平喘方調控HMGB1/TLR4通路對哮喘小鼠氣道炎癥的影響

〔摘要〕 目的 觀察平喘方調控高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4（HMGB1/TLR4）通路對哮喘小鼠氣道炎癥的影響，探索其緩解哮喘氣道炎癥的潛在機制。方法 將32只BALB/c小鼠隨機分為4組：空白組、模型組、地米組、平喘方組，每組8只，采用卵清白蛋白（OVA）聯合氫氧化鋁腹腔注射和5% OVA霧化吸入激發(fā)的方法建立哮喘模型，平喘方組按20 mL/（kg·d）灌胃平喘方湯劑，地米組以等量的地塞米松溶液灌胃，空白組和模型組以等量的蒸餾水灌胃，每日1次，給藥干預7 d。各組于最后一次給藥后處死小鼠，收集血清、肺泡灌洗液（BALF）及肺組織。HE染色觀察肺組織病理學改變;免疫組化染色及定量觀察HMGB1、TLR4表達;ELISA法檢測BALF及血清中HMGB1、TLR4、IL-4及IFN-γ表達;RT-PCR檢測肺組織中HMGB1、TLR4 mRNA表達。結果 （1）與空白組比較，模型組小鼠氣道炎性細胞浸潤明顯，氣道壁增厚，管腔狹窄;BALF及血清中HMGB1、TLR4、IL-4含量明顯升高（P<0.01），IFN-γ含量明顯降低（P<0.01）。（2）與模型組比較，地米組、平喘方組小鼠氣道炎癥減輕、管腔狹窄減小;BALF及血清中HMGB1、TLR4、IL-4含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），IFN-γ水平升高（P<0.01）。（3）與地米組比較，平喘方組小鼠氣道炎癥變化不明顯;HMGB1表達增強（P<0.01）;BALF中TLR4、IL-4、IFN-γ含量均明顯升高（P<0.05，P<0.01），HMGB1含量減少（P<0.01）;血清中HMGB1、TLR4含量明顯降低（P<0.01），IL-4、IFN-γ含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結論 平喘方可降低哮喘小鼠HMGB1、TLR4、IL-4含量，升高IFN-γ含量，改善哮喘小鼠肺組織炎癥，其作用機制可能與平喘方抑制HMGB1/TLR4通路的表達相關。

〔關鍵詞〕 哮喘;平喘方; HMGB1/TLR4通路;炎癥

〔中圖分類號〕R256.12? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.007

Effect of Pingchuan Recipe on Airway Inflammation in Asthmatic Mice by

Regulating HMGB1/TLR4 Pathway

WU Shuyan1， YU Jianer2， XUE Zheng1，2*

（1. Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，

Shanghai 200071， China; 2. Institute of Pediatrics of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Institute of

Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200071， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Pingchuan Recipe on inflammation of asthmatic mice by regulating high

mobility group box 1 protein/toll like receptors 4 （HMGB1/TLR4） signaling pathway， and to explore the internal mechanism of relivering airway inflammation in asthma. Methods 32 BALB/c mice were randomly divided into four groups： blank group， model

group， dexamethasone group， Pingchuan Recipe group， with eight mice in each group. Asthma model was established by intraperitoneal injection of ovalbumin （OVA） combined with aluminum hydroxide sensitization and aerosolized inhalation of 5% OVA. Pingchuan Recipe group was given Pingchuan Recipe at 20 mL/（kg·d） by gavage， dexamethasone group was given the same amount of dexamethasone solution by gavage， blank group and model group were given the same amount of distilled water， once a day， for seven days. Mice in each group were sacrificed after the last administration， serum， bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and lung tissue were collected. HE staining was used to observe lungs tissue pathological changes in each group. The positive expression levels of HMGB1 and TLR4 in lungs tissues were observed by immunohistochemical staining and quantification. The expression levels of HMGB， TLR4， IL-4， IFN-γ in BALF and serum were determined by ELISA. RT-PCR was used to detect the expression of HMGB1 and TLR4 mRNA in lungs tissue. Results （1） Compared with blank group， airway inflammatory cell infiltration was obvious， airway wall thickened and lumen narrowed in model group， the content of HMGB1， TLR4 and IL-4 was significantly increased （P<0.01）， while the content of IFN-γ was significantly decreased （P<0.01）. （2） Compared with model group， airway inflammation and lumen stenosis of mice in dexamethasone group and Pingchuan Recipe group were reduced， the content of HMGB1， TLR4 and IL-4 was significantly decreased （P<0.05， P<0.01）， while the level of IFN-γ was increased （P<0.01） in BALF and serum. （3） Compared with dexamethasone group， the changes of airway inflammation in Pingchuan Recipe group were not obvious. The expression of HMGB1 was enhanced （P<0.01）. The content of TLR4， IL-4 and IFN-γ in BALF was significantly increased （P<0.05， P<0.01）， while the content of HMGB1 was decreased （P<0.01）. The content of HMGB1 and TLR4 in serum was significantly decreased （P<0.01）， while the content of IL-4 and IFN-γ was significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Pingchuan Recipe can reduce the content of HMGB1， TLR4 and IL-4， and increase the content of IFN-γ， and improve lungs inflammation in asthmatic mice， the mechanism may be related to the inhibition of the expression of HMGB1/TLR4 pathway by Pingchuan Recipe.

