池蝶蚌IRAK4基因的克隆及功能

周 葉，王小敏，洪一江

(1.南昌大學生命科學學院，南昌 330031;2.江西省水產動物資源與利用重點實驗室，南昌 330031)

白細胞介素受體相關激酶(Interleukin(IL)-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[1]，在toll樣受體(TLR)和IL-1受體(IL-1r)[2]信號通路中起重要的支架和磷酸化作用[3]。TLR和I-1R是模式識別和細胞因子受體的兩個大家族，分別參與了炎癥和免疫信號對宿主機體的保護[4-5]。TLRs能夠識別病原體或各種病原體相關分子模式(PAMPs)，如TLR4識別LPS。TLR4識別革蘭氏陰性菌細胞壁，通過脂多糖結合蛋白(LBP)識別，并單體化脂多糖多聚體，促進TLR4二聚化和隨后的快速信號轉導，通過CD14和TLR4-MD-2受體復合物實現(xiàn)細胞識別[6-10]。CD14和TLR4-MD-2受體復合物對于TLR4應答于LPS是不可或缺的[11-12]。當TLR4的TIR結構域結合MyD88后，MyD88通過一個稱為“myddosome”的復雜死亡結構域(DD)招募白介素-1受體相關激酶(IRAK)家族成員，IRAK1、IRAK2、IRAK3(或IR AKM)和IRAK4[13]。

IRAK4是IRAK亞型中最上游的激酶，它通過絲氨酸和蘇氨酸殘基的反式自磷酸化招募RAK1或IRAK2。IRAK1或IRAK2依次招募組建到腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)以及傳遞信號轉導，導致活化NF-κB和激活MAP[2,14]。最終調控炎癥基因轉錄以及形成轉錄因子AP-1，調控IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子[15]。IRAK4在Toll樣受體(TLR)信號轉導和先天免疫應答中發(fā)揮著支架和磷酸化的重要功能[16]。在刺激下，MyD88和TLRs的TIR結構域相作用，MyD88再通過兩個分子Death結構域的相互作用，IRAK4被募集到MyD88上。近幾年來，IRAK4的功能在宿主免疫信號通路中的重要性引起了人們的廣泛關注。對哺乳動物的研究表明，IRAK4缺陷小鼠對LPS和CPG誘導的休克完全耐受，并且對病毒和細菌攻擊的反應嚴重受損，這是因為受損的TLR/IL-1R介導的促炎細胞因子以及趨化因子的誘導所引起的[17-18]。，表明IRAK4可能參與先天免疫應答和適應性免疫應答。IRAK4與IRAK1和TRAF6相互作用，其過表達可誘導NF-κB和MAP激酶通路激活[20]。然而，Qin等[21]發(fā)現(xiàn)，在人IRAK4缺陷細胞與野生型或不具激酶活性的IRAK4重組，其TLR/IL-1介導的信號通路沒有差異。令人驚訝的是，在IRAK4 D329A突變體的研究中，發(fā)現(xiàn)D329A突變體與IRAK1的關聯(lián)顯著減弱，降低了修飾IRAK1的水平，表明IRAK4激酶活性僅部分負責IRAK1的修飾，IRAK4支架活性在IRAK1的修飾中起主要作用[22]。同時Saurav等人還發(fā)現(xiàn)IRAK4激酶活性對調節(jié)MyD88、IRAK4和IRAK1與IRAK4激酶活性之間的相互作用很重要，削弱IRAK4和MyD88之間的相互作用[22]。另外，在草魚中通過核細胞溶質提取分析發(fā)現(xiàn)，過度表達CiIRAK4對草魚細胞中和轉錄因子κBp65的核轉位幾乎沒有影響，但能促進IRF5向細胞核的易位，然而它們之間的促進作用與IRAK4和IRF5之間的相互作用無關[23]。這些結果表明IRAK4的功能多樣。

