于pH 值。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被多酚共價修飾時，會導(dǎo)致其等電點的改變[6]。由前人研究可知，LF 是一種較高等電點（pH 8.5）的堿性蛋白，相對較高的等電點可以通過乳鐵蛋白N 末端的獨特堿性區(qū)域來解釋，該堿性區(qū)域可以結(jié)合酸性分子[12]。

由圖1a 可知，隨著pH 值的增加，LF 水溶液的ζ-電位值先升高后降低，在pH 9 時由帶正電轉(zhuǎn)為帶負(fù)電。這意味著LF 的等電點在8～9 之間，該結(jié)論與Liu 等[13]研究結(jié)果一致。LF-EGCG 復(fù)合納米粒子的等電點處于4～5 之間，說明EGCG 與LF 的共價結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)發(fā)生了變化，經(jīng)過多酚修飾后，LF 的等電點出現(xiàn)較大幅度的降低。

由圖1b 可知，LF 粒子的粒徑隨pH 值的增加呈現(xiàn)先降低后升高又降低的趨勢，在等電點附近達(dá)到最小值，pH 8 時達(dá)到最大值。LF-EGCG 的粒徑變化隨pH 值的變化不大，始終小于0.25 μm。與EGCG 結(jié)合后的二元復(fù)合納米粒子的粒徑與LF相比，明顯下降。這說明EGCG 在LF 堿處理后與LF 生成的共價鍵使得LF 的結(jié)構(gòu)更加致密，表現(xiàn)為每個pH 值對應(yīng)的粒徑至少降低0.30 μm。經(jīng)加熱處理后，不同復(fù)合物樣品的粒徑和電位變化不大，而加熱會導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露，形成更為穩(wěn)定的納米顆粒。因此選擇加熱的LF-EGCG進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 不同pH 值條件下不同樣品的ζ-電位（a）和粒徑（b）Fig.1 ζ-Potential （a） and size （b） of different samples at different pH value

2.2 不同pH 值條件下三元復(fù)合物的電位和粒徑

羧酸多糖在高于其pKa 的pH 值范圍內(nèi)帶負(fù)電荷。在一定的pH 值條件下，多糖鏈主鏈上的基團(tuán)會與蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生靜電相互作用，最終會影響蛋白質(zhì)-多糖混合體系的穩(wěn)定性[14]。由圖2a～2c可知，作為陰離子多糖，SA 和GA 的水溶液電位值隨著pH 值的變化始終為負(fù)值，且?guī)щ娏吭诹汶姾牲c之后整體上隨著pH 值的升高而增大。在與H（LF-EGCG）結(jié)合后，可以發(fā)現(xiàn)兩種多糖的加入使得復(fù)合納米粒子的帶電情況發(fā)生了明顯變化。LF-EGCG-多糖混合體系中的凈ζ-電位介于單個蛋白質(zhì)和多糖值之間，零電荷點＜pH 4。三元復(fù)合物的ζ-電位變化趨勢與多糖、LF-EGCG 相似，而等電點的出現(xiàn)明顯低于二元復(fù)合物，當(dāng)pH值高于等電點后，在一定范圍內(nèi)所帶電荷量也隨著pH 值的升高而增大，略有不同的是H （LFEGCG）-SA 在pH 6 時達(dá)到最大值，此后電荷量略有降低。SA 和GA 溶液中多糖分子的ζ-電位均為負(fù)值，這可以歸因于兩者都屬于含有羧基官能團(tuán)（pKa≈3.5）的陰離子生物聚合物。

靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用在蛋白質(zhì)-多糖聚集體的粒徑和穩(wěn)定性中起重要作用[15]。由圖2d 可知，隨著SA 和GA 的加入，三元復(fù)合粒子的粒徑明顯升高，H（LF-EGCG）與GA 結(jié)合后，在pH 6 處粒徑達(dá)到最大值，而后粒徑急劇減小。H（LF-EGCG）-SA 的粒徑隨著pH 值的增加呈先增大后減小的趨勢，粒徑在pH 3 處達(dá)到最大值，在pH 4 之后變化幅度趨于平緩。通過比較兩種三元復(fù)合物，可以發(fā)現(xiàn)，H（LF-EGCG）-SA 的粒徑始終小于H（LF-EGCG）-GA，這說明由于靜電排斥作用的存在，SA 與H（LF-EGCG）結(jié)合更緊密。

