青海不同產(chǎn)區(qū)羌活抗菌活性比較

李美雎，劉 葉，尚 軍，陳海娟

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008)

羌活為傘形科植物羌活(Notopterygiumincisum)或?qū)捜~羌活(Notopterygiumforbesii)的干燥根莖和根。性味與歸經(jīng)：辛、苦，溫，歸膀胱、腎經(jīng)。功能與主治：散寒、驅(qū)風(fēng)除濕、止痛。用于風(fēng)寒感冒，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，風(fēng)濕痹痛，肩背酸痛[1]。羌活化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有香豆素、揮發(fā)油、甾醇、氨基酸、有機(jī)酸等[2～7]。其中羌活含有2個(gè)活性成分falcarindiol(鐮葉芹二醇)和phenethyl ferulate(苯乙基阿魏酸酯)，對金黃色葡萄球菌有明顯的抗菌活性[8，9]。

實(shí)驗(yàn)通過天然藥物體外抗菌活性篩選方法，篩選出羌活抗菌活性部位，并以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產(chǎn)氣桿菌(Enterobacteraerogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、變形桿菌(Proteusvulgaris)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)評價(jià)不同產(chǎn)地羌活抗菌活性，以期為羌活抗菌活性藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 隔水恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)微量移液器(1 000 μL、200 μL、50 μL)、超聲波清洗器 (SB-5200TDT)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-35HD)、無菌操作臺、臺式低速離心機(jī)(TD5A)。

1.1.2 藥品與藥材 取采挖于青海省紅軍溝、松多、久治、大通、互助等地的羌活藥材，將其粉碎后過60目篩，密閉保存，備用。陽性藥物青霉素鈉購買于中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌這7株用于羌活活性部位篩選和抗菌活性比較的指示菌均來自于中國普通微生物菌種保藏中心，于-20 ℃低溫冰箱凍存，實(shí)驗(yàn)前3～4 h復(fù)活使用。

1.2 方法

1.2.1 羌活抑菌活性部位制備 將羌活藥材粉碎，過60目篩，以料液比1∶8，用無水乙醇超聲提取2 h，共3次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得羌活粗提取物浸膏。加水將其制成混懸液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，干燥，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定各羌活提取物，加入1 mLDMSO超聲溶解，搖勻，精密量取0.2 mL樣品液于10 mL容量瓶中，加25%的DMSO定容至刻度，即供試品溶液。

1.2.3 陽性藥溶液的制備 將青霉素鈉(80萬單位)用25%DMSO稀釋至5萬單位；空白組設(shè)為25%DMSO溶液。

1.2.4 菌懸液的配置 將實(shí)驗(yàn)菌活化后，加入無菌水輕輕刮下菌苔并按1∶9的比率稀釋成1×104倍，即菌懸液，備用。

1.2.5 抑菌活性考察

1.2.5.1 給藥方案及分組 空白組加入240 μL25%DMSO溶液；陽性組加入240 μL5萬單位青霉素鈉；實(shí)驗(yàn)組加入240 μL羌活不同部位供試品溶液，每組設(shè)3個(gè)平行組，重復(fù)3次。

1.2.5.2 抑菌活性部位篩選及比較 在無菌條件下，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備不同產(chǎn)地的羌活抑菌活性部位，運(yùn)用牛津杯法考察羌活不同提取部位的抗菌活性，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以x±s(此公式表示數(shù)值偏差平均數(shù)的變動范圍，其中x表示平均數(shù)，s表示方差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羌活不同部位的抑菌作用

由表1可知，羌活5個(gè)活性部位對糞腸球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌效應(yīng)，與空白對照組相比除了水層對糞腸球菌和大腸桿菌抗菌效應(yīng)差異不顯著外，其它部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且不同部位間的抗菌效應(yīng)強(qiáng)弱不同，其中石油醚、水層及正丁醇3個(gè)部位對糞球菌抑菌效應(yīng)差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；水層部位對大腸桿菌抑菌效應(yīng)差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氯仿部位與其它4個(gè)部位相比，對兩種菌的抑菌效應(yīng)均較強(qiáng)，差異極顯著(P<0.01)，故選取氯仿部位作為寬葉羌活抑菌活性部位。

表1 羌活不同部位間的抑菌作用

2.2 不同產(chǎn)地羌活的抑菌作用

由表2可知，不同產(chǎn)地羌活對受試菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性。與空白組相比紅軍溝、互助、大通產(chǎn)地羌活均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；松多、久治產(chǎn)地羌活除對銅綠假單胞菌的抑菌效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外，對其它菌的抑菌效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。其中，對陰溝腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是紅軍溝產(chǎn)地的羌活，顯著高于其它產(chǎn)地羌活，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；對大腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是松多產(chǎn)的羌活，顯著高于其它產(chǎn)地羌活，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；對產(chǎn)氣桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是松多產(chǎn)的羌活，顯著高于久治產(chǎn)的羌活，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，與其它產(chǎn)地羌活差別不顯著；對變形桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是紅軍溝產(chǎn)地的羌活，與其它產(chǎn)地羌活差別不顯著；對糞腸球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是紅軍溝產(chǎn)地的羌活，顯著高于其它產(chǎn)地羌活，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；對銅綠假單胞菌抗菌效應(yīng)較弱，整體效果不佳；對金黃色葡萄球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是久治產(chǎn)的羌活，與互助產(chǎn)羌活相比差異顯著(P<0.05或0.01)，與其它地區(qū)產(chǎn)羌活差異不顯著。

表2 不同產(chǎn)地羌活抑菌作用比較

3 討論

自從磺胺類藥物和青霉素應(yīng)用于臨床上，抗菌藥物得到廣泛使用，但是細(xì)菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的問題也日益突出，嚴(yán)重威脅人類健康，中藥發(fā)展幾千年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明不少中藥具有抗菌活性、副作用小、很少產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，現(xiàn)在人們更傾向于選擇中藥進(jìn)行抗菌研究[10]。有研究報(bào)道，復(fù)方川紫方具有抗菌消炎、通絡(luò)止痛、行氣活血散瘀等功能，由川芎、紫草、羌活等十余味藥組成[11]。

不同產(chǎn)地羌活對受試菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但對每一種菌的抗菌活性表現(xiàn)出一定的選擇性，提示羌活氯仿活性部位具有廣譜抗菌效應(yīng)，可作為羌活抗菌藥物開發(fā)物質(zhì)基礎(chǔ)。經(jīng)過體外抗菌活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羌活的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水層、正丁醇5個(gè)活性部位，具有不同的抗菌效應(yīng)，其中氯仿部位較其它部位抗菌效應(yīng)更強(qiáng)(P<0.05)；不同產(chǎn)地羌活抗菌活性體現(xiàn)不一樣，對7個(gè)膽囊炎相關(guān)菌的作用不同，與空白組相比，紅軍溝、互助、大通產(chǎn)地的羌活抗菌活性顯著高于對照(P<0.05或0.01)，松多、久治產(chǎn)地的羌活除對銅綠假單胞菌的抑菌效應(yīng)無差異，對其它菌的抑菌效應(yīng)顯著增加(P<0.05或0.01)。由于本實(shí)驗(yàn)將人體給藥最大劑量換算為體外給藥劑量，所以關(guān)于羌活氯仿活性部位量效關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。