鐵皮石斛的組織培養(yǎng)和快速無性繁殖

姜燕燕，李建民

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實驗室，青海 西寧 810008)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)，又叫黑節(jié)草，是蘭科石斛屬多年生草本植物，主要分布在浙江、云南及陜西省等地方。鐵皮石斛的生長環(huán)境分為兩類，一類是生長在丹霞地貌上，這類鐵皮石斛對生長環(huán)境和氣候條件要求苛刻，通常生長在通風(fēng)陽光充足的地方，海拔高，分布均在400～1 200 m高處，相對濕度20%～80%，對于透光度沒有要求；另一類是以云南、廣西等省區(qū)為代表的生長在深山林區(qū)里的鐵皮石斛，適于生長的溫度為18～30 ℃，晚間溫度為10～13 ℃，溫差保持在10～15 ℃，常常附生于樹上或巖石上，適于溫暖、濕潤和半陰的環(huán)境，不耐寒冷。

由于鐵皮石斛具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值，在民間有“救命仙草”的美譽，現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)表明鐵皮石斛具有抗氧化、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫力等諸多功效[1]。鐵皮石斛是一類野生資源，因為人們過度采挖已經(jīng)造成生境嚴(yán)重惡化，該種類瀕臨滅絕[2]，為了保護這一珍稀物種，近年來，國內(nèi)外廣泛開展了鐵皮石斛組培快繁技術(shù)的研究，已經(jīng)有很多通過組織培養(yǎng)的方法來培育大量的試管苗。所以，解決鐵皮石斛資源緊缺問題的一個有效途徑就是要進行人工栽培[3]。目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)和快速繁殖的外植體主要有根尖[4]、種子[5，7]、莖段[8，9]等，本研究是以鐵皮石斛的帶節(jié)莖段為外植體，在前人研究的基礎(chǔ)上以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基[9～11]，通過不同種類和濃度的激素配比，選出各個階段最適宜的培養(yǎng)基，從而探索鐵皮石斛的快速繁殖的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

由青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組培實驗室提供的鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)植株。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 實驗中所有的培養(yǎng)基都為MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30.0 g/L、酪蛋白0.3 g/L、瓊脂7 g/L。培養(yǎng)基pH =5.8，121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度25.3(+2)℃，光照時間為16 h/d?？諝鉂穸葹?9% RH。

1.2.2 外植體的獲取和材料的滅菌 剪取長勢良好，生長健壯，無病蟲害的鐵皮石斛的幼嫩枝條，用洗衣粉水洗滌，然后流水沖洗20 min，用吸水紙吸干，用剪刀將莖段切成長度為1～1.5 cm的帶節(jié)小莖段，用70%酒精浸泡30～40 s，用無菌水沖洗2～3次，再用0.1%升汞消毒5～7 min，浸泡后用無菌水沖洗3～4次，待用。

1.2.3 無菌材料的培養(yǎng) 將消毒好的外植體，用剪刀剪掉藥物浸透的莖段部分，然后將外植體接種在郭洪波等[12]研究的(MS+0.4 mg/LNAA+5 mg/L6-BA)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)生長一致的無菌苗，每瓶培養(yǎng)基中接種3個帶節(jié)莖段，接種后，觀察腋芽的萌發(fā)及生長狀況，統(tǒng)計污染率。

1.2.4 不定芽的誘導(dǎo)和增殖 待無菌苗生長穩(wěn)定，不再受到污染，以6-BA、NAA、GA為3個因素，每個因素設(shè)計3個水平，采用L9(34)正交實驗設(shè)計(見表1，2)每組處理接種10瓶，每瓶接種3個莖段，每天觀察并記錄不定芽的生長狀況，統(tǒng)計不同處理的誘導(dǎo)出芽率和增殖系數(shù)。誘導(dǎo)率的計算公式為：誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出芽苗數(shù)/未污染的接種數(shù)；叢生芽增殖系數(shù)的計算公式為：增值系數(shù)(%)=叢生苗數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.2.5 不定芽的生根 待叢生苗長至2～3 cm時，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，加入不同濃度的NAA，分別為0.2、0.3和2 mg/L，IBA的濃度為0和1.5 mg/L，不同濃度進行隨機搭配，每個處理接種3瓶，每瓶接3個，觀察并記錄不定芽生根的情況。15 d后統(tǒng)計生根率，從而選出最佳的激素配比。其中，計算生根率的公式為：生根率(%)=生根株數(shù)/接種的外植體數(shù)。

表1 不定芽的誘導(dǎo)

表2 不定芽的增殖

表3 不同種類激素對不定芽誘導(dǎo)作用效應(yīng)的檢驗

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌材料的培養(yǎng)

通過模仿郭洪波等[12]的實驗，將消毒好的外植體接種到(MS+0.4 mg/LNAA+5 mg/L6-BA)的培養(yǎng)基上，獲取實驗所需的生長正常的帶芽植株。

2.2 不同激素濃度及配比對不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

2.2.1 不同激素濃度及配比對不定芽誘導(dǎo)的影響 采用Excel 2010軟件統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，并用SPSS 21.0軟件進行方差分析。不同種類激素對不定芽誘導(dǎo)作用效應(yīng)的檢驗結(jié)果見表3，由表3可知，因素B和C的P值分別為0.425和0.393，都大于0.05，那么這兩個因素對實驗結(jié)果的作用不顯著，即NAA和GA對鐵皮石斛不定芽的誘導(dǎo)率的影響作用不顯著；因素A的P值為0.026，小于0.05，說明因素A對實驗結(jié)果的作用顯著，即6-BA對鐵皮石斛不定芽的誘導(dǎo)率的影響作用顯著，如圖1所示，當(dāng)6-BA的濃度較低時，少量出芽，生長速度緩慢，誘導(dǎo)率低。當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到2 mg/L時，誘導(dǎo)率達(dá)到92.9%。