圖2 不同pH 值條件下不同樣品的ζ-電位（a～c）和粒徑（d）Fig.2 ζ-Potential （a-c） and size （d） of different samples at different pH values

2.3 不同復(fù)合物的內(nèi)源熒光分析

LF 分子中有13 個色氨酸殘基[16]。通?？梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)在340 nm 附近的熒光反映色氨酸殘基的信息，而發(fā)射強(qiáng)度的差異反映色氨酸殘基周圍環(huán)境的變化[17]。同時最大發(fā)射強(qiáng)度（λmax）的位置偏移可反映發(fā)色團(tuán)分子和蛋白質(zhì)疏水腔周圍的極性變化[18]。在色氨酸殘基的吲哚基團(tuán)被掩埋在天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中時，會發(fā)生λmax的藍(lán)移，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開時發(fā)生紅移[19]。由圖3可知，LF-EGCG、H（LF-EGCG）等復(fù)合物均發(fā)生了猝滅，說明堿處理使得EGCG 與LF 發(fā)生了結(jié)合。研究證明，芳香族氨基酸與EGCG 結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)作用會引發(fā)其熒光強(qiáng)度的淬滅[20]。此外，EGCG 的加入使得λmax發(fā)生了藍(lán)移，說明色氨酸的微環(huán)境發(fā)生了改變，這可能是由于EGCG 表面的多羥基改變了LF 的親水性。加熱處理后的二元復(fù)合物淬滅幅度略大于未處理組，說明加熱處理有利于增強(qiáng)淬滅水平[21]。此外，加入多糖后可明顯觀察到熒光強(qiáng)度增加，說明猝滅能力降低，這些結(jié)果可能歸因于多糖的加入誘導(dǎo)了LF 分子展開以及色氨酸殘基的暴露。

圖3 LF、LF-EGCG 共價復(fù)合物、加熱后的LF-EGCG、H（LF-EGCG）-SA/GA 三元復(fù)合物的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of LF，LF-EGCG conjugate，H（LF-EGCG） conjugate and LF-EGCGSA/GA ternary complexes

2.4 不同復(fù)合物的FTIR 分析

FTIR 可用于探究蛋白質(zhì)、多糖和多酚之間的相互作用。在酰胺A 帶，LF、LF-EGCG 和H（LFEGCG） 分別在3 306，3 310，3 310 cm-1附近的吸收峰代表C-N 伸縮和氫鍵。在酰胺I 帶，LF、LFEGCG、H （LF-EGCG） 分別在1 658，1 664，1 666 cm-1處的吸收峰為C=O 伸縮振動；在酰胺II 帶，LF、LF-EGCG、H（LF-EGCG）分別在1 543，1 537，1 537 cm-1處的吸收峰為C=O 拉伸振動和C-N 伸縮振動結(jié)合。而其中C=O 鍵和C-N 鍵都與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)不同元素之間的氫鍵形成有關(guān)[22-23]。SA和GA 在3 402，3 401 cm-1附近存在的吸收峰是由O-H 鍵的拉伸振動所引起，在2 937，2 939 cm-1處的吸收峰是由于CH2基團(tuán)的C-H 鍵拉伸振動導(dǎo)致，而在1 636，1 638 cm-1附近的吸收峰是由于羧基的C-H 鍵拉伸振動所引起[24]。

由圖4可知，當(dāng)LF 與EGCG 堿處理發(fā)生共價結(jié)合后，蛋白質(zhì)酰胺I 帶的光譜出現(xiàn)了明顯位移，LF-EGCG 和H （LF-EGCG） 的特征峰均在3 309 cm-1處，與對照組的特征峰相比移動了4～5 nm，說明蛋白質(zhì)的-NH2基團(tuán)參與了反應(yīng)。此外，可以發(fā)現(xiàn)酰胺Ⅱ帶中二元復(fù)合物相比于LF，吸收峰的位置都發(fā)生了一定程度的移動，這主要歸因于C=C雙鍵振動和C-N 振動，推測是由于在共價反應(yīng)過程中EGCG 氧化為醌，與蛋白質(zhì)結(jié)合后形成了復(fù)雜的二聚結(jié)構(gòu)所引起。