另外，在池蝶蚌、三角帆蚌、牡蠣、和扇貝等軟體動物中發(fā)現(xiàn)它們可以應答于LPS，但在貝類TLR4信號通路中還存在爭議[24-26]，在太平洋牡蠣基因組中發(fā)現(xiàn)了10個MyD88-like基因和3個IRAK-like基因，其中兩種MyD88和一個IRAK4能夠發(fā)生相互作用[27-28]?？傮w而言，有關貝類MyD88、IRAK4的功能研究較少，TLR4信號通路的免疫機制還不是很清楚。池蝶蚌是本實驗室從日本引進的優(yōu)質淡水珍珠蚌，為了解淡水貝MyD88依賴的信號通路和免疫的具體機制，本研究克隆了池蝶蚌IRAK4(以下簡稱HsIRAK4)全長，對其進行生物信息學分析，探究了LPS誘導下的組織表達規(guī)律、HsIRAK4與HsMyD88相互作用，以期認識池蝶蚌MyD88依賴的信號通路和免疫分子機制。

1 材料與方法

1.1 池蝶蚌、樣品處理和收集

池蝶蚌均取自江西省撫州市池蝶蚌良種場。挑選3齡健康池蝶蚌，為適應新的生活環(huán)境，需在經曝氣的水族箱內暫養(yǎng)1周。

將池蝶蚌分別分別編碼為0，6，12，24，36，48以及72 h 7組，每組3只，每只注射100 μL的10 mg·mL-1的LPS，分別于注射0，6，12，24，36，48以及72 h后收集每組個體的組織標本。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

使用TaKaRade的RNAiso Plus提取總RNA。按照SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒的說明書操作將RNA反轉成cDNA，用于RACE PCR克隆HsIRAK4序列。利用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR中分析HsIRAK4的表達。本研究所用的引物均由上海生工合成，見表1。

表1 實驗所用引物及用途

1.3 池蝶蚌IRAK4 cDNA的克隆與序列分析

從本實驗室以得到的池蝶蚌轉錄組數(shù)據(jù)中獲HsIRAK4基因的部分片段的基礎上設計引物見表1。分別以5′RACE-Ready cDNA為模板，用UPM通用引物分別和5′、3′端的GSP引物進行RACE PCR。

將獲得的全長序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行ORF框預測，推導出相信的氨基酸序列，分析相應蛋白結構，并在NCBI上進https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl行氨基酸同源比對，用ClustalX1.83和MEGA軟件構建NJ系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復1 000次。使用NetPhos服務器預測了絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點。(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。在網(wǎng)址上預測蛋白的結構。

1.4 LPS誘導下HsIRAK4與HsMyD88 mRNA表達分析

LPS誘導后，混合提取3只池蝶蚌各個組織(血、心、肝外、腎、閉殼肌、斧足、性腺、腸、鰓)的總RNA，反轉成cDNA模板；根據(jù)熒光定量試劑TB Green?PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)以β-Action作為內參基因進行RT-PCR檢測。設置3個平行組。按照2-△△Ct方法和GraphPad Prism 8.3.0軟件的雙尾T-TEST計算實驗結果。

1.5 質粒的構建

將HsIRAK4的開放閱讀框(ORF)和死亡結構域(Death)分別插入到PGEX-4T-1載體中，構建表達質粒PGEX-4T-1-HsIRAK4-ORF和PGEX-4T-1-HsIRAK4-Death，使目標蛋白帶上Gst標簽蛋白。另外HsMyD88的死亡結構域(Death)插入到Pet-32a載體中，構建表達質粒Pet-32a-HsMyD88-Death，目標蛋白帶上His標簽蛋白。DNA測序證實了所有結構。構建質粒所用引物見表1。

1.6 在Rosetta菌中進行原核表達

把構建好的PGEX-4T-1-HsIRAK4-ORF、PGEX-4T-1-HsIRAK4-Death和Pet-32a-HsMyD88-Death以及空載質粒PGEX-4T-1、Pet-32a分別轉化到Rosetta菌。通過向培養(yǎng)基中添加誘導劑IPTG進行蛋白誘導。每隔2 h取1 mL菌液并離心收集菌體，在10%SDS-PAGE蛋白膠上跑膠鑒定蛋白誘導情況。

