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    PGT-A前冷凍囊胚活檢與新鮮囊胚活檢的比較分析

    2021-11-22 06:28:08張京業(yè)張曉麗吳克良
    關(guān)鍵詞:整倍體滋養(yǎng)層囊胚

    張京業(yè),張曉麗,吳克良

    [山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院),濟(jì)南 250012]

    臨床上,許多患者夫婦經(jīng)歷著反復(fù)著床失敗和早期流產(chǎn)的痛苦,而其所移植的胚胎有染色體異常,可能是造成這一結(jié)果的重要原因[1]。據(jù)研究,高齡患者卵子和胚胎的非整倍體率非常高[2]。事實(shí)上,40歲以上患者體外獲取的卵子50%以上都是非整倍體[3]。胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing for aneuploidies,PGT-A)通常被用于篩選染色體正常胚胎進(jìn)行移植,從而改善輔助生殖結(jié)局[4]。胚胎活檢是進(jìn)行PGT-A的重要前提。胚胎活檢可在不同的胚胎發(fā)育階段進(jìn)行,目前常用的活檢時(shí)期包括卵裂期活檢[5],極體活檢[6],桑椹胚活檢[7]以及囊胚期活檢[8]。囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢由于其對(duì)胚胎的低損傷以及低嵌合性,是廣泛應(yīng)用的活檢時(shí)期[9-10]。常規(guī)的PGT-A周期中,取卵后第五天(D5)或第六天(D6)進(jìn)行的是新鮮囊胚活檢。待囊胚發(fā)育到適合冷凍時(shí),取部分滋養(yǎng)層細(xì)胞行染色體檢測(cè),該枚囊胚則需冷凍保存。若染色體結(jié)果正常,則該枚囊胚可被解凍并移植。然而在常規(guī)體外授精(in vitro fertilization,IVF)/胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)周期中,有些患者因反復(fù)著床失敗、反復(fù)流產(chǎn)或流產(chǎn)物基因檢測(cè)有異常而被臨床大夫診斷為需進(jìn)行胚胎遺傳學(xué)篩查。如這些患者本周期還有剩余冷凍囊胚,則應(yīng)將這些冷凍囊胚做遺傳學(xué)篩查。而此時(shí)新鮮囊胚活檢方法將不再適用,需將冷凍囊胚先解凍復(fù)蘇,再進(jìn)行囊胚活檢,這種方法稱之為凍胚活檢法。相比較于鮮胚活檢法,凍胚活檢法增加了一次胚胎冷凍和復(fù)蘇的過程。本研究旨在研究?jī)雠呋顧z法增加的胚胎冷凍和復(fù)蘇過程是否會(huì)對(duì)胚胎活檢的效率和結(jié)果產(chǎn)生影響,探討凍胚活檢法對(duì)胚胎潛在的損傷和移植結(jié)局的影響。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象 回顧分析2016年1月至2018年12月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院就診的患者。實(shí)驗(yàn)組共納入96例患者,納入標(biāo)準(zhǔn):助孕方式為IVF或ICSI;移植后出現(xiàn)胚胎停育且流產(chǎn)物的基因檢測(cè)有異常,或有3次及以上的著床失敗、早期流產(chǎn);有剩余冷凍囊胚;醫(yī)患溝通后患者要求將剩余囊胚行PGT-A檢測(cè)。對(duì)照組為同一天進(jìn)行囊胚活檢的104例常規(guī)PGT-A患者,患者夫妻雙方染色體沒有異常,其行PGT-A的指征包括高齡、反復(fù)種植失敗,反復(fù)流產(chǎn)及胚胎停育且流產(chǎn)物的基因檢測(cè)有異常。對(duì)照組(鮮胚活檢組):即常規(guī)的PGT-A周期,其流程為“活檢-冷凍-復(fù)蘇-移植”。實(shí)驗(yàn)組(凍胚活檢組),其具體流程為“冷凍-復(fù)蘇-活檢-冷凍-復(fù)蘇-移植”。