圖4 LF、SA、GA、LF-EGCG 共價復(fù)合物、加熱后的LF-EGCG 共價復(fù)合物、H（LF-EGCG）-SA/GA三元復(fù)合物的傅里葉紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of LF，SA，GA，LF-EGCG conjugate，H（LF-EGCG） conjugate and H（LF-EGCG）-SA/GA ternary complexes

H（LF-EGCG）-GA、H（LF-EGCG）-SA 兩種復(fù)合物與GA、SA 及H（LF-EGCG）相比，酰胺I 帶發(fā)生了較大位移（3 346.39 cm-1及3 356.03 cm-1），說明蛋白質(zhì)與多糖之間有氫鍵形成，兩組復(fù)合物酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶對應(yīng)峰位置的改變表明蛋白與多糖之間形成了新的引力，這極有可能是H（LFEGCG）與多糖之間發(fā)生了靜電相互作用。另外，由于沒有新峰出現(xiàn)，說明所有復(fù)合物中蛋白質(zhì)與多糖之間通過物理相互作用結(jié)合，并未生成化學(xué)鍵。

2.5 姜黃素乳液的粒徑和ζ-電位

單層乳液和雙層乳液在pH 4 的液滴粒徑、PdI 以及ζ-電位結(jié)果如圖5所示。對于單層乳液，通過二元共價復(fù)合物包埋的姜黃素乳液液滴的平均粒徑要小于LF 制備的乳液，該結(jié)果表明LF 與EGCG 的共價結(jié)合改善了其乳化性質(zhì)。另外，H（LF-EGCG）較LF-EGCG 更小一些，說明加熱能起到增強(qiáng)LF-EGCG 復(fù)合物乳化能力的作用。研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)與多酚發(fā)生共價結(jié)合后，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子所攜帶凈電荷的變化，進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，如兩親性和表面乳化性，最后改善復(fù)合物的親水性[6]。這是由于LF 的構(gòu)象發(fā)生了變化，致使多酚更容易結(jié)合疏水色氨酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的親水性提高。這種效果也可能是因為多酚與LF 的結(jié)合增加了界面層的厚度和電荷，而加熱又增強(qiáng)了這一作用，從而通過增加它們之間的空間位阻和靜電排斥來改善它們的絮凝穩(wěn)定性。同時，這3 種乳化劑形成的乳液PdI 都很?。?0.2），說明形成的乳液液滴大小均勻，乳液穩(wěn)定性較好。

圖5 不同樣品制備乳液的PdI、粒徑（a）和ζ-電位（b）Fig.5 PdI，particle size （a），and ζ-potential （b） of emulsions prepared with different samples

由LF、LF-EGCG 和H（LF-EGCG）共價復(fù)合物穩(wěn)定的單層乳液液滴分布均勻、粒徑較小，具體表現(xiàn)為較小的PdI 值（<0.15）和粒徑（<300 nm）。與二元共價復(fù)合物制備的單層乳液相比，由H（LF-EGCG）-多糖穩(wěn)定的雙層乳液液滴粒徑較大（粒徑>500 nm，PdI<0.15），表明SA 和GA 分子都可以吸附到陽離子LF-EGCG 共價復(fù)合物包埋的液滴表面，通過形成較厚的界面層，提高液滴間的空間排斥作用，防止乳液聚集，進(jìn)一步增強(qiáng)了乳液的穩(wěn)定性。在雙層乳液中，LF 吸附在油/水界面層，多糖長鏈則延伸至水相，這樣形成的復(fù)合物大大促進(jìn)了小液滴的形成[25]。

LF 包埋的乳液帶正電荷，而多糖包埋的液滴ζ-電位值由31 mV 左右變?yōu)?30 mV 左右，這表明帶有負(fù)電荷的GA 和SA 成功吸附在H （LFEGCG）穩(wěn)定的乳液液滴表面。這種現(xiàn)象主要是由于：（1） 海藻酸鈉和阿拉伯膠都是陰離子多糖，可以通過靜電結(jié)合吸附到乳鐵蛋白表面；（2）LF 上暴露的疏水基所導(dǎo)致的疏水性相互作用。根據(jù)Zhao 等[26]的研究結(jié)果可知，當(dāng)電位絕對值大于25 mV 時，此時的乳液抗絮凝能力強(qiáng)。因此得出結(jié)論，EGCG 共價結(jié)合LF 或負(fù)電荷多糖的吸附，導(dǎo)致乳液液滴間出現(xiàn)了較強(qiáng)的靜電排斥現(xiàn)象，使得乳液物理穩(wěn)定性良好。