1.7 HsIRAK4與HsMyD88蛋白的純化

根據(jù)小量誘導的條件，進行大量誘導。誘導后收集菌體沉淀，用Binding bufferr多次吹懸，然后進行超聲波破碎，4 ℃ 13 000 g離心，取上清；按照說明書進行標簽樹脂裝柱，再將對應標簽的蛋白上清液添加到柱子中，控制流速；上樣完畢后，加入適量的Washing buffer清洗雜蛋白，控制好流速；最后加入Elution buffer洗脫并收集目的蛋白，取10 μL收集的目的蛋白進行SDS-PAGE蛋白膠電泳，鑒定蛋白純化的情況。

1.8 GST-Pulldown和Western Blot(WB)

為了驗證HsIRAK4與HsMyD88蛋白之間的相互作用，將純化好的GST標簽蛋白和His標簽蛋白進行GST-Pulldown實驗。GST-Pulldown實驗中使用的標簽樹脂是Gst-Beads是GE公司的GST sepharose 4B，按其說明書進行操作。Western Blot中使用Gst抗體(Gst標簽多克隆一抗和HRP標記的羊抗兔二抗)檢測Gst融合蛋白是否孵育在樹脂上以及使用康為世紀公司的含HRP標記物的抗-His標簽的兔多克隆抗體來檢測His融合蛋白與Gst融合蛋白是否相結合。實驗設為Gst-HsIRAK4-ORF和His-HsMyD88-Death(實驗組)、Gst-HsIRAK4-Death和His-HsMyD88-Death(實驗組)、Gst-HsIRAK4-ORF和His(對照組)、Gst-HsIRAK4-Death和His(對照組)、Gst和His-HsMyD88-Death(對照組)、Gst和His(對照組)6組。

2 結果

2.1 HsIRAK4基因序列的生物信息學分析

2.1.1HsIRAK4蛋白氨基酸組成分析

HsIRAK4基因的全長cDNA序列為2 617 bp，5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)為146 bp，3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)為797 bp，圖1，其ORF框為1 674 bp，共編碼557個氨基酸，包含2個保守結構域，N端的死亡結構域(DD)和一個中心激酶結構域(KD)。經在線軟件ExPASY推導出HsIRAK4基因編碼557個氨基酸，預測分子質量為62.379 KDa，等電點為5.34，該蛋白顯弱酸性。在該氨基酸序列中Leu占有比最高為10.4%，Trp占有比最低為0.7%。并且該氨基酸序列含有48個磷酸位點，其中含有4個酪氨酸(Tyr)，13個蘇氨酸和31個絲氨酸。

2.1.2 HsLITAFs與其它物種LITAF的同源比對

氨基酸序列多重比對結果顯示HsIRAK4同其他物種一樣，含有保守的死亡結構域和中央蛋白激酶結構域，如圖2所示。并且無脊椎動物的IRAK4蛋白比脊椎動物的稍長，這是由于位于DD和KD之間的額外殘基造成。

2.1.3HsIRAK4基因的系統(tǒng)進化樹分析

我們從NCBI在線數(shù)據(jù)庫中找到了19個物種的IRAK4的最長ORF框的氨基酸序列進行比對，通過ClustalX1.83和MEGA軟件構建的HsIRAK4基因系統(tǒng)進化樹，圖3。主要分為兩大支，無脊椎動物和有脊椎動物。另外，無脊椎動物里面又分為軟體動物和節(jié)肢動物。其中HsIRAK4與青蛤的同源性最高，與軟體動物聚在一支，和魚類、靈長類不在一支，說明HsIRAK4在結構和功能上更接近其他軟體動物，也是IRAK家族的成員。

注：分叉處表示500次重復抽樣計算所得的置信度，標尺長度表示每個位點發(fā)生0.1次置換;各物種白細胞介素受體相關激酶IRAK4序列登錄號為:Haliotis discus discus(APW79904.1);Haliotis rufescens(AGZ03661.1);Haliotis diversicolor(ADC53123.1);Cyclina sinensis(ALA99938.1);Mizuhopecten yessoensis(OWF56124.1);Crassostrea gigas(ANC27958.1);Crassostrea virginica(XP_022343079.1);Mytilus coruscus(QCO95271.1);Mytilus coruscus(AYN70022.1);Mytilus galloprovincialis(AHI17286.1);Penaeuspenicillatus(QCQ82552.1)Scylla serrata(AFZ95002.1);Oncorhynchus mykiss(CBI63173.1);Salmo salar(NP_001135238.1);Tinamus guttatus(KGL77859.1);Homo sapiens(6EG9_A);Macaca fascicularis(EHH66202.1);Macaca mulatta(NP 001129573.1)。

