青光安顆粒劑含藥血清對(duì)RGC5細(xì)胞損傷模型線粒體自噬及相關(guān)蛋白的影響

劉倩宏 陳立浩 時(shí)健 朱冰瑤 曾令聰 姚小磊

〔摘要〕 目的 觀察青光安顆粒劑含藥血清對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5（retinal ganglion cells-5， RGC-5）損傷模型中線粒體自噬和相關(guān)蛋白的影響。方法 將14只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（3只）和青光安組（11只）。青光安組灌胃青光安顆粒劑，空白對(duì)照組灌胃同等劑量的生理鹽水，1次/d，灌胃7 d，第7天灌胃后提取含藥血清和空白血清。培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞，用谷氨酸毒性模擬青光眼所造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷，CCK8法篩選合適的含藥血清和谷氨酸濃度。細(xì)胞分組為正常細(xì)胞組、空白血清組（谷氨酸+空白血清）、含藥血清組（谷氨酸+含藥血清）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）+空白血清組（谷氨酸+3-MA+空白血清）、3-MA+含藥血清組（谷氨酸+3-MA+含藥血清組）。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，熒光共定位檢測(cè)線粒體自噬發(fā)生情況;Western blot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule associated protein light chain 3， LC3）中LC3-Ⅱ/LC3-I、溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome associated membrane protein1， LAMP1）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 通過CCK8結(jié)果篩選，確定谷氨酸最佳的作用濃度為20 mmol/L，空白血清和含藥血清的作用濃度均為20%。與空白血清組相比，含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組的溶酶體含量顯著降低（P<0.05）。與空白血清組相比，含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組中LAMP1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;與3-MA+空白血清組相比，3-MA+含藥血清組中LAMP1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)水平水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 青光安顆粒劑含藥血清對(duì)青光眼損傷的保護(hù)作用可能通過抑制細(xì)胞的線粒體自噬，調(diào)控LAMP1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白的表達(dá)，從而起到對(duì)RGCs的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 青光眼;視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;青光安顆粒劑;谷氨酸;3-甲基腺嘌呤;微管相關(guān)蛋白輕鏈3;溶酶體相關(guān)膜蛋白1

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.008

Effects of Serum Containing Qingguangan Granule on Mitochondrial Autophagy and Related Proteins in RGC5 Cell Injury Model

LIU Qianhong1，2， CHEN Lihao1，2， SHI Jian1，2， ZHU Bingyao1，2， ZENG Lingcong1，2， YAO Xiaolei1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of serum containing Qingguangan Granule on mitochondrial autophagy and related proteins in retinal ganglion cells-5 （RGC-5） injury model. Methods 14 rats were randomly divided into blank control group （n=3） and Qingguang'an group （n=11）. Qingguang'an group was given Qingguang'an Granule by intragastric administration， and the blank control group was given the same dose of normal saline once a day for 7 days. The drug-containing serum and blank serum were extracted after 7 days of intragastric administration. RGC-5 cells were cultivated， and glutamate toxicity was used to simulate nerve cell damage caused by glaucoma， CCK8 method was used to screen appropriate drug-containing serum and glutamate concentration. Cells were grouped into： normal cell group， blank serum group （glutamate + blank serum）， drug-containing serum group （glutamate + drug-containing serum）， 3-methyladenine （3-MA） + blank serum group （glutamate + 3-MA + blank serum）， 3-MA + drug-containing serum group （glutamic acid + 3-MA + drug-containing serum）. After the cells were cultured for 24 hours， fluorescence colocalization was used to detect the occurrence of mitochondrial autophagy; the expression levels of LC3-II/LC3-I and lysosome associated membrane protein 1 （LAMP1） in microtubule associated protein light chain 3 （LC3） were detected by Western blot. Results Through the screening of CCK8 results， it was determined that the optimal concentration of glutamic acid was 20 mmol/L， and the concentration of blank serum and drug-containing serum were both 20%. Compared with the blank serum group， the lysosome content of the drug-containing serum group， the 3-MA + blank serum group and the 3-MA + drug-containing serum group were significantly reduced （P<0.05）. Compared with the blank serum group， the LAMP1 and LC3-II/LC3-I protein expression levels in the drug-containing serum group， 3-MA + blank serum group and 3-MA + drug-containing serum group were significantly reduced （P<0.05）. Compared with the 3-MA + blank serum group， the LAMP1 and LC3-II/LC3-I protein expression levels in the 3-MA + drug-containing serum group were significantly lower （P<0.05）. Conclusion The protective effect of serum containing Qingguangan Granule on glaucoma injury may be through inhibiting cell mitochondrial autophagy and regulating the expression of LAMP1 and LC3-II/LC3-I， thereby playing a protective effect on RGCs.