    1.2 囊胚冷凍復(fù)蘇以及活檢

    1.2.1 囊胚解凍 凍存的囊胚采用玻璃化解凍程序(K-SIBW-5000,COOK公司)進(jìn)行解凍。

    1.2.2 囊胚活檢 實(shí)驗(yàn)組囊胚活檢流程:等復(fù)蘇的囊胚擴(kuò)張后,用適當(dāng)?shù)募す饽芰繉?duì)囊胚進(jìn)行簡(jiǎn)單皺縮,后用較小的激光能量對(duì)活檢位置的透明帶進(jìn)行開縫。隔著透明帶上的縫隙,利用負(fù)壓將所要活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞吸入活檢針,再用激光沿著透明帶和活檢針的交接處切割滋養(yǎng)層,最后完全分離所需要的滋養(yǎng)層細(xì)胞[11]。將活檢的組織送去做PGT-A檢測(cè)。對(duì)照組囊胚活檢流程:將D5/D6完全擴(kuò)張的囊胚經(jīng)上述方法活檢,活檢的組織送去做PGT-A檢測(cè)。

    1.2.3 囊胚冷凍 活檢后的囊胚采用玻璃化冷凍程序(K-SIBV-5000,COOK公司)進(jìn)行冷凍保存。

    1.2.4 囊胚移植 待胚胎染色體檢測(cè)結(jié)果出來后,經(jīng)遺傳咨詢后選取染色體正常的囊胚進(jìn)行移植。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件,連續(xù)性參數(shù)比較采用t檢驗(yàn),比值類數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 凍胚活檢組與鮮胚活檢組的基本概況 凍胚活檢組96例患者共冷凍452枚囊胚,除去本周期之前移植的82枚,共370枚囊胚參與本研究。鮮胚活檢組104例患者的328枚囊胚均參與了本研究。圖1展示了兩個(gè)組胚胎從活檢到移植的基本流程。

    圖1 凍胚活檢組與鮮胚活檢組的基本概況

    2.2 凍胚活檢組與鮮胚活檢組囊胚解凍后的存活情況 凍胚活檢組與鮮胚活檢組患者的年齡、PGT-A指征、活檢囊胚數(shù)、囊胚評(píng)分、第二次解凍存活率以及總的解凍存活率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    表1 兩組胚胎冷凍復(fù)蘇后的存活率比較

    2.3 凍胚活檢組與鮮胚活檢組胚胎移植后的臨床結(jié)局 凍胚活檢組的96例患者中,76例存在染色體正常的胚胎,并進(jìn)行了一次或多次移植,最終53例獲得了活產(chǎn)結(jié)局。鮮胚活檢組的104例患者中,74例進(jìn)行了移植,最終49例獲得了活產(chǎn)結(jié)局。兩組的平均移植次數(shù)和活產(chǎn)率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組胚胎移植后的著床率(P=0.630)和流產(chǎn)率(P=0.985)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凍胚活檢組胚胎染色體的整倍體率顯著高于鮮胚活檢組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)。見表2。

    表2 凍胚活檢組與鮮胚活檢組臨床結(jié)局的比較

    3 討 論

    本文中凍胚活檢組對(duì)應(yīng)的是IVF/ICSI周期,鮮胚活檢組對(duì)應(yīng)的是PGT-A周期,兩組的胚胎培養(yǎng)過程完全一致。而囊胚的冷凍、解凍和移植操作都有成熟的體系和操作規(guī)程,由經(jīng)驗(yàn)豐富的胚胎學(xué)家進(jìn)行操作。囊胚的活檢操作、活檢時(shí)機(jī)的把握均由實(shí)驗(yàn)室頂級(jí)胚胎學(xué)家來完成,而且本研究中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組囊胚的活檢是在同一天由同一位胚胎學(xué)家完成的,最大限度減少了兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性。本文中兩組活檢的囊胚均達(dá)到了冷凍標(biāo)準(zhǔn)。囊胚評(píng)分采用Gardner法[12],只有評(píng)分為(4~6)BC以及以上(AA,BA,AB,BB)的囊胚才符合標(biāo)準(zhǔn)。胚胎評(píng)分是由本實(shí)驗(yàn)室有著豐富胚胎評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的胚胎學(xué)家完成的,使得胚胎質(zhì)量不會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上所述,與鮮胚活檢組相比,凍胚活檢組的特殊性僅為增加了一次囊胚冷凍和復(fù)蘇的過程。