2.2 LPS誘導下各組織中HsIRAK4與HsMyD88 mRNA表達

在LPS誘導下，通過熒光定量檢測HsMyD88與HsIRAK4 mRNA分別在不同時間段、不同組織的表達，結果如圖4，5。

t/h

t/h

HsMyD88的mRNA結果顯示：在0 h，HsMyD88在肝胰腺的表達水平最高，為血的12.20倍，其次是性腺(8.25倍)、鰓(5.68倍)、外套膜(5.66倍)、腎(5.38倍)、腸(5.13倍)、斧足(4.61倍)、閉殼肌(1.53倍)、心臟(0.93倍)。與0相比，在6 h除閉殼肌、鰓、腎，其它組織均出現(xiàn)下調，且除心組織，其它組織均出現(xiàn)顯著性。閉殼肌、性腺和腎都在12 h出現(xiàn)一個第一個高峰，其中血和斧足均在24和48 h達到峰值。0～6 h時間段，閉殼肌出現(xiàn)輕微上調，并且在12 h達到高峰，之后開始下調，36～72 h恢復接近原來0 h的表達值。在鰓組織中，0～24 h時間段，出現(xiàn)輕微的上下調，但在36～72 h出現(xiàn)明顯的上調，并在48 h達到一個最高峰。在性腺中，12 h達到最高峰。在腎臟中，出現(xiàn)了兩個高峰，12和48 h。在外套膜中，48h達到高峰。

HsIRAK4的mRNA結果顯示：在0 h，HsIRAK4在肝胰腺的表達量最高，為血的9.10倍，其次是性腺(9.10倍)、鰓(6.74倍)、腸(5.70倍)、腎(5.41倍)、斧足(4.10倍)、心臟(3.07倍)閉殼肌(2.06倍)、外套膜(1.74倍)。在6 h，與0 h相比，除心臟，HsIRAK4在其他組織均出現(xiàn)上調；且部分組織出現(xiàn)顯著(腎、外套膜；P<0.05)和及顯著(血、腸、肝胰腺；P<0.01)。在血、閉殼肌、腸和肝組織中，出現(xiàn)6和48 h兩個峰值。斧足則一直呈現(xiàn)上調的趨勢。在鰓中，呈現(xiàn)6和24 h兩個峰值，并且第二個峰值高于第一個。性腺中則是先上調在12 h達到峰值，之后下調。心臟在0～36 h持續(xù)下降，在48 h上升，并且到達最高值。在腎臟中，12 h出現(xiàn)峰值。外套膜則6 h達到最高值。

2.3 HsIRAK4與HsMyD88互作

Gst-HsIRAK4-ORF預測的編碼蛋白約為88 kDa；Gst-HsIRAK4-Death預測的編碼蛋白約為38.8 kDa；His-HsMyD88-Death預測的編碼蛋白約為26 kDa。小量誘導的結果發(fā)現(xiàn)，在25 ℃下200 rmp·min-1誘導4 h下效果最佳。Gst-HsIRAK4-ORF蛋白誘導情況如圖6c所示；Gst-HsIRAK4-Death蛋白誘導情況如圖6a所示；His-HsMyD88-Death蛋白誘導情況如圖6b所示。純化透析的結果通過SDS-PAGE膠檢測，圖7結果顯示。Gst-HsIRAK4-ORF、Gst-HsIRAK4-Death和His-HsMyD88-Death的蛋白以及標簽蛋白(Gst和His蛋白)均已純化出來，Gst-HsIRAK4-Death相比其他兩種蛋白純度更高，Gst-HsIRAK4-ORF蛋白量最低，但不影響后續(xù)GST-Pulldown實驗。

