TRPV1參與針和灸不同刺激方式對小鼠ghrelin和 GHSR-1α的影響

劉瓊 曹佳男 劉密 謝輝 常小榮

〔摘要〕 目的 通過觀察針刺或熱灸不同刺激方式干預(yù)足三里穴區(qū)對C57BL/6野生型小鼠和TRPV1-/-基因敲除小鼠血漿中腦腸肽（ghrelin）和大腦前額葉皮質(zhì)中生長激素促分泌素受體-1α（GHSR-1α）含量的改變，探討辣椒素受體1（TRPV1）參與針、灸不同刺激方式對胃腸功能調(diào)控通路ghrelin-GHSR-1α調(diào)節(jié)的差異性。方法 24只C57BL/6野生型小鼠隨機分為C57BL/6空白組、C57BL/6針刺組和C57BL/6熱灸組，每組8只;24只TRPV1-/-基因敲除小鼠隨機分為TRPV1-/-空白組、TRPV1-/-針刺組和TRPV1-/-熱灸組，每組8只。C57BL/6空白組和TRPV1-/-空白組不予以處理;C57BL/6針刺組和TRPV1-/-針刺給予手針干預(yù);C57BL/6熱灸組和TRPV1-/-熱灸組給予熱灸干預(yù)。采用ELISA檢測小鼠血漿中g(shù)hrelin含量和Western Blot法檢測小鼠大腦前額葉皮質(zhì)中TRPV1和GHSR-1α表達水平的變化。結(jié)果 C57BL/6野生型小鼠中，與C57BL/6空白組相比，C57BL/6針刺組與熱灸組血漿ghrelin表達水平均顯著降低（P<0.05），前額葉皮層TRPV1含量表達增加（P<0.05）、GHSR-1α降低（P<0.05），但三者在針刺組和熱灸組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。TRPV1-/-基因敲除小鼠中，與TRPV1-/-空白組對比，TRPV1-/-針刺組和熱灸組血漿ghrelin水平和前額葉皮質(zhì)GHSR-1α表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 針刺、熱灸均可通過激活TRPV1的生物活性，影響胃腸功能調(diào)控通路ghrelin-GHSR-1α的調(diào)節(jié)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 針刺;熱灸;足三里;腦腸肽;生長激素促分泌素受體-1α;辣椒素受體1

〔中圖分類號〕R245.8? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.003

Effect of TRPV1 on ghrelin and GHSR-1α in Mice by Participating in Different Stimulation Methods of Acupuncture and Moxibustion

LIU Qiong1， CAO Jianan1， LIU Mi1， XIE Hui2*， CHANG Xiaorong1*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. West Hospital of Chenzhou First People's Hospital， Chenzhou， Hunan 423000， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of different stimulation modalities of acupuncture or pyretic moxibustion in the “Zusanli” （ST36） acupoint on changes of content of plasma ghrelin and growth hormone secretagogue receptor-1 （GHSR-1α） in the prefrontal cortex of C57BL/6 wild-type mice and TRPV1-/- knockout mice， and to explore the difference of capsaicin receptor 1 （TRPV1） involved in acupuncture and pyretic moxibustion stimulation on ghrelin-GHSR-1α regulation of gastrointestinal function pathway. Methods 24 C57BL/6 wild-type mice were randomly divided into C57BL/6 blank group， C57BL/6 acupuncture group and C57BL/6 hot pyretic moxibustion group， with 8 mice in each group. 24 TRPV1-/- knockout mice were randomly divided into TRPV1-/- blank group， TRPV1-/- acupuncture group and TRPV1-/- pyretic moxibustion group， with 8 mice in each group. C57BL/6 blank group and TRPV1-/- blank group were not treated; C57BL/6 acupuncture group and TRPV1-/- acupuncture group were given hand acupuncture intervention; C57BL/6 pyretic moxibustion group and TRPV1-/- pyretic moxibustion group were given pyretic moxibustion intervention. ELISA was used to detect the ghrelin content in mouse plasma， and Western blot was used to detect the changes of TRPV1 and GHSR-1α expression levels in mouse brain prefrontal cortex. Results In C57BL/6 wild-type mice， compared with the C57BL/6 blank group， plasma ghrelin level in C57BL/6 acupuncture group and pyretic moxibustion group was significantly decreased （P<0.05）， while the content of TRPV1 in prefrontal cortex was increased （P<0.05） and GHSR-1α was decreased （P<0.05）， but there was no statistically significant difference between the acupuncture group and pyretic moxibustion group （P>0.05）. In TRPV1-/- knockout mice， compared with the TRPV1-/- blank group， there was no statistically significant difference in plasma ghrelin level and prefrontal cortex GHSR-1α expression level in TRPV1-/- acupuncture group and pyretic moxibustion group （P>0.05）. Conclusion Both acupuncture and pyretic moxibustion can affect the regulation of gastrointestinal functional pathway ghrelin-GHSR-1α by activating the biological activity of TRPV1.