對因素A下的三個水平進行多重比較，結(jié)果見表4，該表顯示的是兩兩水平比較，其中，1～3的P值為0.135，大于0.05，說明因素A的水平1和3之間沒有顯著差異，水平1和2以及水平2和3的P值分別為0.027和0.014，都小于0.05，說明因素A在這兩組水平之間有顯著差異。

表4 6-BA不同濃度之間的比較

表5 不同種類和濃度激素的最佳組合

2.B

3.C

最佳組合中應(yīng)先選擇因素A，由表5可知，對A變量來說，水平2最佳，而因素B和C沒有顯著影響，但是最佳組合的選擇取決于實驗結(jié)果的取值方向，本實驗的結(jié)果為鐵皮石斛的誘導(dǎo)率，即越大越好，則最佳組合為A2B2C2，即2 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+0.2 mg/LGA。

2.2.2 不同激素濃度及配比對不定芽增殖的影響

表6 不同種類激素對不定芽增殖作用效應(yīng)的檢驗

表7 6-BA不同濃度之間的比較

表8 不同種類和濃度的最佳組合1.A

2.B

3.C

由表6的檢驗結(jié)果可知，因素B和因素C的P值分別為0.460和0.651，都大于0.05，那么這兩個因素對實驗結(jié)果的作用不顯著，即NAA和6-BA對鐵皮石斛不定芽的增殖的影響作用不顯著；因素A的P值為0.028，小于0.05，說明因素A對實驗結(jié)果的作用顯著，即6-BA對鐵皮石斛不定芽的增殖的影響作用顯著，如圖4，5所示，不定芽增殖系數(shù)較高，苗健壯。

對因素A下的三個水平進行多重比較，結(jié)果見表7，該表顯示的是兩兩水平比較，其中，1～3的P值為0.104，大于0.05，說明因素A的水平1和3之間沒有顯著差異，水平1和2以及水平2和3的P值分別為0.015和0.034，都小于0.05，說明因素A在這兩組水平之間有顯著差異，即6-BA濃度較低時，增殖系數(shù)低，隨著6-BA濃度的不斷提高，不定芽的增殖系數(shù)逐漸升高，當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L時，不定芽的增殖系數(shù)較高，達(dá)4.01倍。

最佳組合中應(yīng)先選擇因素A，由表8可知，對A變量來說，水平2最佳，而因素B和C沒有顯著影響，但是最佳組合的選擇取決于實驗結(jié)果的取值方向，本實驗的結(jié)果為鐵皮石斛的增殖系數(shù)，即越大越好，則最佳組合為A2B2C2，即1 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.2 mg/LGA。

2.3 不同激素濃度及配比對不定芽生根的影響

根據(jù)外植體不定芽的生根現(xiàn)象可以知道，如圖5所示，在沒有添加任何激素的情況下，不定芽只有少許生根，根細(xì)，生長緩慢；由表9可以知道，只添加NAA促進不定芽的生根，當(dāng)NAA處于低濃度時，不定芽的生根率會隨著其濃度的升高，逐漸升高；當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.3 mg/L時，叢生苗的生根率為88%，達(dá)到最大，如圖6所示，生根較多，出現(xiàn)肉質(zhì)根；當(dāng)其濃度超過0.3 mg/L時，不定芽的生根率逐漸下降；IBA對不定芽的生根沒有影響。

表9 不同種類的激素及濃度對叢生苗生根的影響

3 討論

由前人的文獻報道可知[9～11]，用于鐵皮石斛組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基大多數(shù)為MS，1/2 MS培養(yǎng)基，李瑩等[13]研究了4種基本培養(yǎng)基(B5、N6、1/2MS、MS)對鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)的影響，其中，MS和1/2 MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，但MS培養(yǎng)基中的幼芽葉片濃綠，平均芽長可以達(dá)到1. 73 cm，明顯高于1 /2 MS培養(yǎng)基幼苗的平均芽長1. 45 cm。而B5、N6的芽誘導(dǎo)率較低，且幼芽長勢明顯不如MS培養(yǎng)基中的幼苗。所以，選取MS培養(yǎng)基為最佳基本培養(yǎng)基。

同時，激素的種類和濃度對鐵皮石斛不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根有著重要的作用，該研究結(jié)果表明，6-BA對不定芽的誘導(dǎo)和增殖的影響作用顯著，這與歐陽凡等[14]人的研究結(jié)果相同，另外當(dāng)6-BA濃度達(dá)到2 mg/L時，不定芽的誘導(dǎo)率可達(dá)到92%，這與李瑩等[13]人的研究結(jié)果是一樣的，但不同的是，對于不定芽增殖系數(shù)來說，本實驗最佳的6-BA濃度為1 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)4.01，琚淑明等[15]人認(rèn)為NAA對鐵皮石斛不定芽的生根有很明顯的促進作用，何俊平等[16]人認(rèn)為，NAA濃度為0.2 mg/L時，生根效果較好，該實驗卻得出不定芽生根最佳的NAA濃度為0.3 mg/L。本實驗結(jié)果僅僅是理論上對不同種類和濃度激素的最佳配比組合，且該結(jié)果也只成立于本實驗條件范圍內(nèi)。

圖1 不定芽的誘導(dǎo)

圖3 叢生芽的增殖

圖5 叢生苗的生根

圖2 不定芽的誘導(dǎo)

圖4 叢生芽的增殖