東莞地區(qū)耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌的產(chǎn)酶情況及耐藥性分析

龐彩蓮，劉敏娟，林景濤，陳凱妮，黃嘉瑩，吳品，周正維，許艷茹

東莞市大朗醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 東莞 523770

銅綠假單胞菌(PAE)是臨床上常見(jiàn)非發(fā)酵病原菌，也是當(dāng)前多重耐藥菌較為難治的病原菌之一，近年來(lái)由于亞胺培南等碳青霉烯類(lèi)抗生素的廣泛應(yīng)用，PAE產(chǎn)生了碳青霉烯酶，給臨床抗感染治療造成極大困難[1]。本研究收集東莞地區(qū)感染標(biāo)本中分離的耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌(CRPA)進(jìn)行耐藥分析及碳青霉烯酶表型檢測(cè)，為臨床合理用藥及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2018年1月至2021年6月東莞地區(qū)二、三級(jí)綜合性醫(yī)院在臨床標(biāo)本中分離的CRPA共216株，其中痰標(biāo)本139株，腹腔膿液17株，肺泡灌洗液30株，傷口分泌物12株，尿液10株，胸水3株，血液5株，收集菌株為患者的第一株菌株，剔除重復(fù)株。

1.2 試劑和設(shè)備 血平板、麥康凱平板、M-H瓊脂平板、OXOID藥敏紙片(江門(mén)凱林有限公司)，VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀、比濁儀、GN鑒定卡、GN09藥敏卡等法國(guó)生物梅里埃原裝配套產(chǎn)品(廣州華鑫公司)，亞胺培南緩沖液(上?？圃瓕?shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均來(lái)自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.4 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 取已分純新鮮培養(yǎng)的平板上細(xì)菌，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬褂梅▏?guó)生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀和GN卡、GN09卡進(jìn)行菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.5 PAE產(chǎn)碳青霉烯酶及其表型檢測(cè) 采用2017年CLSI推薦的eCIM試驗(yàn)檢測(cè)CRPA是否產(chǎn)碳青霉烯酶[2-3]。取10μL純菌落于2 mL胰蛋白胨大豆(TSB)肉湯中，放入含10μg美羅培南的無(wú)菌紙片，35℃孵育4 h±15 min，制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希ATCC25922菌懸液，將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MH瓊脂(MHA)平板上，35℃孵育過(guò)夜后，量取抑菌圈直徑，美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，判斷碳青霉烯酶陽(yáng)性。碳青霉烯酶表型檢測(cè)[4]：采用紙片擴(kuò)散法，嚴(yán)格按照藥物敏感性實(shí)驗(yàn)流程及廠家說(shuō)明書(shū)上操作，制備細(xì)菌懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，均勻涂布于MHA平板上，張貼4張亞胺培南(10μg/片)藥敏紙片，紙片中心距離≥25 mm，在其中三張紙片上分別滴加10μL EDTA溶液(0.5 mol/L)、10μL 3-氨基苯硼酸溶液(40 mg/mL)、10μL EDTA溶液(0.5 mol/L)+10μL 3-氨基苯硼酸溶液(40 mg/mL)，35℃培養(yǎng)過(guò)夜后判讀結(jié)果。判定指標(biāo)為若含EDTA溶液抑制劑的亞胺培南抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，則可判斷該菌株產(chǎn)生金屬β內(nèi)酰胺酶，若含3-氨基苯硼酸抑制劑的亞胺培南抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，則可判斷該菌株產(chǎn)絲氨酸酶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用WHONET5.6和SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株來(lái)源 216株CRPA菌株標(biāo)本分布以痰標(biāo)本為主，其中以痰液和肺泡灌洗液最多13.89%，見(jiàn)表1。

表1 216株CRPA菌株標(biāo)本來(lái)源分布及構(gòu)成比

2.2 CRPA產(chǎn)碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果 216株CRPA中產(chǎn)碳青霉烯酶83株，占38.4%(83/216)，其中產(chǎn)絲氨酸酶38株，占17.6%(38/216)，產(chǎn)金屬酶30株，占13.9%(30/216)，同時(shí)產(chǎn)絲氨酸酶+金屬酶15株，占6.9%(15/216)，不產(chǎn)碳青霉烯酶133株，占61.6%(133/216)。

