鹽生草根際耐鹽性木霉菌分離鑒定及其耐鹽性評(píng)價(jià)

謝佳麗，李 寶，劉 佳，張樹(shù)武，徐秉良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

近年來(lái)，由于人們對(duì)自然資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)以及對(duì)環(huán)境資源的巨大破壞導(dǎo)致土壤質(zhì)量嚴(yán)重下降，鹽漬化問(wèn)題已成為影響地球上有限土地資源的重要問(wèn)題所在[1]。據(jù)報(bào)道，全世界超過(guò)20% 栽培地和50%灌溉地已受到鹽漬化的威脅[2]。同時(shí)，土壤鹽漬化已成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵要素，限制農(nóng)作物的生產(chǎn)，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。謝文軍等[5]研究表明，當(dāng)土壤中含鹽量超過(guò)3.5 g·kg?1時(shí)會(huì)大幅降低小麥(Triticum aestivum)的產(chǎn)量。Ghoulam 等[6]研究表明，鹽堿地中Na+和Cl?對(duì)植物的毒害作用極大，可破壞氧化還原平衡，產(chǎn)生大量毒性物質(zhì)，最終對(duì)植物細(xì)胞造成毒害。高鹽堿可使土壤腐殖質(zhì)嚴(yán)重淋失，土壤通氣透水性下降，很容易造成植物萎蔫、中毒和爛根死亡等現(xiàn)象，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。楊志瑩等[8]研究表明鹽脅迫可導(dǎo)致玫瑰(Rosa rugosa)細(xì)胞膜遭到破壞和影響其正常生理功能，進(jìn)而抑制玫瑰的生長(zhǎng)和降低其生物量。因此，對(duì)于鹽堿地的改良和防治已成為農(nóng)業(yè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要內(nèi)容[9]。但目前土壤鹽堿化改良依然利用傳統(tǒng)的化學(xué)手段、農(nóng)業(yè)措施和水利工程等措施[10-12]，而化學(xué)修復(fù)會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染，農(nóng)業(yè)措施和水利工程則存在見(jiàn)效慢和成本高等缺點(diǎn)。因此，利用耐鹽微生物解決土壤鹽漬化問(wèn)題是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

木霉菌(Trichodermaspp.) 屬于無(wú)性態(tài)，絲孢綱絲孢目木霉菌屬[13]的一類分布較為廣泛、適應(yīng)能力極強(qiáng)的土壤習(xí)居性真菌，其對(duì)多種植物病原菌具有較好的拮抗作用，以及對(duì)相應(yīng)病害具有較好的防治作用，在生物防治領(lǐng)域受到廣泛青睞[14-15]。研究表明在鹽脅迫條件下，植物可以通過(guò)合成有機(jī)小分子來(lái)降低細(xì)胞水勢(shì)，從外界環(huán)境中吸收水分[16]，清除活性氧自由基，使其免受鹽脅迫的危害[17]。另外，張樹(shù)武等[18]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)枝木霉(T. longibrachiatum)T6 菌株具有較強(qiáng)的耐鹽活性，其可在鹽脅迫條件下促進(jìn)小麥幼苗的生長(zhǎng)，但是有關(guān)鹽生草(Halogetonarachnoideus)根際土壤中耐鹽木霉菌的分離鑒定及其耐鹽性評(píng)價(jià)等方面尚未見(jiàn)報(bào)道。

為此，通過(guò)對(duì)鹽生草根際鹽堿土中木霉菌的分離，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，以及對(duì)其耐鹽性的評(píng)價(jià)，旨在篩選出耐鹽性較強(qiáng)的木霉菌株，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性并降低鹽害對(duì)植物的影響，有效緩解土壤鹽漬化的影響[19]。研究結(jié)果將為木霉菌應(yīng)用于土壤鹽堿化治理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 根際鹽堿土采集

供試鹽生草根際鹽堿土采自甘肅省武威市民勤縣。當(dāng)?shù)貧夂驐l件干旱炎熱，多為氯化物鹽土，1 m 土層含鹽量可達(dá)0.4%～1.39%，土壤pH 為6.5，植物種類稀少且植被稀疏，主要以梭梭草(Cyperus rotundus)為主。采集土樣時(shí)去除鹽生草根際土壤表面干土，收集0 - 20 cm 土層土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室后室溫風(fēng)干，然后過(guò)0.23 mm 篩，獲得的土樣用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 供試化學(xué)藥品

NaCl 分析純AR (無(wú)色晶體)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根際鹽堿土土壤稀釋液配制