〔Keywords〕 acupuncture; pyretic moxibustion; “Zusanli” （ST36）; ghrelin; growth hormone secretagogue receptor-1; capsaicin receptor 1

針灸是中醫(yī)外治療法的重要組成部分，以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，經(jīng)脈學(xué)說為依據(jù)，針刺和艾灸等方式為治療手段，具有適應(yīng)癥廣泛、療效顯著、不良反應(yīng)少、遠期效果穩(wěn)定等特點。在針灸的眾多適應(yīng)癥中，臨床上以胃腸疾病防治的療效較為突出，如功能性消化不良、消化道潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、便秘等，且被大量臨床與基礎(chǔ)研究所證實[1-4]。隨著研究的不斷深入，針灸通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，而實現(xiàn)對胃腸功能的調(diào)節(jié)作用已成為現(xiàn)階段研究的關(guān)注焦點[5-7]。大腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最大和最復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，而皮質(zhì)是大腦中最為高級和發(fā)達的結(jié)構(gòu)，具有調(diào)節(jié)機體與周圍環(huán)境平衡的作用，尤其對胃腸機能的整體調(diào)控作用也是皮質(zhì)的重要功能之一。相關(guān)研究[8-10]證實，針灸對胃腸道的保護作用是通過調(diào)節(jié)腦腸肽（ghrelin）及其受體蛋白生長激素促分泌素受體-1α（growth hormone secretagogue receptor-1α， GHSR-1α）的表達而起效，更有實驗[11]發(fā)現(xiàn)辣椒素受體1（transient receptor potential vanilloid 1， TRPV1）參與了這一起效的過程，而且發(fā)揮著重要的作用。

近年來，TRPV1參與胃腸道功能的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)成為研究熱點[12]。TRPV1有可能是通過影響外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中g(shù)hrelin受體GHSR-1α的含量，進而促進胃腸運動、調(diào)節(jié)胃酸分泌和保護胃腸黏膜等方面來實現(xiàn)對胃腸疾病的防治作用，也可能是實現(xiàn)腦腸互通的重要通路之一[8-11]。本研究以此為切入點，探討針刺、熱灸不同刺激方式干預(yù)足三里穴區(qū)對C57BL/6同源野生型小鼠和TRPV1-/-基因敲除小鼠血漿中g(shù)hrelin和前額葉皮質(zhì)中GHSR-1α含量的改變，探討TRPV1是否介導(dǎo)針刺、熱灸對胃腸功能調(diào)控通路ghrelin-GHSR-1α的調(diào)節(jié)過程中。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與分組

健康雄性C57BL/6同源野生型小鼠24只，TRPV1-/-基因敲除小鼠24只，體質(zhì)量20～25 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供[清潔級，許可證號：SCXK-（軍）2012-004]。在中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所動物房（SPF級）分籠喂養(yǎng)，自然照明，自由攝食、飲水。將24只C57BL/6同源野生型小鼠隨機分成3組，每組8只，分別為空白組、針刺組、熱灸組;24只TRPV1-/-基因敲除小鼠同樣隨機分成3組，每組8只，分別為空白組、針刺組、熱灸組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2? 主要試劑及儀器