〔Keywords〕 glaucoma; retinal ganglion cells; Qingguangan; glutamate; 3-methyladenine; microtubule associated protein light chain 3; lysosome associated membrane protein 1

青光眼為累計(jì)視神經(jīng)及視覺功能的一組疾病，是目前一種不可逆性致盲眼病，其中，中老年患者占據(jù)多數(shù)，且發(fā)病率逐年增高[1]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）在青光眼的治療與防控中起到重要作用，研究[2]表明，青光眼中多種危險(xiǎn)因素均可啟動(dòng)多種凋亡相關(guān)通路，如死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡、線粒體凋亡通路，觸發(fā)核酸內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致RGCs的凋亡，從而造成不可逆性損傷。線粒體自噬是一種分解代謝過程，參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)成分的分離和溶酶體降解，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要[3]。線粒體自噬廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在青光眼發(fā)生發(fā)展的過程中，RGCs自噬溶酶體含量增高，從而引起RGCs的凋亡[4]。青光眼狀態(tài)下，線粒體自噬增強(qiáng)，存在對(duì)RGCs的保護(hù)作用[5-6];但更深入的研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，如果產(chǎn)生自噬的線粒體沒有通過完整的自噬途徑，那么，自噬本身還會(huì)使線粒體通透性增加，線粒體中細(xì)胞色素C釋放入胞漿中，導(dǎo)致RGCs凋亡的發(fā)生。青光安顆粒劑（以下簡(jiǎn)稱“青光安”）是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，前期研究[11-12]證明，青光安對(duì)青光眼患者有良好的療效，能有效改善患者視力、視野、血液流變學(xué)等指標(biāo)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。因此，本研究采用青光安含藥血清作用于體外培養(yǎng)RGCs，通過Western blot檢測(cè)藥物作用后及3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）阻斷劑干預(yù)后引起的線粒體自噬及相關(guān)指標(biāo)表達(dá)變化，以探明青光安對(duì)RGCs線粒體自噬的調(diào)節(jié)作用，闡明青光安保護(hù)視神經(jīng)的作用機(jī)制，以期為中藥復(fù)方的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠14只，雄性，體質(zhì)量140～200 g，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。在溫度20～26 ℃、濕度40%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2? 藥物及細(xì)胞來源

青光安（黃芪30 g，茯苓20 g，白術(shù)10 g，赤芍10 g，生地黃10 g，地龍10 g，紅花5 g，鹽車前子20 g）購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，將115 g青光安超微顆粒用生理鹽水50 mL加熱溶解，配置成每毫升含生藥2.3 g藥材的青光安溶液。RGC-5細(xì)胞（批號(hào)：CC-Y2138）購(gòu)于上海酶研生物科技有限公司。

1.3? 主要試劑和儀器

HAM'S F-12營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)基（Kaighns改進(jìn)型）（21127022，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）;CCK8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（KGA317，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）;線粒體綠色熒光探針（C1048，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;溶酶體紅色熒光探針（C1045，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;3-MA[189490-50MG，默克生命科學(xué)（上海）有限公司];CO2培養(yǎng)箱（BPN-80CW，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;倒置熒光顯微鏡（MF53，廣州市明美光電有限公司）;潔凈工作臺(tái)（BBS-SDC，博科控股集團(tuán)有限公司）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（WD-2102B，北京六一生物科技有限公司）;離心機(jī)（TD4A，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司）

1.4? 含藥血清的制備與干預(yù)

隨機(jī)選取3只大鼠為空白組，其余11只為青光安組。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按體表面積折算的臨床等效劑量計(jì)算，青光安組灌胃5.625 mL/（kg·d）青光安溶液，空白組用生理鹽水灌胃，1次/d，灌胃7 d，第7天灌胃后1 h用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血。離心提取含藥血清和空白血清。將收集的血清在56 ℃下滅活補(bǔ)體30 min，按組別混合后放于-80 ℃冰箱。

1.5? RGC-5細(xì)胞處理

1.5.1? 細(xì)胞培養(yǎng)? 清洗、消化、離心后將細(xì)胞懸液分配至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，做好標(biāo)記，將細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.5.2? 分組方法? 將細(xì)胞分為正常細(xì)胞組、空白血清組（谷氨酸+空白血清）、含藥血清組（谷氨酸+含藥血清）、3-MA+空白血清組（谷氨酸+3-MA+空白血清）、3-MA+含藥血清組（谷氨酸+3-MA+含藥血清組）。