GST-Pulldown的實驗結果通過Western Blot來檢測。即Gst-HsIRAK4-ORF、Gst-HsIRAK4-Death與His-HsMyD88-Death蛋白的相互作用通過GST-Pulldown和Western Blot實驗來驗證它們之間的相互作用關系。在Western Blot實驗中，使用Gst抗體檢測Gst融合蛋白如圖8所示，在圖A、B、C中均檢測到Gst融合蛋白，這些結果說明第一個蛋白也就是Gst融合蛋白成功吸附在了樹脂上。使用His體檢測樹脂上的第二蛋白也就是His融合蛋白。在實驗組His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-Death、His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-ORF Gst均檢測到His融合蛋白條帶，如圖9A所示。而在其他組未檢測到第二個蛋白，圖9A和圖9B。GST-Pulldown實驗是一種用來體外檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用的方法[11]。其原理是將探針蛋白與GST標簽融合，融合蛋白通過GST標簽吸附在親和樹脂上。因此，另一種蛋白能與融合蛋白發(fā)生相互作用，則能夠同時被吸附掛在樹脂上，若這兩種蛋白不能相互結合，則只有Gst融合蛋白吸附在樹脂上。綜上所述，His-HsMyD88-Death分別和Gst-HsIRAK4-Death、Gst-HsIRAK4-ORF蛋白發(fā)生了相互作用，而HsMyD88-Death蛋白并沒有和Gst標簽蛋白發(fā)生相互作用。同時，圖9B顯示，Gst-HsIRAK4-Death蛋白、Gst-HsIRAK4-ORF蛋白、Gst標簽蛋白均不能與His標簽蛋白發(fā)生相互作用。因此通過這6組實驗說明，HsMyD88的Death結構域分別能和HsIRAK4-Death和HsIRAK4-ORF發(fā)生相互作用。

注：圖a：“1”泳道表示0 h加IPTG誘導；“2”泳道表示加IPTG誘導2 h；“3”泳道表示加IPTG誘導4 h；“4”泳道表示未加IPTG誘導4 h；圖b：“1”泳道表示0 h加IPTG誘導；“2”泳道表示加IPTG誘導2 h；“3”泳道表示加IPTG誘導4 h；“4”泳道表示未加IPTG誘導4 h；圖c：“1”泳道表示0 h加IPTG誘導；“2”泳道表示加IPTG誘導2 h；“3”泳道表示加IPTG誘導4 h；“4”泳道表示未加IPTG誘導4 h。

注：“1”泳道表示Gst-HsIRAK4-ORF蛋白；“2”泳道表示Gst-HsIRAK4-Death；“3”泳道表示His-HsMyD88-Death蛋白；“4”泳道表示Gst蛋白；“5”泳道表示His蛋白。

注：圖A:“1”泳道表示His和Gst-HsIRAK4-ORF Gst(對照組)；“2”泳道表示Gst-HsIRAK4-ORF Gst和His-HsMyD88-Death(實驗組)；“3”泳道表示input；圖B:“1”泳道表示input；“2”泳道表示Gst-HsIRAK4-Death和His-HsMyD88-Death(實驗組)；“3”泳道表示Gst-HsIRAK4-Death和His(對照組)；圖C：“1”泳道表示input；“2”泳道表示Gst和His-HsMyD88-Death(對照組)；”3“泳道表示Gst和His(對照組)。

注：圖A:“1”泳道表示input；“2”泳道表示His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-Death(實驗組)；“3”泳道表示His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-ORF Gst(實驗組)；“4”泳道表示His-HsMyD88-Death和Gst(對照組)；圖B:“1”泳道表示input；“2”泳道表示His和Gst-HsIRAK4-Death(對照)；“3”泳道表示His和Gst-HsIRAK4-ORF Gst(對照組)；“4”泳道表示His和Gst(對照組)。