2.3 CRPA的藥敏結(jié)果 216株CRPA的藥敏結(jié)果顯示，亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為96.1%和72.6%，氨曲南耐藥率為50.9%，其他藥物耐藥率均在40%以下，見(jiàn)表2。

表2 216株CRPA的藥敏結(jié)果(%)

3 討論

碳青霉烯類(lèi)抗生素是目前臨床上常用且有效的抗銅綠假單胞菌藥物，耐藥率也在不斷上升。很多報(bào)道PAE耐藥率上升與產(chǎn)酶有關(guān)[5-6]；朱蓓偉等[7]還報(bào)道，PAE的耐藥機(jī)制主要為外膜蛋白Opr-D2缺失和產(chǎn)SPM型金屬酶。東莞地區(qū)216株CRPA碳青霉烯酶表型檢測(cè)結(jié)果顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶共83株，占38.4%，其中產(chǎn)絲氨酸酶38株，占17.6%，產(chǎn)金屬酶(MBLs)30株，占13.9%，同時(shí)產(chǎn)絲氨酸酶+金屬酶15株，占6.9%，不產(chǎn)碳青霉烯酶133株，占61.6%。因此，本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)MBLs只是PAE對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的機(jī)制之一，不是對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的主要機(jī)制，與劉濤等[8]報(bào)道相似。這可能是因?yàn)镻AE固有耐藥性、外膜蛋白Opr-D2缺失、非特異外排泵高表達(dá)作用、外膜通透性降低等導(dǎo)致細(xì)菌耐藥；其次，不合理抗菌藥物使用包括臨床抗菌藥物濫用、患者未遵從醫(yī)囑或未按療程規(guī)范使用抗菌藥物，以及在農(nóng)牧業(yè)和魚(yú)類(lèi)飼養(yǎng)過(guò)程中大量使含有抗菌藥物飼料等情況；醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染預(yù)防與控制措施不當(dāng)，導(dǎo)致交叉?zhèn)鞑ィa(chǎn)生更多的耐藥菌株[9]。

本研究中，菌株來(lái)源分布主要以痰標(biāo)本為主，占64.35%，其次為肺泡灌洗液和傷口分泌物，無(wú)菌體液如胸水和血液比例相對(duì)較低。216株CRPA的藥敏結(jié)果顯示，亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為96.1%和72.6%，耐藥率在50%～70%的有氨曲南，耐藥率在30%～50%的有哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、環(huán)丙沙星，耐藥率在30%以下的有哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、左旋氧氧沙星。與曾婷等[10]報(bào)道的除哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率最低為50.53%外、其他的耐藥率均≥60%有差異。在CRPA中敏感性最好的是氨基糖苷類(lèi)和阿米卡星，其次為慶大霉素和妥布霉素，敏感性均為75%以上，與王瓊瓊等[11]、張艷芳等[12]報(bào)道相近，因此，在用藥時(shí)首選耐藥率在30%以下的藥物。

據(jù)萬(wàn)永艷[13]報(bào)道，碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的使用量與PAE對(duì)美羅培南、亞胺培南的耐藥率呈正相關(guān)。因此，臨床應(yīng)綜合考慮感染菌的耐藥表型和藥敏結(jié)果，合理選擇抗菌藥物，強(qiáng)化碳青酶烯類(lèi)抗菌藥物臨床應(yīng)用的監(jiān)督管理[14]，對(duì)MBLs陽(yáng)性的感染菌，即使亞胺培南體外藥敏結(jié)果敏感，臨床也應(yīng)慎用，對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥將意味著同時(shí)對(duì)多種抗菌藥物耐藥。

(志謝：東莞市人民醫(yī)院、東華醫(yī)院及兄弟單位提供菌株。)