1.5.3? 細(xì)胞干預(yù)方法? 以谷氨酸毒性模擬青光眼損傷模型，其中谷氨酸為20 mmol/L的濃度，20%的空白血清、青光安含藥血清加入，3-MA以5 mmol/L的濃度用作自噬抑制劑，培養(yǎng)24 h。

1.6? 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1? CCK8檢測(cè)? 將RGC-5細(xì)胞消化、重懸，計(jì)數(shù)，鋪板，細(xì)胞密度為7 000個(gè)/孔;待細(xì)胞貼壁后，分別加入10、20、30、40、50 mmol/L的空白血清、含藥血清和谷氨酸，24 h后換成普通的培養(yǎng)基，加入CCK8試劑，后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值，計(jì)算不同藥物濃度作用下細(xì)胞的增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%

1.6.2? 免疫熒光共定位? 在各組細(xì)胞培養(yǎng)板中加入線粒體探針和溶酶體探針的培養(yǎng)液200 μL置于孵育箱37 ℃ 30 min;滴加Hoechst 33342染色液避光孵育30 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6.3? Western blot檢測(cè)? 提取總蛋白后用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，電泳2 h，轉(zhuǎn)膜80 min。一抗（Mouse Monoclonal Anti-GAPDH，用一抗稀釋液稀釋，濃度為1∶2 000）孵育過夜;二抗[辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）用二抗稀釋液稀釋，濃度為1∶2 000]室溫孵育2 h。采用ImageJ軟件分析LAMP1、LC3-I及LC3-II內(nèi)參條帶灰度值。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，方差齊者用單因素方差分析，方差不齊者采用Satterthwaite方法進(jìn)行校正t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? CCK8篩選合適的血清和谷氨酸濃度

與空白組細(xì)胞相比，5個(gè)谷氨酸濃度都顯著抑制了細(xì)胞增殖，且隨著濃度的增加效果更顯著（P<0.05）;空白血清在濃度為5%、10%、15%和20%時(shí)顯著抑制了細(xì)胞增殖（P<0.05）;含藥血清在任何濃度都對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響。根據(jù)本研究及前期研究結(jié)果得出，谷氨酸的作用濃度為20 mmol/L，空白血清和含藥血清的作用濃度均為20%。見圖1。

2.2? 熒光共定位檢測(cè)自噬發(fā)生的情況

與正常細(xì)胞組相比，空白血清組的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與空白血清組相比，含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組的溶酶體含量顯著降低（P<0.05）。見圖2-3。

2.3? Western blot檢測(cè)谷氨酸損傷細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的情況

與正常細(xì)胞組相比，空白血清組、含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組中的LAMP1和LC3-Ⅱ/LC3-I的蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P<0.05）;與空白血清組相比，含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組中LAMP1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;與3-MA+空白血清組相比，3-MA+含藥血清組中LAMP1和LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。見圖4。

3 討論

青光眼是一種老年眼疾病，大多數(shù)患者為60歲以上。由于預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，青光眼的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[13]，青光眼患者最終的治療目的即維持視覺功能與生活質(zhì)量，但目前沒有治療方法可以逆轉(zhuǎn)由青光眼造成的視神經(jīng)病變與RGCs的損傷。事實(shí)上，即使成功控制了眼壓，視神經(jīng)和RGCs的進(jìn)行性損傷也可能繼續(xù)。因此，保護(hù)視神經(jīng)以及RGCs成為青光眼治療過程中不可忽視的環(huán)節(jié)。盡管許多學(xué)者對(duì)視神經(jīng)保護(hù)藥物做出了許多研究，但療效以及給藥劑量仍處于探索階段，如何對(duì)青光眼造成的RGCs損傷進(jìn)行保護(hù)，成為了青光眼治療的重點(diǎn)環(huán)節(jié)[14]。

青光眼即中醫(yī)學(xué)中的“五風(fēng)內(nèi)障”，在五輪辨證中屬于“水輪”，房水屬中醫(yī)學(xué)“神水”范疇，本病由于風(fēng)火痰郁等上犯目竅，至目珠局部氣滯血瘀、神水瘀積，神光不得發(fā)越所致，治療上應(yīng)活血利水，以通血脈、開玄府、宣瘀滯、縮瞳神為基本原則。青光安是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制中藥方劑，以黃芪、白術(shù)、茯苓益氣健脾利水，生地黃、赤芍清熱涼血，紅花活血通經(jīng)、祛瘀止痛，車前子利水、清肝明目，地龍利尿通絡(luò)，全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血利水之功[15]。前期研究[5，6，13，16-18]表明青光安對(duì)于急性高眼壓模型中的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)及篩板有保護(hù)作用，對(duì)其術(shù)后有抑制瘢痕增生的作用;青光安含藥血清能夠使青光眼濾過性手術(shù)細(xì)胞模型自噬增加，降低結(jié)膜下瘢痕生成，從而達(dá)到青光眼濾過性術(shù)后抗瘢痕化作用。