稱取待測(cè)鹽堿土樣10 g 于150 mL 錐形瓶中，加入10 個(gè)玻璃珠和90 mL 無(wú)菌水后放到25 ℃搖床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為130～160 r·min?1，然后將其振蕩1.5～2.5 h，使土壤中的菌物均勻地散落在液體中，然后靜置20～30 min，所得土壤稀釋液為10 倍稀釋液，并利用無(wú)菌水依次稀釋為不同稀釋倍數(shù)的土壤懸浮液(100 和1 000 倍液)。

1.2.2 根際鹽堿土稀釋液中木霉菌的分離

采用平板分離法進(jìn)行鹽生草根際鹽堿土中木霉菌的分離。將配制好的不同濃度土壤稀釋液依次吸取200 μL 均勻涂布到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上，于超凈工作臺(tái)上風(fēng)干150～200 s 后置于25 ℃ (16 h·d?1)光照條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)6 次。培養(yǎng)3 d后分別記錄每個(gè)培養(yǎng)基中木霉菌的菌落數(shù)量并觀察其菌落形態(tài)。

1.2.3 根際鹽堿土稀釋液中木霉菌的純化培養(yǎng)

培養(yǎng)3 d 后，挑選菌落形態(tài)類似于木霉菌的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上，對(duì)木霉菌進(jìn)行純化，每個(gè)菌株接種6 皿。待木霉菌產(chǎn)孢后重復(fù)上述步驟，直到菌株純化，并每隔24 h 記錄1 次菌落形態(tài)特征，持續(xù)觀察7 d 后轉(zhuǎn)接至凍存管中進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 根際鹽堿土中木霉菌的分離及篩選

利用含鹽培養(yǎng)基模擬鹽堿土條件，配制800 mmol·L?1NaCl 的PDA 培養(yǎng)基來(lái)篩選耐鹽性較強(qiáng)的木霉菌，以不含鹽的空白PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，中央接種純化的木霉菌株菌餅(d = 5 mm)，并置于25 ℃ (16 h·d?1)光照條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待培養(yǎng)3 d 后，采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑，試驗(yàn)過(guò)程中所有處理和對(duì)照均重復(fù)3 次。

1.2.5 根際分離木霉菌鑒定

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定耐鹽性較強(qiáng)的木霉菌株。

1) 形態(tài)學(xué)鑒定：參考Samuels[20]木霉菌分類方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。具體方法為，將篩選獲得的耐鹽性較強(qiáng)的木霉菌株接種于PDA 平板上，于25 ℃下連續(xù)培養(yǎng)3 d，待剛剛產(chǎn)生綠色孢子時(shí)，觀察其菌落的形態(tài)、顏色，并于顯微鏡下觀察和記錄菌絲、分生孢子梗、分生孢子大小及形態(tài)特征。

2) 分子生物學(xué)鑒定：參考李琳等[21]CTAB (cetyltrimethylammonium ammonium bromide)法提取耐鹽性較強(qiáng)的木霉菌株DNA。將提取的DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并通過(guò)Nano PhotometerTM Pearl 紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取的DNA 濃度進(jìn)行測(cè)定，分裝后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。利用引物ITS-F/ITS-R 擴(kuò)增ITS 片段，使用引物TEF-F/TEF-R 擴(kuò)增TEF 片段。所有引物由上海生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences

3) ITS 和 TEF 片段擴(kuò)增反應(yīng)。ITS 序列：PCR 反應(yīng) 體 系 為2 × Taq PCR MasterMixⅡ 12.5 μL、DNA 3 μL、RNase-Free ddH2O 7.5 μL、上下游引物各1 μL(ITS1-F 和ITS4-R)，反應(yīng)總體系25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

TEF 序 列：PCR 反 應(yīng) 體 系 為2 × Taq PCR MasterMixⅡ 10 μL、DNA 1 μL、RNase-Free ddH2O 7 μL、上下游引物各1 μL (TEF-F 和TEF-R)，反應(yīng)總體系20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為97 ℃預(yù)變性3 min、96 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，循環(huán)重復(fù)35 次，最后在72 ℃下延伸10 min，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

4) 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建：將測(cè)序后獲得的T-ITS 和T-TEF 序列分別提交到NCBI 網(wǎng)站上，并利用Blast 1.83 X 軟件進(jìn)行序列比對(duì)。然后根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中木霉菌株的ITS 和TEF 序列信息，利用MEGA5 軟件進(jìn)行多重序列比較，并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap = 500)進(jìn)行菌株分子生物學(xué)鑒定。

1.2.6 木霉菌耐鹽性評(píng)價(jià)