〔Keywords〕 asthma; Pingchuan Recipe; HMGB1/TLR4 pathway; inflammation

支氣管哮喘是以可逆性氣流受限和氣道高反應性為主要特征的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現為喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein， HMGB1）主要定位于炎癥細胞及氣道上皮細胞的細胞核及細胞質，在炎性反應中既可作為早期促炎因子生成介質，又可作為晚期炎性反應的啟動因子，在感染、炎癥及免疫反應中發(fā)揮重要的作用[1-2]。Toll樣受體4（toll like receptors 4， TLR4）作為HMGB1的主要受體，位于細胞膜和細胞質，參與支氣管上皮細胞的損傷修復[2-3]。研究[4]證實，HMGB1/TLR4信號通路在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

平喘方是海派中醫(yī)徐氏兒科學術傳承人虞堅爾教授的經驗方，在臨床上治療小兒哮喘有確切療效[5]。前期研究[6-9]發(fā)現，平喘方可以干預哮喘小鼠樹突狀細胞分化，增加吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase1， IDO1）、T盒子轉錄因子（t-transcription factors， T-bet）表達，減少TLR4、腫瘤壞死因子配體超家族成員4（recombinant tumor necrosis factor ligand superfamily member 4， TNFSF4）、轉錄因子GATA結合蛋白3（GATA binding protein 3， GATA-3）表達，調節(jié)輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2（T helper 1 cell/T helper 2 cell， Th1/Th2）免疫失衡，減輕哮喘氣道炎癥，故推測平喘方可能對HMGB1/TLR4信號通路亦起到干預作用。本研究運用現代分子生物學方法，觀察平喘方調控HMGB1/TLR4通路相關因子的表達，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 動物

清潔級雄性BALB/c小鼠32只，體質量（20±2） g，4～6周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司（合格證編號：2015000516948），飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學市中醫(yī)醫(yī)院SPF級實驗動物房，于溫度20～24 ℃、濕度50%～70%環(huán)境下，IVC-Ⅱ型獨立送風籠具中飼養(yǎng)。小鼠適應性飼養(yǎng)1周，自由飲食。

1.2? 主要藥物

平喘方原方組成：炙麻黃6 g，苦杏仁9 g，紫蘇子9 g，萊菔子9 g，桃仁6 g，花椒目9 g，地龍干9 g，炙甘草6 g，黃芩6 g。中藥購于上海市藥材有限公司，藥物煎煮時按照原方比例組方，煎煮2次。煎煮提取方法參考李儀奎等[10]的方法，配置灌胃濃度為含生藥量5.33 g/mL。醋酸地塞米松片（規(guī)格：0.75 mg/片，批號：H31020793）購于上海信誼藥廠有限公司，配制成濃度為0.075 mg/mL的溶液。

1.3? 主要試劑

卵清白蛋白（ovalbumin， OVA）（批號：A6075）、氫氧化鋁凝膠（批號：239186）均購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司;HMGB1（批號：101141）、TLR4（批號：H203135M）ELISA試劑盒均購于泉州市睿信生物科技有限公司;白介素4（interleukin 4， IL-4）（批號：F4052）、γ-干擾素（interferon γ， IFN-γ）（批號：PI507）ELISA試劑盒均購于上海泛柯實業(yè)有限公司;逆轉錄試劑盒[批號：9458271，賽默飛世爾科技（中國）有限公司];HMGB1抗體（批號：GT12057，上海睿鉑賽生物科技有限公司）;TLR4抗體[批號：ab2097642，艾博抗（上海）貿易有限公司]。