0.9%氯化鈉注射液、10%水合氯醛、4%多聚甲醛（北京華興科諾生物技術(shù)有限公司，批號：H14020310;302-17-0;30525-89-4）;Tris、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅（美國Sigma，批號：77-86-1;122775-19-3;56-40-6;110-26-9/3761-53-3）;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG（美國Proteintech，批號：18166590）;蛋白酶抑制劑（德國Merck，批號：G106673）;蛋白磷酸酶抑制劑（瑞士Roche，批號：G101932-71-2）;顯影液（中國WellBiology，批號：BTH2601）;GHSR-1α（英國艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：ab188986）。

電子天平（sartorius公司，型號：MSA36S）;小動物電子秤（上海佑科儀表有限公司，型號：YP10002）;生理溫度刺激儀（上海艾睿生物科技有限公司，型號：BME410C）;小動物專用吸入麻醉機（美國MATRX公司，型號：VMR）;LABOFUGE400R Thermo離心機（美國賽默飛世爾公司，型號：ST8）;酶標分析儀（芬蘭LabsystemsMultiskan MS，型號：MS-352）;臺式高速冷凍離心機（湘儀，型號：H1650R）;全自動酶標洗板機（匯松，型號：PW-812）;恒溫培養(yǎng)箱（光明，型號：DHP-500）;搖床（中國江蘇其林貝爾公司，型號：TS-92）;電泳儀（美國Bio-rad，型號：164-5050）;轉(zhuǎn)膜儀（中國北京六一儀器廠，型號：DYCZ-40A）;旋渦混合器（中國江蘇其林貝爾公司，型號：QL-901）;針灸針（蘇州針灸用品有限公司，型號：0.18 mm×13 mm）。

1.3? 干預(yù)方法

1.3.1? 腧穴選擇與定位及操作? 足三里穴參照李忠仁主編的《實驗針灸學(xué)》及擬人比照法[13]選取。足三里穴在大鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)、腓骨小頭下緣5 mm處脛腓骨間隙中，左右兩側(cè)各一。

1.3.2? 針刺方法? 用吸入性氣體（異氟烷）對各組小鼠進行麻醉后，剔除穴區(qū)局部皮膚的毛，確定小鼠穴位定位后，用75%的酒精消毒，選20號半寸毫針，直刺進針1 mm，行提插，持續(xù)5 min（針刺操作均由同一人完成）。

1.3.3? 熱灸方法? 用吸入性氣體麻醉（異氟烷）對小鼠進行麻醉后，剔除穴區(qū)局部皮膚的毛后，用75%的酒精對穴區(qū)進行消毒。采用生理溫度刺激儀進行穴位熱灸刺激，將溫度探頭直接放置在相應(yīng)穴位皮膚之上，強度設(shè)置為43.5 ℃，每次熱灸持續(xù)30 min。

1.4? 實驗步驟

24只雄性C57BL/6同源野生型小鼠和24只雄性TRPV1-/-基因敲除小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分別隨機分成空白組、針刺組、熱灸組，正常喂食?？瞻捉M不予以處理;針刺組給予手針干預(yù);熱灸組給予熱灸干預(yù)。實驗期間所有實驗小鼠給予異氟烷吸入性麻醉，干預(yù)完成后予以1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，取血及大腦前額葉皮質(zhì)。觀察血漿中g(shù)hrelin表達水平及其受體GHSR-1α在前額葉皮質(zhì)中的表達變化。

1.5? ELISA法檢測小鼠血漿中g(shù)hrelin表達水平

將各種試劑移至室溫（18～25 ℃）平衡至少30 min，按前述方法配置試劑，備用。加樣，分別設(shè)標準孔和待測樣本孔，每孔分別加標準品或待測樣本50 μL，立即加入辣根過氧化物酶標記物工作液50 μL（空白孔不加）輕輕晃動混勻，覆上板貼，置37 ℃溫育40 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色20 min。依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)，用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.6? Western blot法檢測大腦前額葉皮質(zhì)中TRPV1和GHSR-1α含量表達