根據(jù)以上分析，利用陰離子多糖穩(wěn)定形成的姜黃素雙層乳液，特別是SA 穩(wěn)定的乳液，由于其較強(qiáng)的靜電排斥作用，同時又在乳液液滴的表面形成了相對厚的帶電界面層，兩者的共同作用導(dǎo)致SA 的加入能夠抑制液滴的聚集，形成穩(wěn)定的乳液。

2.6 姜黃素乳液的流變特性

流變學(xué)是研究物質(zhì)的流動與形變的科學(xué)。研究物質(zhì)的流變特性，其目的不僅在于研究力學(xué)行為，也著重于不同物質(zhì)的力學(xué)特性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。根據(jù)斯托克斯定律，乳液的黏度越大，乳液液滴的沉降或上浮速率也就越小，從而在一定程度上增強(qiáng)了乳液的物理穩(wěn)定性。因此，研究乳液的黏度對深入了解乳狀液的物理穩(wěn)定性至關(guān)重要。

從圖6可以明顯看到，所有乳液的表觀黏度隨著剪切速率的升高（從0.1 s-1增加到100 s-1）而顯著下降，表現(xiàn)出明顯的剪切變稀行為，符合假塑性流體特征。未加入多糖的單層乳液中，由LF 穩(wěn)定的姜黃素乳液的表觀黏度顯著高于由LFEGCG 共價復(fù)合物穩(wěn)定的乳液，表明乳液未發(fā)生絮凝現(xiàn)象。在加入陰離子多糖后雙層乳液的表觀黏度明顯增加，說明包裹在液滴表面的多糖較長的分子鏈在溶液中相互纏結(jié)或聚集，產(chǎn)生較強(qiáng)的氫鍵和疏水作用力，從而增加溶液的黏度[27]。

圖6 不同樣品制備的乳液的表觀黏度Fig.6 The apparent viscosity of emulsions prepared with different samples

2.7 姜黃素乳液的光照穩(wěn)定性

由于結(jié)構(gòu)中具有共軛鍵，姜黃素在受到不利的環(huán)境壓力（光、熱和氧氣）時，容易發(fā)生化學(xué)降解[28]。圖7顯示了暴露于一定強(qiáng)度的光照條件下，在處理2 h 的過程中不同乳液中姜黃素保留率的變化。通過圖7a 可觀察到，在沒有乳液保護(hù)的姜黃素乙醇溶液中檢測到最嚴(yán)重的姜黃素降解，雙層乳液中的姜黃素比單獨使用LF-EGCG 或LF穩(wěn)定的乳液具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性。當(dāng)紫外線處理2 h 后，通過LF-EGCG 和多糖穩(wěn)定的雙層乳液中姜黃素的保留率相似，分別為64.0%和63.7%，而單獨使用LF 的保留率僅為33.8%。通過比較LF-EGCG（39.8%）和H（LF-EGCG）（57.1%）穩(wěn)定的單層乳液，可以發(fā)現(xiàn)H（LF-EGCG）穩(wěn)定的單層乳液中姜黃素的保留率比LF-EGCG 穩(wěn)定的單層乳液中姜黃素的保留率相對更高。

為了比較不同乳液對姜黃素穩(wěn)定的效果，采用一級反應(yīng)動力學(xué)公式ln（C/C0）=-kt（式中，k——反應(yīng)速率常數(shù)；t——時間，min）對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，如圖7b 所示，計算了速率常數(shù)和半衰期。通過表1中半衰期的計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著光照時間的延長，姜黃素的保留率逐漸降低，與未經(jīng)乳液包埋的游離姜黃素相比，SA 和GA 穩(wěn)定的雙層乳液半衰期明顯增加，由54.15 min 分別增加至198.04 min和195.44 min。單層乳液的保護(hù)性也較為明顯，LF（74.53 min）、LF-EGCG （100.46 min） 和H （LFEGCG）（157.53 min） 包埋的姜黃素乳液對應(yīng)的半衰期也相繼大于姜黃素乙醇溶液。在LF-EGCG和H（LF-EGCG）穩(wěn)定的單層乳液中姜黃素降解較少的原因可能是EGCG 具有優(yōu)異的抗氧化活性，可以保護(hù)姜黃素免受自由基的攻擊[29]。