2 討論

池蝶蚌作為無脊椎動物，其免疫系統(tǒng)和哺乳動物相比，還不是很完善。對于抵抗病原體的入侵，僅僅依靠先天免疫系統(tǒng)來發(fā)揮功能。本研究對池蝶蚌的免疫相關基因早期已經分析揭示了多個免疫基因家族及其表達差異。然而，這種蛋白冗余的潛在基礎仍然不清楚。IRAK4基因作為先天免疫系統(tǒng)MyD88依賴型信號通路中的關鍵調控基因，它可以引發(fā)一連串的信號事件，并最終導致炎癥靶基因表達的誘導[29]。其最初是指具有絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶活性的分子，該分子以白細胞介素1誘導的方式與白細胞介素受體共免疫沉淀[30]。哺乳動物表達四種不同的IRAK分子，調節(jié)TLRs信號通路并激活下游因子[31-32]。在太平洋牡蠣中，CgIRAK4含有一個N端DD和一個C端KD，并且通過酵母雙雜交和免疫共沉淀實驗證明了CgIRAK4和CgMyD88之間的相互作用[28]。與其他物種相比，池蝶蚌HsIRAK4也含有DD和KD兩個典型的保守功能域，這有助于其作為MyD88和下游信號蛋白之間的銜接子的功能。在這種相互作用中，DD結構域充當了招募MyD88的媒介[33]。值得注意的是，人類IRAK4中只有R12、V16、R20、E69、T76和N78是保守的[34]。然而，在軟體動物IRAK4中只有R12、T76和N78是保守的[28]。在人IRAK4缺陷細胞中，R12C、C13的突變破壞了IRAK4-MyD88的相互作用[35]，這表明了解IRAK4的每個氨基酸都是有意義的。同時由于無脊椎動物DD和KD之間的額外殘基多于脊椎動物(圖2)，可能造成無脊椎動物IRAK4的功能有異于脊椎動物。多重序列比對顯示這兩個功能域中的HsIRAK4蛋白序列是相對保守的，同時IRAK4基因還具有一個高度保守的賴氨酸殘基，位于ATP結合位點，在ATP水解過程中起關鍵作用[36]。通過系統(tǒng)進化樹我們發(fā)現(xiàn)HsIRAK4最大ORF所對應編碼的蛋白與青蛤同源性最高，和其他軟體動物聚在一支，遠離哺乳動物。這表明HsIRAK4在結構和功能上更接近其他軟體動物，也是IRAK家族的成員。

本研究結果顯示HsIRAK4在池蝶蚌中不同組織中有不同程度的表達特征。發(fā)現(xiàn)HsMyD88和HsIRAK4這兩個基因在池蝶蚌中不同組織中有不同程度的表達特征。0 h的HsMyD88在肝胰腺、性腺和鰓組織中的表達較高，其次是外套膜、腎和鰓等。這一結果李年忠[11]在0 h時間點HsMyD88的表達類似，都是在肝、腎、鰓等免疫組織中高度表達。MyD88在其他物種中也檢測到高度表達，如三角帆蚌的肝胰腺和鰓[37]、長牡蠣的鰓和血細胞[38]、菲律賓蛤蜊的鰓[39]以及中國對蝦的血細胞[40]等。HsIRAK4在各個組織的表達與HsMyD88的表達規(guī)律基本類似，0 h在肝臟中表達最高，其次是腸、性腺、腎、鰓等。這種現(xiàn)象在其他物種中的免疫相關組織中高度表達類似，例如，石斑魚的頭部、腎臟、肝臟、鮑魚的鰓以及牡蠣的血細胞和鰓[41-43]。這些結果表明HsMyD88和HsIRAK4這兩個基因的mRNA表達特征不僅存在物種間的差異還存在組織差異。這種差異性說明HsMyD88和HsIRAK4肯在對病原體的免疫應答過程中發(fā)揮不同的作用。在其他各個時間段點下，肝胰腺、腸、性腺、鰓、腎中的HsMyD88和HsIRAK4 mRNA的表達也相對較高。用LPS導池蝶蚌，導致各個組織的HsMyD88和HsIRAK4的表達上下調。金色葡萄菌誘導三角帆蚌2和6 h后，兩種MyD88的表達水平得到上調。用日本血吸蟲感染釘螺，發(fā)現(xiàn)肝臟中MyD88在6，96 h的表達上調，生殖腺MyD88在6，12，96 h的表達上調，血細胞MyD88在6，48，96 h的表達上調[44]。用LPS或PGN刺激原代血細胞培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝CfMyD88的表達水平低于對照[45]。說明MyD88很有可能參與貝類動物的免疫防御。在大黃魚中，經LPS誘導后，肝臟LcIRAK4在3 h上調，血液LcIRAK4在48 h檢測到急劇上升；而經poly I:C誘導后，肝臟LcIRAK4在12，24和48 h顯著下調，血液LcIRAK4則在6 h達到峰值，隨后逐漸恢復正常水平[46]。在太平洋牡蠣[28]中，經OsHV-1 mvar、V.alginolyticus和poly I:C刺激后，血細胞中CgIRAK4的表達水平分別在6，6 h和24顯著增加，并且分別在6，24 h和24 h達到高峰；同樣在鰓組織中，經V.alginolyticus刺激，CgIRAK4在6 h增加，12 h達到高峰，然后再48～72 h消退，而在poly I:C刺激下，CgIRAK4在24，48 h和72 h表達最高。這些數(shù)據(jù)說明IRAK4很有可能參與貝類動物的免疫防御。MyD88依賴的Toll通路在針對革蘭氏菌的先天免疫應答中起重要的作用，這解釋了本研究中HsMyD88和HsIRAK4基因對LPS誘導的顯著應答反應。因此，我們的結果表明HsMyD88和HsIRAK4參與該免疫過程。