剪取0.25 g組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入200 μL RIPA裂解液于勻漿器中反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊;冰上裂解10 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清移至EP管中。采用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。將TEMED加入配好的分離膠中混勻后開始灌膠，等分離膠凝結(jié)后再灌入含有TEMED的濃縮膠，插入梳子，等凝膠后取出梳子，將準備好樣品移液至空槽中，第一孔上maker，其他孔上已變性蛋白樣品，開始電泳，約2 h。再次，切膠TRPV1（95 kDa）、GRSH-1α（40 kDa），并準備1張與膠同樣大小的濾紙和1張NC膜，然后與濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，至完全浸透。蓋上儀器，接通電源，轉(zhuǎn)300 mA，GRSH-1α轉(zhuǎn)膜完畢后，用1×TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫封閉1.5 h。用1×TBST將一抗按照一定比例稀釋（TRPV1 1∶500，GRSH-1α 1∶1 000），膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。將稀釋后的二抗與膜共同孵育90 min，兔抗（R）稀釋比例1∶6 000，鼠抗（M）稀釋比例1∶5 000，孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。最后ECL顯色曝光。

1.7? 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以“x±s”表示，先進行正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗：滿足正態(tài)性，使用單因素方差分析進行組間比較，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett T3法;若正態(tài)性不滿足，則選擇秩和檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? C57BL/6小鼠針刺與熱灸前后前額葉皮層TRPV1表達變化

與C57BL/6空白組相比，C57BL/6小鼠針刺組與熱灸組前額葉皮質(zhì)TRPV1表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但針刺組和熱灸組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.2? C57BL/6和TRPV1-/-小鼠針刺與熱灸前后血漿ghrelin水平變化

與C57BL/6空白組相比，C57BL/6針刺組與熱灸組血漿ghrelin水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但針刺組和熱灸組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與TRPV1-/-空白組對比，TRPV1-/-針刺組和熱灸組血漿ghrelin水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;針刺組和熱灸組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.3? C57BL/6和TRPV1-/-小鼠針刺與熱灸前后前額葉皮層GHSR-1α表達變化

與C57BL/6空白組相比，C57BL/6針刺組與熱灸組前額葉皮質(zhì)GHSR-1α表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但針刺組和熱灸組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與TRPV1-/-空白組對比，TRPV1-/-針刺組和熱灸組前額葉皮質(zhì)GHSR-1α表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

足三里穴具有調(diào)理中焦胃腸氣血之功效，是針灸防治胃腸疾病的首選腧穴。針灸足三里穴可使中焦氣血充足、胃腸腐熟水谷和傳化糟粕的功能穩(wěn)定?！鹅`樞·五邪第二十》中有記載：“邪在脾胃……陽氣有余，陰氣不足，則熱中善肌;陽氣不足，陰氣有余，則腸中寒鳴腹痛;陰陽俱有余，若俱不足，則有寒有熱，皆調(diào)于三里?！薄锻馀_秘要·水病雜療方》言：“又水腹脹皮腫法，灸三里?！薄断胭x·璇璣三里消食方》曰：“胃中有積刺璇璣，三里功多人不知?！蓖ㄟ^挖掘文獻發(fā)現(xiàn)，針灸足三里可調(diào)治胃腸諸證，且具有其他穴位不可替代的優(yōu)勢[14-16]。

近年來，無論是臨床還是基礎(chǔ)研究[17-19]均表明，針灸治療胃腸疾病效果顯著，其作用機制主要是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)和靶器官交互響應(yīng)，激活腦腸軸實現(xiàn)腦腸互通，增強胃腸動力、調(diào)節(jié)胃酸分泌、促進胃腸激素釋放、介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)、改善機體代謝、協(xié)調(diào)腸道菌群來保持胃腸屏障完整而到達到防治作用。連林雨等[20]研究發(fā)現(xiàn)，電針可加速應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷修復(fù)過程，而這可能與胃黏膜損傷大鼠ghrelin含量的改變密切相關(guān)。李琳慧等[21]實驗證實，熱敏灸可調(diào)節(jié)下丘腦和海馬組織中g(shù)hrelin和GHSR-1α蛋白表達，來改善慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜損傷。所以說針灸足三里對胃腸疾病的防治作用，主要是影響了胃腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中g(shù)hrelin及其受體分泌，互通腦腸信號，繼而發(fā)揮整體調(diào)節(jié)胃腸運動和保護胃黏膜屏障完整的作用。