利用含鹽培養(yǎng)基模擬鹽堿土條件，參考趙忠娟等[22]報(bào)道的關(guān)于木霉菌耐鹽活性的鑒定方法，制作含鹽量分別為100、200、400、600 和800 mmol·L?1的PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行木霉菌耐鹽性評(píng)價(jià)，對(duì)照為不含鹽的空白PDA 培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，中央接種耐鹽性較強(qiáng)的木霉菌株菌餅(d = 5 mm)，置于25 ℃ (16 h·d?1)光照條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑并觀察其形態(tài)，并于培養(yǎng)第3 天時(shí)使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定其產(chǎn)孢量。試驗(yàn)過(guò)程中所有處理和對(duì)照均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際鹽堿土中木霉菌的分離及篩選

經(jīng)分離純化共獲得4 株木霉菌株，分別命名為T-A、T-B、T-C 和T-D，且在鹽濃度為800 mmol·L?1時(shí)，菌株T-B 的耐鹽性最強(qiáng)。T-A、T-B、T-C 和T-D相對(duì)生長(zhǎng)速率分別為18.72、22.72、17.44 和22.44 mm·d?1。

2.2 木霉T-B 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

木霉T-B 菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 時(shí)生長(zhǎng)較快，基本覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿并產(chǎn)生大量孢子，菌落正面形態(tài)呈現(xiàn)放射狀向四周生長(zhǎng)，邊緣大量分布著白色的菌絲，中央?yún)^(qū)域可以產(chǎn)生大量分生孢子；菌落背面在培養(yǎng)初期為白色，在后期為淡黃色(圖1A和圖1B)。分生孢子梗的分枝情況大多為輪生，很少有單生，分枝幾乎接近直角。瓶梗主要為單生，呈燒瓶形，中部略微膨大，頂部和基部出現(xiàn)了稍微溢縮的現(xiàn)象(圖1C)，分生孢子呈無(wú)色，為橢圓形或卵圓形(圖1D)。結(jié)合上述所有形態(tài)特征，依據(jù)《木霉分類與鑒定》[23]對(duì)其進(jìn)行鑒定，初步將木霉T-B菌株確定為長(zhǎng)枝木霉菌。

圖1 木霉菌株T-B 的形態(tài)特征Figure 1 Morphological characteristics of Trichoderma strain T-B

2.3 木霉T-B 菌株分子生物學(xué)鑒定

利用通用引物ITS-1 和ITS-4 以及特異性引物TEF-R 和TEF-F 分別對(duì)分離得到的木霉菌進(jìn)行ITS 和TEF 基因序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的條帶分別約為600 和300 bp (圖2)，并將PCR 擴(kuò)增獲得的T-ITS 和T-TEF 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后得到的序列分別提交到NCBI 網(wǎng)站，利用Blast1.83 X 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA5 軟件進(jìn)行多重序列比較，并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap = 500)進(jìn)行菌株分子生物學(xué)鑒定，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征初步將木霉T-B 菌株鑒定為長(zhǎng)枝木霉(圖3A 和圖3B)，其與長(zhǎng)枝木霉的相似度為99.18%。

圖2 ITS 和TEF 擴(kuò)增序列的凝膠電泳圖Figure 2 Gel electrophoresis diagram of ITS and TEF amplified sequences

圖3 木霉T-B 菌株ITS 和TEF 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 ITS and TEF phylogenetic tree of Trichoderma T-B strain

2.4 長(zhǎng)枝木霉耐鹽性評(píng)價(jià)