1.4? 主要儀器

ABI-7300型實時熒光定量PCR檢測儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];TG-16M型低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）;DNM-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）;SQ2125型石蠟切片機[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司];PRO200型電動勻漿機（上海弗魯克公司）;Tanon-5200成像系統（上海天能科技有限公司）;PARI BOYN型超聲霧化器（德國帕瑞公司）;霧化箱（自制，40 cm×30 cm×25 cm泡沫箱）。

1.5? 動物分組及模型制備

適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數字表法將小鼠分為4組：空白組、模型組、地米組、平喘方組，每組8只。根據課題組前期摸索的成熟造模條件[11]，將10 g OVA、1 g 氫氧化鋁凝膠溶于100 mL生理鹽水中，配成濃度為10%的致敏液，每次即配即用。除空白組小鼠注射等量的生理鹽水外，其余每只小鼠腹腔注射50 mL/kg致敏液2次，每次間隔1周。末次致敏7 d后，將模型組、地米組、平喘方組的小鼠置于5 L密閉容器中，霧化吸入5% OVA激發(fā)液，1次/d，40 min/次，共7 d;空白組同時給予相同體積的生理鹽水腹腔注射及霧化吸入。

哮喘模型激發(fā)成功的標志[12]：每次霧化時，小鼠出現咳嗽、呼吸加深加快、弓背、口唇四肢末梢紫紺、煩躁甚至跌倒、抽搐等表現。

1.6? 給藥方法

各組均于末次霧化激發(fā)后開始給藥，平喘方組以20 mL/（kg·d）的劑量灌胃平喘方湯劑，地米組以等量的地塞米松溶液灌胃，空白組和模型組以等量的蒸餾水灌胃。1次/d，均灌胃7 d。

1.7? 標本收集與制備

1.7.1? 外周血收集? 所有小鼠在灌胃7 d后予以5%的水合氯醛溶液麻醉。將小鼠固定后，充分暴露其眼球，采取摘除眼球的方法收集小鼠血液并置于枸櫞酸抗凝管中，充分混勻小鼠血液與枸櫞酸，將收集小鼠血液的枸櫞酸抗凝管置于離心機上，離心半徑20 cm，3 000 r/min，離心10 min，離心完畢后收集上層血漿并置于-20 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測。

1.7.2? 肺組織標本制作? 小鼠采集完血液標本后，采取頸椎脫臼離斷脊髓的方法處死所有小鼠，開胸暴露肺臟和心臟，迅速用細繩結扎左肺，剪下左肺組織，立即裝入DEPC水處理過的EP管，置入-80 ℃冰箱冷凍保存，以備RT-PCR待檢;隨后經右心室插管，向其內快速灌注4 ℃的生理鹽水沖洗右肺組織，至肺葉變成白色時取下，并用4%多聚甲醛固定24 h。

1.7.3? 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）收集? 將已暴露肺臟的小鼠回收右肺灌洗液，4 ℃下以2 000 r/min，離心半徑20 cm，離心10 min，離心后以PBS重懸細胞沉淀并涂片，將上清液分裝，-20 ℃保存，用于ELISA檢測。

1.8? 檢測指標及方法

1.8.1? HE染色觀察肺組織病理改變情況? 將由甲醛固定的肺組織放入包埋盒中，分別置于流水及不同濃度的酒精中脫水，于二甲苯中脫蠟后對肺組織進行包埋。對包埋好的組織蠟塊切至每片4 μm，脫蠟、水化后經蘇木精、伊紅染色，將透明的切面滴上樹脂制成玻片，運用光學顯微鏡在鏡下觀察。

1.8.2? 免疫組化法檢測肺組織HMGB1、TLR4表達? 取肺組織樣本切片經脫蠟、水化后，運用檸檬酸鈉緩沖溶液進行抗原修復15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。阻斷內源性過氧化物酶的活性，然后按照最佳稀釋比例滴加一抗，室溫下孵育1 h后運用PBS沖洗3次，加入二抗進行孵育30 min，后運用DAB染色及蘇木精染色，最終放置于二甲苯中透明并封片。運用顯微鏡拍照后分析相關部位，并計算陽性面積。