表1 姜黃素光降解一級動力學(xué)模型參數(shù)Table 1 Parameters of first-order kinetic model for photodegradation of curcumin

圖7 不同樣品的姜黃素保留率（a）和光降解一級動力學(xué)模型（b）Fig.7 Curcumin retention rate of different samples （a） and first-order kinetic model of photodegradation （b）

綜上所述，由H（LF-EGCG）、SA 和GA 制備的雙層乳液的光穩(wěn)定性顯著強(qiáng)于LF 以及二元復(fù)合物穩(wěn)定的單層乳液。推測雙層乳液顯著抑制姜黃素降解的原因：首先，雙層乳液與單層乳液相比，靜電吸附作用下的陰離子多糖吸附在攜帶正電荷的H（LF-EGCG）所包埋的姜黃素乳液液滴表面，最終形成較厚的界面層。而該界面層的存在極大地降低了姜黃素的降解率，通過隔絕外界環(huán)境中游離擴(kuò)散的自由基達(dá)到保護(hù)作用；第二，體積越大，相應(yīng)的比表面積越小，雙層乳液的液滴粒徑相較于單層乳液較大，因此其比表面積小。比表面積小會導(dǎo)致化學(xué)反應(yīng)效率低下，因此降低了功能因子降解的化學(xué)反應(yīng)速率[29]。

2.8 姜黃素的生物可及性

通過體外消化模型，模擬人體消化過程，分析了姜黃素的生物可及性，結(jié)果如圖8所示。LF 穩(wěn)定的姜黃素乳液生物可及性較低（＜25%），是由于姜黃素與乳鐵蛋白分子或乳鐵蛋白的消化產(chǎn)物結(jié)合，導(dǎo)致其在膠束相中未檢出[30]。不同的姜黃素乳液，其姜黃素的生物可及性存在差異，LF、LFEGCG 和H（LF-EGCG）共價復(fù)合物穩(wěn)定的單層乳液中姜黃素的生物可及性分別為23.54%，31.18%和36.15%；雙層乳液中，GA 穩(wěn)定的乳液中姜黃素生物可及性最高，達(dá)到了69.53%，SA 為60.63%。這些結(jié)果表明，使用多糖尤其是GA 包埋脂質(zhì)液滴增加了轉(zhuǎn)移到膠束相中姜黃素的含量，研究推測可能的原因為：多糖包埋可能有助于控制脂質(zhì)在胃腸道內(nèi)的消化率，包埋后的脂質(zhì)被消化后，再釋放出親脂成分，導(dǎo)致混合膠束中姜黃素的保留率升高[30]；也可能是由于多糖所帶的負(fù)電荷導(dǎo)致靜電排斥作用，減少了模擬消化條件下發(fā)生的液滴聚集[25]。

圖8 不同樣品制備的乳液中姜黃素的生物可及性Fig.8 Bioaccessibility of curcumin in emulsions prepared with different samples

3 結(jié)論

本研究制備了LF-EGCG 二元共價復(fù)合物，研究了蛋白質(zhì)多酚共價復(fù)合物和多糖間的相互作用，利用光譜學(xué)分析了LF、EGCG 及多糖間的相互作用機(jī)理，F(xiàn)TIR 和熒光光譜顯示LF 與EGCG 在堿處理后發(fā)生了共價結(jié)合，多糖則是通過氫鍵結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，通過層層自組裝法構(gòu)建姜黃素乳液，主要探究了界面組成和結(jié)構(gòu)對乳液的流變特性、穩(wěn)定性以及姜黃素生物可及性的影響。研究發(fā)現(xiàn)與單獨使用LF 或LF-EGCG、H（LF-EGCG）二元復(fù)合物穩(wěn)定的乳液相比，添加多糖使液滴的表面多了一層較厚的保護(hù)層，能有效阻止液滴的破裂，抑制姜黃素降解，提高姜黃素的光照穩(wěn)定性和生物可及性。本研究結(jié)果可用于合理設(shè)計具有較好理化穩(wěn)定性的乳液遞送體系，同時可拓寬姜黃素在食品和藥品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。