    凍胚活檢的方法能得以進(jìn)行,一個(gè)重要的前提就是胚胎活檢方法的改進(jìn)。本中心的吳克良首次提出了非提前打孔囊胚活檢法[11],該方法針對(duì)四期囊胚,利用激光打孔及透明帶的束縛作用,迅速地完成滋養(yǎng)層組織的活檢,大大減少了對(duì)囊胚發(fā)育的干預(yù)。這種新的活檢方法應(yīng)用到凍胚活檢,只需在復(fù)蘇的囊胚充分復(fù)張后就可進(jìn)行活檢,極大提高了活檢的靈活性。

    凍胚活檢法針對(duì)的是IVF/ICSI周期中有剩余冷凍囊胚,但因反復(fù)種植失敗或流產(chǎn)物基因檢測(cè)有異常等,而符合PGT-A指征的患者。它使得這類患者的剩余冷凍囊胚得以利用,在一定程度上避免了開始新的PGT-A周期對(duì)患者身體以及經(jīng)濟(jì)上的損害。

    凍胚活檢方法可能存在潛在的缺陷。常規(guī)的PGT-A技術(shù)中囊胚活檢過程屬于侵入性操作,可能對(duì)胚胎活性產(chǎn)生影響。而之后的冷凍及復(fù)蘇過程都有可能造成囊胚的損傷甚至死亡。而凍胚活檢法對(duì)胚胎進(jìn)行兩次冷凍復(fù)蘇過程,可能會(huì)造成更多的囊胚死亡,同時(shí)存活的囊胚發(fā)育潛能也可能受到一定影響。然而,有文獻(xiàn)表明,合適的囊胚組織活檢對(duì)胚胎的損傷很小,基本不會(huì)造成囊胚的死亡[13-14]。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期以來的囊胚活檢操作結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

    鮮胚活檢組中囊胚只進(jìn)行一次冷凍復(fù)蘇過程,將其作為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)凍胚活檢組的總存活率為96.5%,與鮮胚活檢組的98.9%相比,沒有明顯降低。這與文獻(xiàn)報(bào)道的囊胚復(fù)蘇存活率高達(dá)95%以上相吻合[13,15],因此認(rèn)為該方法對(duì)囊胚死亡率的影響可以接受。本研究結(jié)果顯示,凍胚活檢組與鮮胚活檢組的胚胎著床率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此認(rèn)為凍胚活檢法對(duì)囊胚發(fā)育潛能的影響微乎其微。

    本研究中兩組患者的平均年齡無差異,但均大于35歲。研究表明,胚胎非整倍體的比例在>35歲的患者中顯著提高[16]。因此,兩組患者行PGT-A檢測(cè)是有必要的。結(jié)果顯示,凍胚活檢組胚胎的整倍體率顯著高于鮮胚活檢組。表明本研究中IVF/ICSI周期的患者雖然做了PGT-A檢測(cè),但仍未達(dá)到做常規(guī)PGT-A的標(biāo)準(zhǔn)。若需開始新的周期,則需綜合考慮多種因素來決定助孕方式。

    綜上所述,通過回顧分析本中心2016~2018年凍胚活檢與鮮胚組活檢的結(jié)果,認(rèn)為本中心采用的凍胚活檢方法安全且有效。凍胚活檢法與鮮胚活檢法之間互為補(bǔ)充,為改善PGT-A患者的臨床結(jié)局作出重要貢獻(xiàn)。

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