1.8.3? ELISA檢測血清HMGB1、TLR4、IL-4和IFN-γ水平? 將保存于-20 ℃冰箱的小鼠血清及BALF上清液取出，嚴格按照ELISA試劑盒所附操作說明書操作，在450 nm處測吸光值，測定HMGB1、TLR4、IL-4和IFN-γ的實際濃度。

1.8.4? RT-PCR檢測肺組織HMGB1、TLR4 mRNA表達? 取小塊待測肺組織，加入裂解液進行裂解，按照Trizol方法分別測定肺組織中的目標總RNA表達水平。引物序列見表1。PCR反應條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。融解曲線：65 ℃ 30 s。每個樣品重復3次，擴增結束，記錄Ct值，按照2-△△Ct方法對檢測結果進行統計分析，結果用2-△△Ct表達。

1.9? 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件分析，數據采用“x±s”表示。用One-Way ANOVA進行方差齊性檢驗，如方差齊則進行單因素方差分析，并用LSD、SNK進行兩兩比較;如方差不齊，則運用Lg10+1進行變量轉換后符合方差齊，再用One-Way ANOVA程序進行單因素方差分析，并用LSD、SNK進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組小鼠肺組織HE染色結果

空白組小鼠氣道上皮細胞排列整齊，極少量炎癥細胞浸潤，管腔無明顯狹窄，氣道壁厚度正常;模型組小鼠氣道管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，氣道壁及氣道平滑肌層明顯增厚，同時還可見壞死脫落的氣道上皮細胞，管腔明顯狹窄;地米組及平喘方組小鼠氣道炎癥細胞數量明顯減少，上皮細胞紊亂及管腔狹窄減輕，氣道壁厚度較模型組小鼠明顯減少。見圖1。

2.2? 各組小鼠肺組織HMGB1、TLR4表達水平比較

與空白組比較，模型組HMGB1、TLR4表達明顯增強（P<0.01）;與模型組比較，地米組及平喘方組HMGB1、TLR4表達減弱（P<0.05，P<0.01）;與地米組比較，平喘方組HMGB1、TLR4表達增強（P<0.01）。見圖2、表2。

2.3? 各組小鼠BALF中HMGB1、TLR4、IL-4及IFN-γ含量比較

與空白組比較，模型組HMGB1、TLR4及IL-4含量明顯升高（P<0.01），IFN-γ含量明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，地米組及平喘方組HMGB1、TLR4及IL-4含量明顯降低（P<0.01），平喘方組IFN-γ水平升高（P<0.01）;與地米組比較，平喘方組TLR4、IL-4、IFN-γ含量均明顯升高（P<0.05，P<0.01），HMGB1含量減少（P<0.05）。見表3。

2.4 各組小鼠血清中HMGB1、TLR4、IL-4及IFN-γ含量比較

與空白組比較，模型組HMGB1、TLR4及IL-4含量明顯升高（P<0.01），IFN-γ含量明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，地米組及平喘方組HMGB1、TLR4及IL-4含量明顯降低（P<0.01），IFN-γ含量升高（P<0.01）;與地米組比較，平喘方組HMGB1、TLR4含量明顯降低（P<0.01），IL-4、IFN-γ含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）。見表4。

2.5 各組小鼠肺組織HMGB1、TLR4 mRNA表達水平比較

與空白組比較，其余各組HMGB1、TLR4 mRNA表達水平均明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，地米組、平喘方組HMGB1、TLR4 mRNA表達水平明顯降低（P<0.01）;與地米組比較，平喘方組HMGB1、TLR4 mRNA表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見表5、圖3-4。