Ghrelin主要是由胃底黏膜的X/A樣細胞分泌，最早在胃腸道中被發(fā)現(xiàn)，隨后在胰腺、甲狀腺、肝臟等器官和大腦皮質(zhì)、下丘腦、腦干等腦組織中被提取[22-23]。Ghrelin是一種多功能腦腸肽激素，并具有多種生物學(xué)活性，而對胃腸疾病影響的研究最為廣泛[24]。通過多方位實驗探索發(fā)現(xiàn)，ghrelin在胃腸疾病的防治中主要是通過改善胃腸動力、調(diào)節(jié)胃腸激素分泌、加速胃黏膜損傷修復(fù)等方面實現(xiàn)對胃腸疾病的防治作用[25-26]。而其生物學(xué)效應(yīng)得以充分發(fā)揮與其受體GHSR-1α密不可分。GHSR-1α是G蛋白偶聯(lián)受體，在中樞與外周組織器官中均有分布[27]。Ghrelin先由胃底黏膜細胞分泌，一部分在外周與受體結(jié)合，發(fā)揮作用;另一部分通過血液循環(huán)，穿透血腦屏障，在高位中樞系統(tǒng)中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，讓外周與中樞同時響應(yīng)，是實現(xiàn)腦腸互通的重要途徑[28]。針灸可通過對穴位的干預(yù)而激活外周和中樞通路共同參與胃腸功能的調(diào)控，劉未艾[29]、吳穎琪[30]、唐雷[31]等均通過實驗發(fā)現(xiàn)，這與調(diào)節(jié)ghrelin分泌而影響其受體蛋白表達相關(guān)。本實驗通過對比針刺與熱灸足三里穴區(qū)小鼠血漿ghrelin和前額葉皮質(zhì)GHSR-1α含量表達，發(fā)現(xiàn)針刺和熱灸均可降低小鼠ghrelin及其受體蛋白含量，證實針刺、熱灸對胃腸功能的調(diào)整均與ghrelin-GHSR-1α這一途徑關(guān)系密切。

TRPV1又稱瞬時受體電位香草酸亞型1，屬于離子通道TRP家族成員，分布于外周和中樞感覺神經(jīng)纖維中，具有感知機械、物理和化學(xué)等刺激的特點，它是神經(jīng)系統(tǒng)中具有整合多種傷害性刺激的感受器，可介導(dǎo)多種疼痛，如炎性痛、熱痛和慢性疼痛等[32-33]。參與機體炎癥和免疫反應(yīng)的過程，TRPV1與胃腸疾病的發(fā)生、發(fā)展和調(diào)節(jié)作用關(guān)系密切[34]。TRPV1異常分泌和表達可導(dǎo)致胃潰瘍、腸易激綜合征和胃腸道癌等胃腸道疾病發(fā)生。劉瓊[35]、張曉卓[36]、李凱歌[37]等通過實驗發(fā)現(xiàn)，針灸可改善TRPV1異常表達，從胃黏膜修復(fù)、胃酸分泌調(diào)節(jié)、促胃腸動力等方面參與胃腸疾病的防治過程。本研究發(fā)現(xiàn)針刺、熱灸可促使小鼠前額葉皮質(zhì)中TRPV1的釋放，而TRPV1基因被敲除后，針刺、熱灸后小鼠血漿ghrelin及前額葉皮質(zhì)GHSR-1α的含量表達均無明顯改變。所以說TRPV1表達的改變可對胃腸功能調(diào)控通路ghrelin-GHSR-1α這一途徑產(chǎn)生影響。

本研究通過實驗驗證了針刺、熱灸均可影響TRPV1和ghrelin及其受體的表達，且ghrelin-GHSR-1α途徑的激活與TRPV1釋放與否關(guān)系密切。但針灸對胃腸疾病防治的作用機制復(fù)雜，而本實驗僅觀察小鼠在生理狀態(tài)下針刺、熱灸作用機制的差異，存在一定局限性，故針刺、熱灸對胃腸疾病模型小鼠作用機制的差異性有待進一步研究。

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