不同濃度NaCl 處理對(duì)長(zhǎng)枝木霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量具有不同程度的影響。隨著NaCl 溶液濃度升高，長(zhǎng)枝木霉菌的生長(zhǎng)速率呈降低趨勢(shì)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，不同濃度NaCl 溶液對(duì)其生長(zhǎng)的影響效果呈降低趨勢(shì)。與對(duì)照相比(圖4ⅠA和圖4ⅡG)，當(dāng)NaCl 溶 液 濃 度 為100 mmol·L?1時(shí)(圖4ⅠB 和圖4ⅡH)，在培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)(3～7 d)長(zhǎng)枝木霉菌的菌落直徑與對(duì)照無(wú)顯著差異(P> 0.05) (表2)。當(dāng)NaCl溶液濃度為200 mmol·L?1時(shí)，在培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)(3～4 d) (圖4ⅠC 和圖4ⅡI)，長(zhǎng)枝木霉菌的菌落直徑與對(duì)照無(wú)顯著差異(P> 0.05) (表2)。當(dāng)NaCl 溶液濃度為400 mmol·L?1時(shí)(圖4ⅠD 和圖4ⅡJ)，在培養(yǎng)3～5 d時(shí)長(zhǎng)枝木霉菌的菌落直徑與對(duì)照差異顯著(P< 0.05)，較對(duì)照菌落直徑有所降低，但是在培養(yǎng)6～7 d 時(shí)，其菌落直徑與對(duì)照相比無(wú)顯著差異(P> 0.05)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性(表2)。當(dāng)NaCl 溶液濃度為600 和800 mmol·L?1時(shí)(圖4ⅠE、ⅠF、ⅡK 和ⅡL)，在培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)(3～7 d)長(zhǎng)枝木霉菌的菌落直徑與對(duì)照相比有所降低，且存在顯著差異(P< 0.05) (表2)。同時(shí)，與對(duì)照相比，當(dāng)NaCl 溶液濃度為100 mmol·L?1時(shí)，在培養(yǎng)7 d 時(shí)長(zhǎng)枝木霉菌的產(chǎn)孢量顯著高于對(duì)照(P< 0.05)，較對(duì)照增加9.17% (表2)。然而，當(dāng)NaCl溶液濃度大于100 mmol·L?1時(shí)，在培養(yǎng)7 d 時(shí)長(zhǎng)枝木霉菌的產(chǎn)孢量顯著低于對(duì)照(P< 0.05) (表2)。

圖4 不同濃度NaCl 溶液對(duì)長(zhǎng)枝木霉菌落生長(zhǎng)的影響Figure 4 Effect of NaCl solution at different concentrations on the growth of Trichoderma longibrachiatum

表2 不同濃度NaCl 溶液對(duì)木霉T-B 菌株生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of NaCl solution at different concentrations on the growth of Trichoderma T-B strain

3 討論與結(jié)論

木霉菌是一類非常重要的多功能有益微生物，不僅具有抗菌殺線的作用，而且具有改良土壤環(huán)境和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[24]。Zhang 等[25]研究表明長(zhǎng)枝木霉T6 菌株具備較強(qiáng)的耐鹽能力，并且其在鹽脅迫下對(duì)小麥的生長(zhǎng)具有較好的促生作用。趙忠娟等[22]研究表明哈茨木霉(Tricoderma harzianum)和深綠木霉(T. viride)在高鹽脅迫下菌絲生長(zhǎng)量可達(dá)到50%。本研究結(jié)果表明，從鹽生草根際土壤中分離獲得一株具有較好耐鹽活性的長(zhǎng)枝木霉T-B 菌株，于培養(yǎng)第3 天時(shí)，在鹽濃度為100 mmol·L?1時(shí)其生長(zhǎng)良好，不僅菌絲生長(zhǎng)速度較快，而且能產(chǎn)生大量孢子；當(dāng)NaCl 溶液濃度為800 mmol·L?1時(shí)，篩選出的耐鹽木霉菌株T-B 菌絲生長(zhǎng)量在50%以上，具有較強(qiáng)的耐鹽性，為后續(xù)研究高耐鹽性木霉菌株對(duì)鹽漬化土壤的修復(fù)能力奠定了基礎(chǔ)。

Cuppers 等[26]研究表明，低鹽有助于促進(jìn)孢子的產(chǎn)生，在低鹽時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，但高鹽對(duì)木霉菌的抑制作用較強(qiáng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl溶液濃度為100 mmol·L?1時(shí)，在培養(yǎng)時(shí)間段(3～7 d)內(nèi)長(zhǎng)枝木霉菌的生長(zhǎng)速率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，并且其產(chǎn)孢量顯著高于對(duì)照，表明低鹽狀態(tài)下木霉菌的生長(zhǎng)不僅不會(huì)受到限制，反而會(huì)促進(jìn)其產(chǎn)孢，但是隨著NaCl 溶液濃度的升高，NaCl 溶液對(duì)長(zhǎng)枝木霉菌的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，其產(chǎn)孢量隨著鹽濃度增加呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)，表明高鹽狀態(tài)下木霉菌菌絲生長(zhǎng)以及產(chǎn)孢均受到限制，與前期的研究結(jié)果一致。

因此，本研究分離鑒定獲得一株具有較強(qiáng)耐鹽性的長(zhǎng)枝木霉菌株，并發(fā)現(xiàn)其在低鹽濃度處理下具有較好的耐鹽活性，但是有關(guān)其耐鹽作用機(jī)制及其對(duì)作物的解鹽促生作用還有待進(jìn)一步研究。