青光眼狀態(tài)下，通過調(diào)控自噬相關(guān)通路能夠影響RGCs凋亡過程：一方面，有學(xué)者證實(shí)自噬的增加促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活[19-20];另一方面，實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞自噬能夠引起神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層視網(wǎng)膜神經(jīng)元的丟失，導(dǎo)致RGCs的凋亡，而通過阻斷自噬通路，則能夠有效減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21-22]，因此，自噬的調(diào)節(jié)作用仍然是未知的。前期研究[5，23-25]發(fā)現(xiàn)青光安能夠抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，對(duì)青光眼模型起到保護(hù)作用，青光安含藥血清能夠阻斷凋亡相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)而抑制細(xì)胞的凋亡。

神經(jīng)元細(xì)胞高度依賴于線粒體自噬的效率，神經(jīng)退行性疾病與線粒體自噬通路的功能障礙息息相關(guān)。青光眼所致視神經(jīng)病變是致盲的主要原因，而RGCs是視網(wǎng)膜視覺通路的最后一個(gè)細(xì)胞元件，是投射到視網(wǎng)膜外的唯一神經(jīng)元，隨著青光眼發(fā)生過程，RGCs即出現(xiàn)進(jìn)行性凋亡，從而導(dǎo)致視神經(jīng)病變。當(dāng)線粒體受損或功能障礙時(shí)，PINK1在線粒體外膜聚集，并且募集Parkin到線粒體膜上，使線粒體外膜蛋白泛素化，泛素化蛋白被受體蛋白識(shí)別（RGCs的受體蛋白為optineurin）;同時(shí)，LC3通過與optineurin等受體蛋白結(jié)合，LC3-I將轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)形式LC3-Ⅱ，其與自噬體的外膜和內(nèi)膜相關(guān)聯(lián)，使線粒體被自噬小泡包裹，隨后的吞噬泡的延展與LC3-Ⅱ/LC3-I的比率相關(guān)，形成自噬體，最終線粒體在溶酶體內(nèi)降解，此為線粒體自噬的終末環(huán)節(jié)，而LAMP1作為一種溶酶體相關(guān)蛋白，其表達(dá)代表了溶酶體的活性變化[26-31]。

LC3-Ⅱ/LC3-I的比率水平已被用于監(jiān)測(cè)線粒體自噬，這個(gè)比例反映自噬過程是否完整[10]。

通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含藥血清在任何濃度都對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響。根據(jù)本研究及課題組前期研究[6，18，32]結(jié)果確定，含藥血清的作用濃度為20%。通過使用谷氨酸毒性模擬青光眼所造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)RGCs損傷時(shí)，青光安含藥血清及3-MA阻斷劑能夠抑制細(xì)胞中線粒體自噬發(fā)生;與空白血清組相比，LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白在含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組中的表達(dá)水平均顯著降低;與3-MA+空白血清組相比，LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白在3-MA+含藥血清組中的表達(dá)水平顯著降低，說明在視神經(jīng)受到損傷后，細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬增加，而通過抑制線粒體自噬途徑，或者通過青光安含藥血清的干預(yù)，降低了線粒體泛素化途徑的中途相關(guān)蛋白表達(dá)，使得RGCs無法通過泛素化途徑完成自噬過程，且青光安的調(diào)控作用比線粒體阻斷劑顯著;與空白血清組相比，LAMP1及LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白在含藥血清組、3-MA+空白血清組和3-MA+含藥血清組中的表達(dá)水平均顯著降低;與3-MA+空白血清組相比，LAMP1蛋白在3-MA+含藥血清組中的表達(dá)水平顯著降低，說明線粒體自噬抑制劑以及青光安能夠在RGCs受損時(shí)通過調(diào)控線粒體自噬終端相關(guān)蛋白，減少細(xì)胞中溶酶體的形成，減少線粒體自噬的發(fā)生，從而起到RGCs的保護(hù)作用，且作用優(yōu)于線粒體阻斷劑。

綜上所述，青光安含藥血清能夠降低LAMP1蛋白的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-I的比值，抑制線粒體自噬的發(fā)展，由此推測(cè)，青光安能夠?qū)GCs起到保護(hù)作用，其作用是否與線粒體自噬相關(guān)通路引起的抑制凋亡作用有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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