在哺乳動物MyD88依賴信號通路的相關研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4通過橋接分子MAL和MyD88的共同作用下，IRAKs(IRAK1、IRAK4等)DD結構域和MyD88的DD結構域相互作用，進而活化其他下游信號分子，完成信號的傳遞工作[47-49]。在池蝶蚌的研究中，已經通過酵母雙雜交、雙分子熒光互作和GST-pulldown的實驗證明了HsTLR4和HsMyD88能夠在酵母和SMMC-7721細胞以及體外能直接發(fā)生相互作用[11]。這一研究結果證明在淡水貝池蝶蚌的先天免疫中是存在MyD88依賴依賴信號通路。在池蝶蚌中，GST-Pulldown的實驗結果表明HsIRAK4在體外通過DD結構域與HsMyD88的DD結構域發(fā)生特異性的相互作用，這與太平洋牡蠣的研究結果類似。Elizabeth等人表明IRAK4可以通過磷酸化下游底物和獨立于激酶活性發(fā)生的蛋白質-蛋白質相互作用傳遞信號[50]。IRAK4激酶活性在TLR/IL-1R信號轉導中可能在功能上是多余的，因為在用野生型或激酶無活性突變蛋白重建的人IRAK4缺陷細胞中，沒有觀察到途徑被激活的實質性差異[21,51]。因此，我們通過GST-Pulldown實驗(圖9)，發(fā)現(xiàn)在HsIRAK4在ORF框不完整只有DD結構域的情況下也能和與HsMyD88的DD在體外結合,說明HsMyD88可以直接和HsIRAK4的DD結構域發(fā)生相互作用并且這一過程不需要HsIRAK4的激酶屬性。在MyD88依賴途徑中，當配體結合時，TLR通過TIR結構域重新招募銜接分子MyD88。然后MyD88招募IRAK4并啟動細胞內信號級聯(lián)[52]。毫無疑問，IRAK4在TLRs信號中起著關鍵作用。通過LPS對池蝶蚌的誘導分析，可以推測當細胞受到刺激，產生信號級聯(lián)反應，HsTLR接收信號，召集大量的銜接分子HsMyD88，再通過HsMyD88的死亡結構域招募HsIRAK4啟動細胞內的信號級聯(lián)，產生炎癥反應。關于IRAK4是否是軟體動物中唯一介導TLR/IL-1R信號的成員，目前還沒有相關報道。本研究為IRAK4的分子進化提供了證據(jù)，闡明了HsMyD88和HsIRAK4對脂多糖的感染有反應，在池蝶蚌的發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的先天免疫作用。以及證明了HsIRAK4和HsMyD88在體外直接相互作用的關系，間接說明了HsIRAK4在池蝶蚌MyD88依賴的信號通路中具有重要的作用。然而，為了更好地理解HsIRAK4在軟體動物先天免疫中的功能意義，繼續(xù)研究是必要的。