3 討論

哮喘在中醫(yī)學中稱為“喘證”或“哮病”，由外因誘發(fā)，觸動伏痰，痰隨氣升，壅塞氣道，氣逆而上，而發(fā)哮鳴氣喘。哮喘的難治性在于痰、瘀互結為患?！疤怠睘橄l(fā)病的主要病理因素，肺內宿痰內伏，外感侵襲，易導致痰結于氣道，肺的宣肅功能失調，氣道攣急，發(fā)為哮喘[13]，故中醫(yī)常選用化痰平喘藥物治療哮喘。虞堅爾教授認為“血瘀”是哮喘發(fā)病的另一病理因素，患兒先天稟賦不足、肺脾氣虛，血行不暢，肺中內生瘀血，與“痰”相合產生痰瘀互結之象，令哮喘遷延難愈[14]。虞堅爾教授在三十余年的臨床實踐種，承前人之理，立化痰祛瘀平喘法，創(chuàng)平喘方，取得很好的效果[15]。課題組臨床研究[16]發(fā)現，平喘方可以改善哮喘發(fā)作期患兒的臨床癥狀，改善肺功能最大呼氣峰流速（peak expiratory flow， PEF）、呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide， FeNO）指標，并降低患兒血清嗜酸性粒細胞計數（eosinophil count， EOS）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E， IgE）表達，從“化痰祛瘀”角度論治小兒哮喘臨床療效已被證實[17]。相關研究[18]認為，中醫(yī)“血瘀”可將現代醫(yī)學中炎癥反應包含在內，如臨床在運用激素治療哮喘時常伴有血液黏稠度增高、血栓素B2升高，進而影響血小板和血流變的指標，加重肺部瘀血及氣道炎癥，當歸可通過抑制TLR4/NF-κB炎癥通路緩解氣道炎癥和血瘀狀態(tài)，達到治療哮喘的目的。平喘方中炙麻黃宣肺平喘，為君藥;苦杏仁、紫蘇子、萊菔子、桃仁活血化瘀、止咳平喘，助麻黃使肺氣宣降有司，痰、瘀之邪得化或從大腸而走，為臣藥;萊菔子、花椒目、地龍、黃芩清肺降氣平喘，共為佐藥;炙甘草補脾益氣、潤肺止咳、調和諸藥，為使藥。平喘方宣肺降氣以定其喘，化痰以治其本，兼化瘀以撼其根，標本兼治，以達平喘之目的。

支氣管哮喘是由多種細胞以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，雖然其發(fā)病機制目前尚不完全清楚，但細胞免疫因子起到了調控、延續(xù)以及級聯放大炎性反應的重要作用[19]。哮喘時，Th1型炎癥因子IFN-γ等合成不足，Th2型炎癥因子IL-4等合成增加，促使炎性細胞呼吸道浸潤，形成呼吸道炎性反應，Thl/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要免疫學機制[20]。平衡Thl/Th2炎性反應有利于減輕呼吸道炎癥，緩解哮喘癥狀，而IL-4、IFN-γ在這一過程中發(fā)揮重要作用[20]。在本研究中，與空白組比較，模型組BALF中IL-4含量明顯升高（P<0.01），IFN-γ含量明顯降低（P<0.01），二者呈現相反方向的變化，提示哮喘模型出現了Thl/Th2平衡紊亂。平喘方組IL-4、IFN-γ變化方向與模型組截然相反（P<0.01），提示平喘方可通過減少IL-4水平、增加IFN-γ水平，改善Thl/Th2平衡紊亂，實現對哮喘氣道炎癥的改善作用。

正常情況下，肺組織HMGB1主要位于細胞核中，處于低表達水平，但對維持肺及氣道的正常生理功能具有重要作用[21-22]。近年來，在動物模型和人類疾病的研究上發(fā)現，氣道上皮受到有害因素攻擊后，HMGB1可被主動釋放到胞外，與其受體TLR4結合，由此引起下游炎性反應遞質如IFN-γ等的釋放，引發(fā)炎性反應的級聯效應，使炎性反應逐級放大[2，23]。TLR4作為HMGB1的主要受體之一，在感受入侵病原體的相關分子模式刺激后，經由胞內信號轉導通路，最終促進IL-12、IFN-γ等細胞因子的產生并釋放到胞外，引起炎性反應，發(fā)揮早期免疫應答的效應[24]。目前普遍認為，Th1/Th2型免疫應答失衡及Th2型優(yōu)勢應答，是哮喘呼吸道炎癥形成的基礎，TLR4通過調節(jié)Th1/Th2型免疫應答在哮喘中發(fā)揮作用[25]?；谏鲜鲇^點，本研究檢測了以Th1/Th2型免疫應答失衡為主要病理生理變化的哮喘模型中HMGB1與TLR4的含量變化，發(fā)現平喘方能減少哮喘小鼠HMGB1、TLR4 mRNA表達，改善氣道炎癥，提示平喘方可能通過抑制HMGB1/TLR4分泌，減輕哮喘肺部炎癥。

綜上所述，平喘方調節(jié)HMGB1/TLR4 通路表達，減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥。

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